高效液相色譜儀HPLC校正方法

1、高效液相色譜儀( HPLC )校正方法0.1輸液系統(tǒng)：0.1.1梯度誤差G不超過土 3%0.1.2泵流量設(shè)定值誤差 Ssv± 2%0.1.3流量穩(wěn)定性誤差 S r<± 2%0.2紫外檢測(cè)器性能0.2.1基線噪聲不超過5X10-4AU,基線漂移不超過 5X10-3AU0.2.2定量測(cè)量重復(fù)性誤差(6次進(jìn)樣)RSDE1.5%0.2.3最小檢測(cè)濃度不超過1X 10-7 g/ml萘/甲醇溶液0.2.4可調(diào)波長紫外可見光檢測(cè)器波長示值不超過± 2nm(HP1100 高效液相色譜儀可由儀器自身完成 )1 校正條件1.1環(huán)境溫度10-30'C，相對(duì)濕度低于 65%

2、1.2校正設(shè)備1.2.1秒表 分度值小于 0.1 s1.2.2分析天平 最大稱量 200g, 最小分度值 0.1mg1.2.3容量瓶1.2.4微量注射器1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑1.3.1HPLC用甲醇、純水，分析純的丙酮1.3.21X10-4g/ml， 1X10-7g/ml 的萘甲醇溶液1.3.3紫外波長標(biāo)準(zhǔn)溶液2 校正方法2.1梯度誤差G的校正2.1.1進(jìn)行梯度洗脫程序，A溶劑為水，B溶劑為0.1%丙酮的水溶液，B經(jīng)5個(gè)階段從0變到100%20%40%60%80%100%，重復(fù)測(cè)量?jī)纱?，取平均值，求各段梯度誤差Gci ，取最大作為儀器梯度誤差，公式：Gci= ( Li Lm) /Lmx 100%

3、Li ：第 i 段信號(hào)值的平均值； Lm ：各段輸出信號(hào)平均值的平均值可接受標(biāo)準(zhǔn)：-3%cGci<3%2.2泵流量設(shè)定值誤差 SS、流量穩(wěn)定性誤差 Sr的校正2.2.1 將儀器的輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣器、色譜柱和檢測(cè)器聯(lián)接好，以甲醇為流動(dòng)相，按表一設(shè)定流量，待流速穩(wěn)定后， 在流動(dòng)相排出口用事先清洗稱重過的容量瓶收集流動(dòng)相， 同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)， 準(zhǔn)確的收集 10-25分鐘，稱重，按下式計(jì)算流動(dòng)相流量設(shè)定值誤差Ss和流動(dòng)相流量穩(wěn)定性誤差Sr。公式：Ss=（ Fm-Fs） /Fs100%可接受標(biāo)準(zhǔn)：-2%cSs<2%Sr= （Fmax-Fmin） /F x 100%可接受標(biāo)準(zhǔn)：-2%cSrW2%S

4、s：流量設(shè)定值誤差（% ； Fm= （VW- Wi） / p t.t :流量實(shí)測(cè)值（ml/min ）W：容量瓶+流動(dòng)相的重量（g）; Wi：容量瓶的重量（g）； Fs ：流量設(shè)定值（ml/min ）；p t :實(shí)驗(yàn)室溫度下流動(dòng)相的密度（g/cm3）； t :收集流動(dòng)相的時(shí)間（min）;Sr ：流量穩(wěn)定性誤差（% ; Fmax為同一組測(cè)量中流量最大值（ ml/min ）;Fmin:同一組測(cè)量中流量最小值（ ml/min ） ； F為同一組測(cè)量值的算術(shù)平均值（ml/min ）表一 :Ss和Sr的校正流量設(shè)定值（ml/min ）1.01.5測(cè)量次數(shù)33收集流動(dòng)相時(shí)間（min）1510允許誤差Ss2

5、%2%Sr2 %2%2.3 基線噪聲和漂移2.3.1 選用C18的色譜柱，以波長254nm,流動(dòng)相為100%甲醇，流速1.0ml/min ,儀器穩(wěn)定后記錄基線 30min，求基線噪聲 Nd?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：Ndw5X10-4AU2.3.2 基線漂移用1h內(nèi)基線偏離原點(diǎn)的值（AU/h）表示?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)： *5X10 -3AU/h2.4 最小檢測(cè)濃度2.4.1 以上述色譜條件下，進(jìn)樣20ul的1X10-7g/ml的萘甲醇溶液，計(jì)算最小檢測(cè)濃度 CL。公式:Cl=2 Nd CX20HVNd:基線噪聲，mm C:標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，g/ml ;H：標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的峰高，mm V進(jìn)樣體積，ul。2.4.2 可接受

6、標(biāo)準(zhǔn)：CL< 1X10 -7 g/ml2.5 定量測(cè)定重復(fù)性的校正將儀器聯(lián)接好，使之處于正常工作狀態(tài)，波長254nm,流動(dòng)相為100%甲醇，流速1.0ml/min,用萘的甲醇溶液連續(xù)進(jìn)樣6次記錄下峰面積，按下式計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：nRSD = E（ Xi- X ） 2/ （n-1 ）x （1/ X ） X100%I=1RSD相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（% ; n :測(cè)量次數(shù)；Xi :第I次測(cè)量的峰面積X - n次進(jìn)樣的峰面積算術(shù)平均值可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSDS1.5%2.6 波長示值誤差2.6.1 用注射器將紫外波長標(biāo)準(zhǔn)溶液（標(biāo)準(zhǔn)波長為 235nm, 257nm, 313nm和350nm）從檢測(cè)器入口注入樣品

7、池沖洗，并將池充滿，將波長調(diào)到低于標(biāo)準(zhǔn)波長5nm處，到標(biāo)準(zhǔn)波長+4n m處，測(cè)得的最大吸收值處對(duì)應(yīng)的波長與標(biāo)準(zhǔn)波長之差為波長示值誤差；目前儀器可以在1ml/min 的流量下,直接用空管連接檢測(cè)器，每隔2min改變Inn,連續(xù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)樣10ul，同樣可得波長示值誤差。2.6.2 可調(diào)波長紫外可見光檢測(cè)器波長示值誤差（此項(xiàng)只適用于HP1100高效液相色譜儀且?guī)в?HP工作站 ） 。2.6.3 打開HP1100液相色譜儀和hp工作站，打開輸液泵和檢測(cè)器，用純水沖洗系統(tǒng)直至穩(wěn)定，進(jìn)入Diagnosis 窗口，點(diǎn)擊氘燈圖標(biāo)，進(jìn)入 show module tests 狀態(tài)，點(diǎn)擊 VWD VL calibra

8、tion test 點(diǎn)擊 start ，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)入校正狀態(tài)，待校正完畢，將校正結(jié)果打印歸檔。2.6.4 可接受標(biāo)準(zhǔn)：入<2nm3 性能確認(rèn)3.1 使用標(biāo)準(zhǔn)品或供試品，確認(rèn)儀器性能符合使用要求；3.2 先進(jìn)行色譜柱的性能確認(rèn)，內(nèi)容包括：分離度，對(duì)稱因子，理論塔板數(shù)和峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差。3.3 液相色譜柱的確認(rèn)3.3.1 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)樣配制：稱量1000mg苯酚，100mg聯(lián)苯加入到100ml容量瓶中，移入鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯各1ml，然后用甲醇定容到100ml，混勻，從中移取1ml該溶液，用乙腈：水=70：30 定容至 100ml。3.3.2 方法：流動(dòng)相為乙腈：水 =70： 30，流速為1.0ml/min,波長為254nm,溫度為30C，進(jìn)樣量為： 10ul, 運(yùn)行 10min。3.3.3 色譜柱： Extend-C18 Analytical, 5um,4.6*250mm。3.3.4 連續(xù)進(jìn)行5次分析，分離度均 R> 1.5 ;鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)稱因子 S在0.801.50范圍內(nèi)；鄰苯二甲酸二乙酯柱效 3000m-1;鄰苯二甲酸二乙酯峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)w1.5%。3.4 按照性能確認(rèn)方法逐步進(jìn)行，并記