舊PFGE脈沖場電泳技術(shù)培訓(xùn)CHEF故障排除PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1舊舊PFGE脈沖場電泳技術(shù)培訓(xùn)脈沖場電泳技術(shù)培訓(xùn)CHEF故障故障排除排除第1頁/共38頁排除 PFGE 凝膠 故障 比較復(fù)雜，涉及到多種因素 : 實(shí)驗(yàn)室各自的技巧和技能 實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和設(shè)備條件 試劑 水質(zhì) 實(shí)驗(yàn)過程中意外的干擾和分心（一）（一） PFGE技技術(shù)術(shù)故障排除的一般考故障排除的一般考慮慮因素因素第2頁/共38頁通通過過改正一些不好的改正一些不好的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作操作 （ （習(xí)慣習(xí)慣） ） 能能夠夠幫助解決部分幫助解決部分 PFGE 結(jié)結(jié)果不佳的困惑果不佳的困惑 精準(zhǔn)地 稱量和 定容（積） 計(jì)算精確 確認(rèn)所有儀器設(shè)備處于良好的工作狀態(tài) 檢查試劑化學(xué)品不得有沉淀、變色、絮狀、過期 采用

2、正牌廠家的試劑耗材 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中戴手套 確認(rèn)玻璃器皿干凈， 不得有清潔劑、臟物碎片等殘留，因?yàn)檫@些因素可能會(huì)影響凝膠小塊的制備、裂解，從而導(dǎo)致結(jié)果背景上出現(xiàn) 斑點(diǎn)，臟點(diǎn) 千萬不要使用千萬不要使用質(zhì)質(zhì)量差的塑料容器，量差的塑料容器， 除非你確保它能被洗干除非你確保它能被洗干凈凈 千萬不要千萬不要過過分加分加熱瓊熱瓊脂糖溶液脂糖溶液 配置酶混合液時(shí)要混合充分 處理每種微生物實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用合適的試劑、內(nèi)切酶和電泳參數(shù)條件（一）（一） PFGE技技術(shù)術(shù)故障排除的一般考故障排除的一般考慮慮因素因素第3頁/共38頁想一想，對(duì)照上次成功的實(shí)驗(yàn)，有哪些因素變化了？過程方面：儀器設(shè)備試劑耗材人力因素考慮操作規(guī)程

3、中的所有步驟，自檢式提問是否故障源自于其中某一個(gè)環(huán)節(jié)？考慮和觀察凝膠的每片區(qū)域，試圖識(shí)別其中某個(gè)區(qū)域可能同失敗的原因有關(guān)聯(lián)要做到這些， 操作者必須對(duì)每一步驟的的目的很熟悉，以及對(duì)每一步錯(cuò)誤的操作可能帶來的潛在后果明晰（一）（一） PFGE技技術(shù)術(shù)故障排除的一般考故障排除的一般考慮慮因素因素第4頁/共38頁Smeary bands affecting samples alone or samples & standard第5頁/共38頁nn降低制作小膠塊的瓊脂糖濃降低制作小膠塊的瓊脂糖濃度度n酶處理時(shí)間酶處理時(shí)間適當(dāng)適當(dāng)延長延長n采用新鮮酶試劑采用新鮮酶試劑n增加酶的濃度增加酶的濃度第6

4、頁/共38頁第7頁/共38頁第8頁/共38頁微微歪曲的條微微歪曲的條帶帶- 電電極方面的極方面的問題問題第9頁/共38頁歪曲的條歪曲的條帶帶- 加加樣樣方面的方面的問題問題第10頁/共38頁歪曲的條歪曲的條帶帶- 汽泡的原因汽泡的原因 ?第11頁/共38頁（四）四） 樣樣品沒有往下品沒有往下第12頁/共38頁（四）（四） 樣品樣品第13頁/共38頁（四）（四） 樣品樣品第14頁/共38頁第15頁/共38頁（四）（四） 樣品樣品第16頁/共38頁Top of gel (wells)Bottom of gelLadders（四）（四）樣品樣品第17頁/共38頁（四）（四）樣品樣品第18頁/共38頁

5、（四）四）樣品遷樣品遷原因： 凝膠外圍人為地加了阻礙物體， 造成緩沖液循環(huán)不暢、波動(dòng)，繼而電場方向受影響第19頁/共38頁（四）（四）樣品樣品第20頁/共38頁( (五五) ) 蛋白蛋白第21頁/共38頁Same plugs washed 6X with TESmearing and incomplete restriction resulting from insufficient washing, 1st figure shows plugs washed 4 times with TE, 2nd shows plugs washed 6 times with TE.Plugs washe

6、d 4X with TE第22頁/共38頁問題問題: 不完全酶切反應(yīng)會(huì)造成條帶“重影”或稱 “鬼影” ，可能的原因可能的原因:小膠塊質(zhì)量差 proteinase K 沒有清洗去除干凈DNA 濃度過高內(nèi)切酶濃度內(nèi)切酶商品/ 酶切緩沖液 批次質(zhì)量問題 內(nèi)切酶商品/ 酶切緩沖液 過期酶切孵育時(shí)間或溫度條件錯(cuò)誤（六）（六） 限制性核酸內(nèi)切酶步驟限制性核酸內(nèi)切酶步驟 問題問題 Troubleshooting - Restriction Steps10 Units20 Units40 UnitsIncomplete digestion due to low enzyme concentration res

7、ults in ghost bands. By increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achieved. Ghost bands第23頁/共38頁10 Units20 Units40 UnitsIncomplete digestion due to low enzyme concentration results in ghost bands. By increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achieved

8、. Ghost bands建建議議: 多用 TE 洗 2 次 小膠塊 確保體系中加入足夠的酶- 增加酶單位 確認(rèn) DNA 濃度沒有過高，從第一步減少菌體液開始，或者切小點(diǎn)、薄點(diǎn)的小膠塊（六）（六） 限制性核酸內(nèi)切酶步驟限制性核酸內(nèi)切酶步驟 問題問題 Troubleshooting - Restriction StepsComplete Digestion 建建議議: (continued): 配置酶切預(yù)混液的內(nèi)切酶和緩沖液必須高質(zhì)量-注意保存條件，不能使用過期的第24頁/共38頁酶孵育時(shí)間過長 (過夜），就出現(xiàn)了 “星暈狀-Star Activity ）現(xiàn)象；同樣的酶 （Ascl)反應(yīng)2小時(shí)，

9、則沒有* Barany, F. (1988) Gene 68, 149AscIApaIAscIApaISame plugs re-testedovernight incubation2 hour incubation（六）（六） 限制性核酸內(nèi)切酶步驟限制性核酸內(nèi)切酶步驟 問題問題 Troubleshooting - Restriction Steps第25頁/共38頁E. coli O26, BlnI其它酶切問題其它酶切問題: 有些菌株有些菌株DNA 無法被酶切，無法被酶切， 是因?yàn)樗鼪]有是因?yàn)樗鼪]有特異性酶識(shí)別位點(diǎn)或無法接觸特異性位點(diǎn)沒特異性酶識(shí)別位點(diǎn)或無法接觸特異性位點(diǎn)沒接觸接觸。 這種現(xiàn)

10、象往往是看到在凝膠上端（靠近梳孔） 聚集著DNA 樣品，而泳道中既無條帶，也沒拖尾建議建議: 用同樣的酶消化另一膠塊，確認(rèn)并不是先前用同樣的酶消化另一膠塊，確認(rèn)并不是先前的那塊有問題，（如先前實(shí)驗(yàn)時(shí)忘記加入酶的那塊有問題，（如先前實(shí)驗(yàn)時(shí)忘記加入酶， 或沒有接觸到酶反應(yīng)液或沒有接觸到酶反應(yīng)液 如果仍然看到如此現(xiàn)象時(shí)，可以幫助確定該酶與菌株的適用性問題For E.coli O26 single band was confirmed to be a valid pattern（六）（六） 限制性核酸內(nèi)切酶步驟限制性核酸內(nèi)切酶步驟 問題問題 Troubleshooting - Restriction

11、Steps第26頁/共38頁SfiINotILanes 2 4, 6 and 7 are smears caused by expired enzyme that did not cut DNA. The same plugs cut with NotI enzyme yielded distinct bands, indicating that the plugs were fine and smears were due to using expired enzyme.S = standard提示提示: 如何判斷不完全酶切是由于酶或如何判斷不完全酶切是由于酶或buffer 質(zhì)量造成的質(zhì)量造

12、成的 ？ 采用另一種酶采用另一種酶 （以前實(shí)驗(yàn)成功驗(yàn)證過）或同樣（以前實(shí)驗(yàn)成功驗(yàn)證過）或同樣品種但不同批次的酶品種但不同批次的酶 ， 對(duì)同批樣品進(jìn)行酶切對(duì)同批樣品進(jìn)行酶切測試測試 加入 牛血清白蛋白 (BSA) ，即使該酶的供應(yīng)沒有提及。因?yàn)樵诿盖羞^程中既能夠幫助酶保持穩(wěn)定，又能夠減少由于抑制劑存在造成酶失活和防止酶粘附在管壁上的活性（六）（六）限制性限制性核酸內(nèi)切酶步驟核酸內(nèi)切酶步驟 問題問題 Troubleshooting - Restriction Steps第27頁/共38頁Without thioureaWith thiourea（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟

13、問題問題依賴于硫尿處理依賴于硫尿處理 或或 無法分型的菌株無法分型的菌株Tris-緩沖液在電泳過程中產(chǎn)生的緩沖液在電泳過程中產(chǎn)生的一些氧化物質(zhì)，某些菌體本身在酸性緩沖液中容易降解，硫尿作為一種還原劑能中和氧化物質(zhì)，改善硫尿作為一種還原劑能中和氧化物質(zhì)，改善條帶分型或一片模糊拖尾現(xiàn)象條帶分型或一片模糊拖尾現(xiàn)象用于對(duì)某些難以進(jìn)行條帶分型的菌株適用。用于對(duì)某些難以進(jìn)行條帶分型的菌株適用。The same plugs were used in both gels. Lanes 3, 4, 6, 7, 8 and 9 are thiourea-dependent. 第28頁/共38頁建議建議: 在凝膠中

14、加上陽性對(duì)照在凝膠中加上陽性對(duì)照 用曾經(jīng)驗(yàn)證過的， 依賴于硫尿幫助分型的菌株 DNA 樣品 小膠塊. 用了這個(gè)陽性對(duì)照后， 證明 無法分型的原因同其它，如制膠塊，試劑等無關(guān)。只是系統(tǒng)中需要硫尿 如果DNA質(zhì)量不好, DNA 將滯留在孔內(nèi)，即使加入硫尿也無濟(jì)于事. 加入 50M thiourea (i.e. 10mg/ml 母液取873ml) 直接加入到 (0.5X TBE)， 然后電泳. 只在少部分菌株分型中需要，并非常用 Use only when needed (with known strains or suspected serotypes) and not routinely.小心小

15、心: 硫尿是變性劑， 使用和丟棄時(shí) 格外小心，須按照有毒有害廢品管理規(guī)范處理（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟（六）限制性核酸內(nèi)切酶步驟 問題問題依賴于硫尿處理依賴于硫尿處理 或或 無法分型的菌株無法分型的菌株第29頁/共38頁Old culture48 hrs Fresh culture18 hrsPFGE gel from fresh culture shows no smearing and all bands are distinct. Lysed cells are present in 48 hour old cultures (same organism), characterized

16、by smears on the PFGE gel (blue arrow). Potential problems: Undue stress to bacterial cells prior to casting the plug can cause cell lysis, leading to DNA degradation and is characterized by “smearing” on the gel. Recommendations:Grow cultures on non-selective mediaUse fresh cultures grown for 14 18

17、 hours at appropriate temperature and conditionsDo not let cultures sit at room temp for more than an hour before making cell suspensionsDo not store cultures at 4C before making cell suspensionsDo not use cultures grown for more than 18 hours (contain lysed cells)Do NOT centrifuge or vortex cell su

18、spensionsDo NOT leave bacterial cell suspensions at room temp for extended periods of time prior to casting plugs（七）（七） 起始的菌體懸液質(zhì)量起始的菌體懸液質(zhì)量 Preparing cell suspension第30頁/共38頁1%1.4%1.2%1.6%1.8%SSSWhen agarose is reheated, water evaporates and the agarose concentration increases, resulting in plugs tha

19、t do not have the expected agarose percentage. Reheating the agarose 6 times increased the concentration from 1% to 2%.S = standard Potential problems:Agarose that is too hot may damage the cellsAgarose thickens and solidifies as it cools, making pipetting difficult and leading to an uneven distribution of cells within plugsRecommendations:Equilibrate melted agarose to 50 54C and keep warm while castin