【動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文】豬組織中新霉素殘留的微生物檢測(cè)方法探究

1、畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文) 題 目 名 稱： 豬組織中新霉素殘留的微生物檢測(cè)方法探究 題 目 類 別： 畢業(yè)論文 學(xué) 院 （系）： 專 業(yè) 班 級(jí)： 學(xué) 生 姓 名： 指 導(dǎo) 教 師： 日 期： 至 目錄任務(wù)書開題報(bào)告指導(dǎo)老師審查意見評(píng)閱老師記錄答辯會(huì)議記錄中文摘要英文摘要1 前言11.1 抗生素殘留的危害11.2 新霉素的應(yīng)用2 1.3 新霉素在動(dòng)物機(jī)體中的殘留21.4 新霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)31.5 新霉素等首要?dú)埩舻脑?1.6 新霉素在動(dòng)物性組織中的殘留的檢測(cè)方法51.7 研究的目的62 材料與方法62.1 材料72.2 方法83 結(jié)果114 討論與分析164.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線164.2 回收率

2、試驗(yàn)164.3 菌懸液174.4 蛋白質(zhì)變性方法的選擇175 小結(jié)18參考文獻(xiàn)19致謝21外文參考資料原文 viii外文參考資料譯文 ix豬組織中新霉素殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法的研究學(xué) 生： 鄧 艷 長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院指導(dǎo)老師： 趙紅梅 長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院摘要 目的 新霉素是由鏈霉菌屬弗氏鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，目前，它作為一種常用獸藥和具有發(fā)展前途的飼料添加劑在畜牧業(yè)中廣為使用。為了控制新霉素在動(dòng)物性食品中的殘留，保障食品衛(wèi)生和公共健康，本次試驗(yàn)對(duì)豬肌肉和腎臟組織中新霉素殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法做了研究。方法 本試驗(yàn)用測(cè)試菌為表皮葡萄球菌的微生物學(xué)瓊脂擴(kuò)散法，測(cè)定豬肌肉組

3、織和腎臟組織提取液中的新霉素的含量。結(jié)論 本方法靈敏度和回收率高，本方法的靈敏度為0.150.2ug/ml,檢測(cè)限為0.50.75ug/g組織，回收率為，回收率比fda的傳統(tǒng)方法有顯著的提高，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0152.4ug/ml范圍具有良好的線性范圍。且其操作簡便，不需要特殊設(shè)備，樣品用量少，易于推廣，適用于新霉素的定量分析.關(guān)鍵詞 新霉素 ; 殘留檢驗(yàn) ; 微生物學(xué) ;瓊脂擴(kuò)散法 determination of neomycin residues in pig tissues by microbiolmgical methodstudent: deng yan animal science d

4、epartment tutor:zhao hongmei animal science departmentabstract neomycin is classified as a broad-spectrum antibiotic that is used for preventing diseases and increasing the efficiency of feed utilization in veterinary medicine.in order to control neomycin residues in food derived from animals and en

5、sure public health,we have studied on determination of neomycin in pig tissues (muscle and kindey).we take staphylococcus epidermidis as the test microorganism.the sentitivety of the method was 0.15-0.2ug/ml,the limits of detecationfor neomycin in tissue were0.5-0.72ug/g, and the calibration curve w

6、as liner within the range of 0.152.4ug/ml.the method is accurate,precise,simple and useful for the deternation of neomycin residue in the pig tiusse .key word neomycin;microbiological method;residues;ager diffusion method1前 言1.1抗生素殘留的危害伴隨著新霉素等抗生素在獸醫(yī)防治,特別是在飼料添加劑方面的廣泛使用,動(dòng)物性食品中藥物殘留及其耐藥性問題倍受關(guān)注.動(dòng)物性食品安全問題

7、已經(jīng)引起全世界范圍的廣泛關(guān)注.1.1.1 細(xì)菌耐藥性的增加抗生素的濫用可能產(chǎn)生耐藥性,從細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性方面來說, 耐藥菌和飼料中添加抗菌藥物，實(shí)際上等于持續(xù)低劑量用藥。這樣會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物性食品中的藥物殘留量雖然很低,但是如果人長期食用這種低殘留抗生素的食品,就能抑制后殺滅各種體內(nèi)敏感菌,由于藥物對(duì)細(xì)菌的選擇壓力,導(dǎo)致體內(nèi)耐藥菌不斷增加,耐藥性不斷增強(qiáng).動(dòng)物機(jī)體長期與藥物接觸，造成耐藥菌不斷增多，耐藥性也不斷增強(qiáng)?？咕幬餁埩粲趧?dòng)物性食品中，同樣使人也長期與藥物接觸，導(dǎo)致人體內(nèi)耐藥菌的增加。如今，不管是在動(dòng)物體內(nèi)，還是在人體內(nèi)，細(xì)菌的耐藥性已經(jīng)達(dá)到了較嚴(yán)重的程度。1.1.2 正常菌群的破壞正常機(jī)體內(nèi)

8、寄生著大量菌群，如果長期與動(dòng)物性食品中低劑量的抗菌藥物殘留接觸，就會(huì)抑制或殺滅敏感菌，耐藥菌或條件性致病菌大量繁殖，微生物平衡遭到破壞。各種條件菌大量增殖,人體內(nèi)正常菌群被破壞, 使機(jī)體易發(fā)感染性疾病,因細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性而很難治愈.1.1.3 毒性作用(1)急性中毒:若一次攝入殘留物的量過大，會(huì)出現(xiàn)急性中毒反應(yīng). 當(dāng)然急性中毒的事件發(fā)生相對(duì)來說是很少的，一般動(dòng)物性食品中殘留的抗生素對(duì)人并不表現(xiàn)為急性毒性作用,藥物殘留的危害絕大多數(shù)是通過長期接觸或逐漸蓄積而造成的.(2)慢性作用:人們長期攝入低劑量的殘留抗生素的食品后,一定時(shí)間后則可能由于殘留抗生素在體內(nèi)的逐漸蓄積而導(dǎo)致慢性作用,主要表現(xiàn)為毒性作

9、用,細(xì)菌耐藥性,致畸,致突變,和致癌作用等.某些過敏體質(zhì)的人,接觸殘留的抗生素,也可能引起一系列的過敏反應(yīng)(變態(tài)反應(yīng)) .過敏反應(yīng)癥狀多種多樣，輕者表現(xiàn)為麻疹、發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫痛及蜂窩織炎等。嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)過敏性休克，甚至危及生命。當(dāng)這些抗菌藥物殘留于肉食品中進(jìn)入人體后，就使部分敏感人群致敏，產(chǎn)生抗體。當(dāng)這些被致敏的個(gè)體再接觸這些抗生素或用這些抗生素治療時(shí)，這些抗生素就會(huì)與抗體結(jié)合生成抗原抗體復(fù)合物，發(fā)生過敏反應(yīng)。因此,為保障食品衛(wèi)生和公共健康,建立一套經(jīng)濟(jì),簡單,靈敏度高,易推廣的最廣泛使用的抗生素-新霉素殘留檢測(cè)的方法已勢(shì)在必行.1.2 新霉素的應(yīng)用新霉素抗菌譜廣,歸革蘭氏陽性菌和結(jié)核桿菌均有良

10、好的抑制作用.新霉素因起其抗菌活力強(qiáng),作用范圍廣泛,用量少,價(jià)格低,口服安全性能高等優(yōu)點(diǎn),而作為一種常用獸藥及具有發(fā)展前景的飼料添加藥物在畜牧也生產(chǎn)中廣為使用.獸醫(yī)臨床上,新霉素主要用于治療畜禽細(xì)菌性腸炎;另外,新霉素還被普遍用于治療乳腺炎,角膜炎,結(jié)膜炎,耳言,皮言,外傷感染,足腐爛等疾病.在畜禽養(yǎng)殖上,可提高飼料利用律,促進(jìn)生長,但是其吸收毒性大,在動(dòng)物性食品中的殘留可對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生較大的潛在危害,對(duì)食品衛(wèi)生和公共健康產(chǎn)生了威脅.1.3 新霉素在動(dòng)物體中的殘留1.3.1 新霉素在動(dòng)物體中是藥代動(dòng)力學(xué)研究有關(guān)新霉素在動(dòng)物機(jī)體,尤其是在牛機(jī)體中的動(dòng)力學(xué)研究很多,但是結(jié)果不盡相同.有關(guān)新霉素藥代動(dòng)

11、力學(xué)的早期研究主要是采用微生物分析的方法,shaikh和pedersoli使用hplc法分析得到了較長的半衰期值,這說明動(dòng)力學(xué) 參數(shù)明顯受到分析法的影響.black等(1982年)對(duì)給牛肌肉注射新霉素后,新霉素在體內(nèi)的分布情況進(jìn)行了分析研究.black的實(shí)驗(yàn)提示新霉素在體內(nèi)的主要排泄途徑是通過腎臟而不是膽汁;另外,在腦組織中也未檢測(cè)出新霉素,說明此類化合物是很那通過血腦屏障的.目前,大量文獻(xiàn)已證實(shí)新霉素在體內(nèi)的主要排泄途徑是通過腎臟，腎是新霉素在動(dòng)物體內(nèi)的靶組織，并且新霉素與腎臟皮質(zhì)以較強(qiáng)的離子鍵結(jié)合，在腎臟中蓄積時(shí)間很長，通常需要2830天的休藥期，但很難通過血腦屏障。新霉素在體內(nèi)的代謝主要

12、是在消化道內(nèi)發(fā)生磷酸化、腺苷酸化或乙?；晃盏男旅顾亟^大部分以原形存在，故新霉素在體內(nèi)的殘留標(biāo)志物為新霉素母體化合物.1.3.2 新霉素在動(dòng)物體中消除規(guī)律的研究ronning和fagerberg在1994年向fda提交了有關(guān)新霉素在牛,羊,山羊和豬體內(nèi)消除規(guī)律的研究報(bào)告.用20頭動(dòng)物(雌雄各半)飲水給藥(劑量約為22mg硫酸新霉素kg體重),連續(xù)給藥14天;另外,2頭(雌雄各半)作為對(duì)照,分別在休藥期0,1,2,7小時(shí)和14天(牛和豬);1,3,7,14小時(shí)和14天(羊);12,24,48,72和96小時(shí)(山羊)屠宰后采樣,每次采樣4頭動(dòng)物(雌雄各半),未給藥的對(duì)照組的動(dòng)物在停藥當(dāng)天屠宰采

13、樣,采用微生物杯碟法進(jìn)行殘留分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)照組的每種動(dòng)物組織中均未檢測(cè)出新霉素的殘留;在給藥組動(dòng)物各種動(dòng)物中,除了腎組織以外,在肌肉組織以及脂肪組織中均為檢測(cè)出新霉素殘留.豬在休藥期0,1,和3天時(shí),腎組織中新霉素平均含量分別為2.174,1.920和0.958ug/g組織,休藥期14天時(shí)3頭豬的腎臟組織中未檢出新霉素.從ronning和fagerberg等人的實(shí)驗(yàn)中可以看出,不同的動(dòng)物中新霉素殘留的消除快,慢不同,但是消除的規(guī)律是一致的,在休藥期的各階段,在上述各動(dòng)物的肌肉,肝臟和脂肪中都未檢出新霉素;腎臟是新霉素的靶組織,連續(xù)給藥14天(22mg硫酸新霉素/kg體重)后,在休藥期1

14、4天個(gè)組織均未檢出新霉素的殘留.1.4 新霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)1.4.1 新霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)新霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是以堿性環(huán)己醇為糖苷元與氨基糖縮合而成的苷，其結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)陽離子位置，可與生物大分子以離子鍵結(jié)合，在測(cè)定可食用組織里新霉素殘留的提取程序中就要求充分打破新霉素與生物大分子間的鍵，新霉素結(jié)構(gòu)中沒有發(fā)色團(tuán)存在，故用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器進(jìn)行殘留分析之前需要將新霉素結(jié)構(gòu)中的6個(gè)伯胺基團(tuán)是衍生化試劑與之反應(yīng)的主要部位。、圖1 新霉素的分子式fig.1 molccuar formula structure of neomycin1.4.2 新霉素的理化性質(zhì)新霉素（neomycin）是有waks

15、man和lechevalieil1949年從鏈霉菌屬弗氏鏈霉菌(streptomyces fradiac)竟發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的一種氨基糖苷類抗生素，新霉素中含有新霉素a.b.c三種成分，主要為新霉素b.c兩種，新霉素a為其水解產(chǎn)物。新霉素是以2-去氧鏈霉胺(2-deoxy streptamine)為母體得到的衍生物。新霉素為堿性水溶性抗生素，穩(wěn)定性很強(qiáng)，對(duì)堿、酸，熱等的耐受性比其它抗生素強(qiáng)。新霉素在水中極易溶解，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中幾乎不溶。1.5 新霉素等獸藥殘留的原因 殘留的原因歸結(jié)起來既有質(zhì)量的問題,又有違規(guī)使用的問題.1.5.1 獸藥質(zhì)量現(xiàn)狀我國畜牧業(yè)的迅速發(fā)展,帶動(dòng)了獸藥業(yè)的大力發(fā)

16、展.近些年來獸藥質(zhì)量雖然有所提高,但仍不能使人滿意,產(chǎn)品合格率一直在6570左右徘徊,合格率未曾有過突破.農(nóng)業(yè)部2002年行文公布的不合格產(chǎn)品中,大多數(shù)是地方產(chǎn)品,而地方產(chǎn)品在獸藥市場(chǎng)中占有很大的份額.1.5.2 獸藥的違規(guī)使用美國在20世紀(jì)70年代對(duì)獸藥殘留進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)其原因有76是不遵守休藥期所致,飼料加工或運(yùn)輸過程中污染占12,儲(chǔ)藏不當(dāng)占6,其余6是藥品的使用不正確所致.從中可以看出不遵守休藥期占主要方面.目前,我國動(dòng)物產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)的主要原因是:非法使用禁用獸藥及其化合物;不遵守休藥期的規(guī)定;超劑量,超范圍用藥;違反有關(guān)標(biāo)簽的規(guī)定等.1.6 新霉素在動(dòng)物性組織中的殘留的檢測(cè)方法

17、有關(guān)新霉素含量測(cè)定的化學(xué)方法報(bào)告很多,主要有薄層層析,紙層析,高壓液相色譜法,氣相色譜法,分光光度法,電泳法以及離子交換法等.這些方法主要是用來測(cè)定發(fā)酵肉湯和藥片中的新霉素的含量,很少被應(yīng)用到生物材料中.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,用于測(cè)定生物材料中新霉素殘留的方法有微生物方法,高壓液相色譜法,薄層層析法和電泳法.其中以前二種為主要方法.目前,國外新霉素殘留檢測(cè)的方法也主要是這兩種方法,即微生物方法和高壓液相色譜法兩種.其中,國外的微生物方法以fda的傳統(tǒng)方法為代表.下面就以上幾種測(cè)定生物材料中新霉素的方法做一簡單介紹.1.6.1 微生物學(xué)方法用微生物發(fā)測(cè)定新霉素含量所應(yīng)用的菌群主要為金色葡萄球菌(staph

18、ylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)兩種.groves等人(1955年)描述了生物體液和組織中新霉素的微生物分析方法,其中主要的是應(yīng)用于檢測(cè)臨床生物樣品中微生物.kavangh等人(1963年)描述了用表皮葡萄球菌為測(cè)試株,測(cè)定血清,尿液和組織中的新霉素含量.groves和kavangh發(fā)方法均沒有針對(duì)動(dòng)物性食品中新霉素殘留的測(cè)定,但是為微生物學(xué)方法測(cè)定新霉素殘留測(cè)定奠定了基礎(chǔ).siddique等人（1965年）報(bào)道了一套靈敏度較高的微生物方法測(cè)定牛奶中的新霉素，測(cè)試菌為表皮葡萄球菌。barbiers等人（1967年）報(bào)道了組

19、織中新霉素的分析程序，其法在肝臟，腎臟，肌肉中的靈敏度低于0.5ppm，脂肪中可達(dá)到0.2ppm。neff等人（1970年）報(bào)道了一套由18家實(shí)驗(yàn)室合作研究的測(cè)定飼料中新霉素含量的微生物學(xué)方法，方法測(cè)試菌為表皮葡萄球菌。平均回收率達(dá)到95.5。neff等人的方法成為美國aoac規(guī)定的測(cè)定飼料中新霉素的標(biāo)準(zhǔn)方法。1.6.2 液相色譜法液相色譜法（lc）技術(shù)在分析化學(xué)上具有很高的靈敏度和特異性。自1985年shaikh等人首次報(bào)道用lc法檢測(cè)動(dòng)物組織中的新霉素殘留量以來，lc法在新霉素殘留上的應(yīng)用被日益完善。1.6.3 薄層層析法 薄層層析法（thin layer chromatography,

20、tlc ）在實(shí)驗(yàn)室中被廣泛用于提純混合物中的新霉素或是測(cè)定新霉素片劑中的有效成分新霉素b、c的含量。在動(dòng)物性組織中新霉素殘留量的測(cè)定中，tlc主要用來進(jìn)行hplc分析法前和質(zhì)譜法確定前新霉素的醇化，但是也有報(bào)道用tlc法直接測(cè)定新霉素殘留。1.6.4 電泳法smither等（1978年）報(bào)道了用電泳法鑒定動(dòng)物組織和飼料中含新霉素在提內(nèi)的五十種抗生素，由于方法中的提取液（乙晴甲醇蒸餾水）和菌種（蠟狀芽孢桿菌與藤黃微球菌）不適合新霉素，新霉素沒有得到理想的回收率，靈敏度也不高.在新霉素殘留分析的幾種方法中,薄層層析主要被作為一種提純手段應(yīng)用于新霉素殘留測(cè)定,而電泳法也因?yàn)槠溥^程的繁瑣和靈敏度不高而

21、在新霉素殘留分析上受到限制，因此，高壓液相色譜法和微生物法是兩種主要的測(cè)定動(dòng)物組織中新霉素殘留的方法。高壓液相色譜法具有其他方法不可比擬的高靈敏，高特異性以及檢測(cè)速度，但其預(yù)處理過程復(fù)雜，不適合進(jìn)行大批量樣品的同時(shí)檢測(cè)。而微生物法操作簡便，樣品用量少，預(yù)處理簡單，易推廣，具有一定的靈敏度，在大批量樣品同時(shí)分析中占有很大的優(yōu)勢(shì),但只能測(cè)定有生物活性的殘留物,且只有當(dāng)藥物代謝標(biāo)志殘留物具備生物活性時(shí)才能測(cè)定總的殘留量,而新霉素在動(dòng)物體內(nèi)殘留標(biāo)志物為具有生物活性的新霉素母體化合物.1.7 研究的目的 綜上所述，本次試驗(yàn)的目的就是要為保障動(dòng)物性食品衛(wèi)生和公共健康而建立一套經(jīng)濟(jì)、方便、具有有一定靈敏度的

22、檢測(cè)豬組織中新霉素殘留量的微生物學(xué)檢測(cè)方法。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 儀器與試劑 勻漿機(jī) am-6 日本nihoseiki kaisha ltd離心機(jī) ld4-2a 北京醫(yī)用離心機(jī)廠 電子天平 bs210s(max=210g d=0.1mg)手提式壓力蒸氣滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠電熱恒溫?cái)?shù)顯恒溫水浴鍋 國華hh-4牌電熱鼓風(fēng)干燥器 101a-2型 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠電熱恒溫真空干燥箱 康樂牌dzk88-a型 上海醫(yī)療器械七廠電熱恒溫培養(yǎng)箱 hh.b11.600.s 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠渦旋混合器 wh-1微型(轉(zhuǎn)速2000r/min) 上海滬西分析儀器廠培養(yǎng)皿 20×10

23、0mm游標(biāo)卡尺 精確度0.02mm 北京分光光度計(jì) 722型組織剪，吸量管，電爐，錐形瓶，酒精燈，接種環(huán)2.1.2 藥品與試劑 新霉素標(biāo)準(zhǔn)品 含量703iu/mg蛋白胨 生化試劑瓊脂粉 生化試劑酵母粉 生化試劑牛肉浸膏 生化試劑葡萄糖 分析純氯化鈉 分析純磷酸氫二鉀 分析純磷酸二氫鉀 分析純氫氧化鈉 分析純氯仿 化學(xué)試劑2.1.3 實(shí)驗(yàn)菌種 表皮葡萄球菌(指導(dǎo)老師提供)2.2 方法2.2.1 溶液配制:(1) 0.1mol/l滅菌磷酸鹽溶液（ph 8.0） 準(zhǔn)確稱取16.73g無水磷酸氫二鉀（k2hpo4）和0.523g無水磷酸二氫鉀（kh2po4），加蒸餾水溶解并稀釋至1000ml，用121

24、滅菌20min，備用。(2) 新霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液將新霉素標(biāo)準(zhǔn)品置于37干燥箱48h后，精密稱定0.01422g。用無菌磷酸鹽緩沖溶液溶解稀釋至100ml，得到濃度為100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4冰箱保存，有效期為4周。2.2.2 培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基i及培養(yǎng)基ii的組成見表1。 表1 培養(yǎng)基組成table 1 the composing of the culture medium培養(yǎng)基i（累代保存用培養(yǎng)基）培養(yǎng)基ii（檢定培養(yǎng)基）蛋白胨/g10.010.0酵母粉/g 3.0 3.0牛肉浸膏/g 1.5 1.5無水葡萄糖/g 1.0 1.0瓊脂粉/g 15.0 15.0蒸餾水/ml 100

25、0 1000(1) 培養(yǎng)基i（斜面培養(yǎng)基）溶解蛋白胨10g，酵母粉3.0g，牛肉浸膏1.5g，無水葡萄糖1.0g和瓊脂15g于蒸餾水中，并稀釋至950ml用1.0mol/ml naoh溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph值為6.56.6，最后定容至1000ml。將培養(yǎng)基分裝于試管中，121高壓滅菌20min，制成斜面，用于菌種復(fù)活和傳代培養(yǎng)。(2) 培養(yǎng)基ii（分析培養(yǎng)基）溶解蛋白胨10g，酵母粉3.0g，牛肉浸膏1.5g，無水葡萄糖1.0g和瓊脂粉15g于蒸餾水中，并稀釋至950ml，用1.0mol./l naoh溶液調(diào)節(jié)ph值為7.98.0。最后定容至1000ml，將培養(yǎng)基分裝于500ml錐形瓶中，在121

26、高壓滅菌20min。2.2.3 菌液的制備 將表皮葡萄球菌在新鮮培養(yǎng)基i（斜面培養(yǎng)基）上連續(xù)傳代3次，用56ml 0.85%無菌溶液沖洗斜面培養(yǎng)物并倒入300ml錐形瓶中，然后用0.85%無菌溶液稀釋成菌懸液。在722型分光光度計(jì)560nm波長下，控制其透光率為80%左右，菌懸液由試驗(yàn)當(dāng)天制備。2.2.4 平板的制備(1) 底層：加10ml融化分析培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，均勻鋪平，在水平面上待其凝固。(2) 菌層：加適量（0.20.5ml）新制備的菌懸液至100ml預(yù)先融化并冷卻至48h分析培養(yǎng)基中，徹底混勻后，在每個(gè)含有底層的培養(yǎng)平板中加入4.0ml，使培養(yǎng)基均勻分散鋪平，并待其冷卻凝固，在使用的

27、當(dāng)天制備平板。2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液的制備分別取豬的空白肌肉、腎臟組織，經(jīng)搗碎后，于-20冷凍保存，臨用前解凍。分別稱取10g肌肉組織，10g腎臟組織，裝于50ml帶蓋塑料離心管中，加入20ml磷酸鹽緩沖溶液（ph 8.0），置旋渦混合器混合1min，然后在04放置30min后防如100水浴加熱5min，冷卻，4000r/min的速度離心15min，收集上層液。用少量1mol/ml溶液調(diào)節(jié)上層液至ph 8.0，于33下平板培養(yǎng)20h，不出現(xiàn)抑菌圈即可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液備用，04下保存，不超過一周。(2) 肌肉組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線用0.1mol/ml磷酸鹽緩沖液（ph 0.8

28、）稀釋新霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（100ug/ml）10ug/ml，然后用空白肌肉組織提取液（制備見2.2.5（1）稀釋為0.075，0.15，0.3，0.6，1.2和2.4ug/ml(稀釋標(biāo)準(zhǔn)參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，動(dòng)物源食品中新霉素殘留的檢測(cè)方法微生物檢測(cè)法z，農(nóng)業(yè)發(fā)200138號(hào))的一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，0.6ug/ml為參照濃度，按一劑量法的原理制備各標(biāo)準(zhǔn)曲線，即取新霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（1000ml），再把100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成10ug/ml，最后，10ug/ml標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液稀釋成所需要的各個(gè)工作標(biāo)準(zhǔn)濃度（0.15，0.3，0.6，1.2，2.4ug/ml），中心濃度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為其中一個(gè)（

29、如0.6ug/mg）。每個(gè)工作標(biāo)準(zhǔn)液濃度點(diǎn)制備3個(gè)培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中等距打六個(gè)孔,間隔的3個(gè)孔中分別滴入250ml中心濃度標(biāo)準(zhǔn)液，另間隔3個(gè)孔中分別滴入250ul工作標(biāo)準(zhǔn)液，于（36±1）恒溫培養(yǎng)（16±1）h用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌直徑，得到回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線。在坐標(biāo)紙上繪出，以各濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，平均抑菌圈直徑的校正值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3) 腎臟組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線用0.1mol/ml磷酸緩沖液（ph 0.8）稀釋新霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液（100ug/ml）至10 ug/ml，然后用空白腎臟組織提取液（制備見2.2.5（1）稀釋為0.1，0.2，0.4，0.8，1.6和3.

30、2 ug/ml的一系列標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，0.8 ug/ml為參照濃度，按一劑量法的原理制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在坐標(biāo)紙上繪圖，以各濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以平均抑菌圈直徑的校正值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.7 回收率測(cè)定（1）樣品準(zhǔn)備稱取5.0g搗碎的空白肌肉、腎臟組織于50ml塑料離心管中，稱2份，分別加入0.5ml不同濃度的工作液和磷酸鹽緩沖溶液，使加入溶液的總量為10ml，肌肉組織中新霉素濃度為分別0.25，0.5，1.0和2.0ug/g，腎臟組織中的新霉素濃度分別為0.375，0.75，1.5和3.0 ug/g。將空白組織和新霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液的混合物放置在旋渦混合器上1min，使之充分混勻，然后至04

31、放置30min，使新霉素充分滲透到組織中去。（2）提取在各樣品中分別加入9.5ml 0.1mol/ml磷酸鹽溶液，放置在旋渦混合器上混合1min，使之充分混勻，然后置04放置30min，使新霉素在混合物中充分分散。(3) 去蛋白將樣品中加入10ml氯仿,置于漩渦混合器上振蕩均勻，4000r/min速度離心15min，分離的上層液用少量1mol/ml（12滴）調(diào)至ph8.0。(4) 測(cè)定用上清液做抑菌試驗(yàn)，每皿間隔3個(gè)孔中滴加標(biāo)準(zhǔn)品參照濃度工作液，另3 個(gè)孔中滴加樣品上清液，37培養(yǎng)1820h，量取抑菌圈直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)測(cè)藥物的濃度。2.2.8 計(jì)算(1) 新霉素殘留量的計(jì)算公式 x=

32、cv/m其中 x組織樣品中新霉素殘留量（ug/g） c-試樣液中新霉素濃度(ug/ml) v-試樣總體積(ml) m-豬組織樣品重(g)(2) 回收率計(jì)算實(shí)際測(cè)出的藥物濃度與豬組織中添加的藥物濃度之比計(jì)算回收率,以百分?jǐn)?shù)表示.3 結(jié)果 3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備本研究方法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，采用量平行線的原理設(shè)計(jì)，即計(jì)量法，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，結(jié)果見表2和表3，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。本研究制備標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的方法是：用提取空白組織（肌肉、腎臟）的緩沖液為介質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法須要進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)（明新霉素能夠從組織中回收）。其結(jié)果見表4和表5

33、。 表2 肌肉組織抑菌試驗(yàn)結(jié)果table 2 the result of the test of bacterria hibition of the musclu tissue d1 d2d3d0.15（ug/ml12.02 10.8012.7912.2811.2912.9813.0111.8813.1012.230.3 ug/ml15.0213.8715.6014.6414.1515.1214.9014.2614.8614.710.6 ug/ml16.7317.2217.3416.8617.6917.9616.8616.9018.2017.311.2 ug/ml19.1119.7019.94

34、19.2419.8420.1619.6020.0019.1419.632.4 ug/ml21.2221.9821.6821.4822.1022.0021.4622.2122.4021.84表3 腎臟組織抑菌試驗(yàn)結(jié)果table 3 the result of the test of bacterria hibition of kidney tissued1d2d3d0.2 ug/ml9.9011.1610.8111.4810.7911.2411.2610.4311.4810.950.4 ug/ml12.8813.2613.2012.9613.5612.9613.0413.4613.1613.16

35、0.8 ug/ml18.817.0817.8817.4017.9818.6617.8017.4218.2017.911.6 ug/ml20.4320.8621.0820.5620.6720.1619.8819.5620.7620.443.2 ug/ml22.2021.8821.2322.1822.2622.8823.7622.8623.0022.25 d-抑菌圈直徑;d-抑菌圈平均值.以下相同表4 肌肉組織的標(biāo)準(zhǔn)曲線table 4 the standard response curve for muscle 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度新霉素添加濃度(ug/ml)0.0750.150.30.61.22.4平均

36、抑菌圈直徑(mm)11.7415.0118.0219.2421.80樣本數(shù)：n=3;-表示未檢出，以下表格都相同。圖1 肌肉組織標(biāo)準(zhǔn)曲線圖fig.1 the standard response curve for muscle圖2 腎臟組織標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(fig.2 the standard response curve for kidney)3.2 回收率 對(duì)新霉素添加水平為0.25，0.5,1.0和2.0ug/g組織的肌肉組織以及添加水平為0.375、0.75、1.5和3.0ug/g組織的腎臟組織進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果見表6.表6 肌肉和腎臟組織的回收率table 6 recovery of m

37、uscle and kidney樣本新霉素添加水平(ug/g組織)新霉素平均回收水平 (ug/g組織)新霉素平均回收率(ug/g組織)肌肉0. 250. 51. 02. 00.390.821.9385.274.483.2腎臟0. 3750. 751. 53. 00. 71.322.7378.188.081.1樣本數(shù)：n=3. 從表3可以看出，組織中的檢測(cè)限為0.50.75ug/g組織，在0.53.0ug/g組織的添加水平下，平均回收率為81.7.4 討論與分析4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線shaikh等用提取空白組織的緩沖液為介質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率十分一致。本試驗(yàn)中測(cè)得兩種組織標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率

38、的變異系數(shù)很小，表明本研究支持了shaikh的結(jié)論。本研究結(jié)果中兩種組織標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率不同，不同組織中方法的靈敏度也不同，這說明組織材料的成分會(huì)影響新霉素的測(cè)定。bielecka等報(bào)道分別用磷酸緩沖液、雞空白肝臟組織提取液稀釋青霉素、四環(huán)素以及鏈霉素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在任一給出的抗生素濃度，抑菌圈大小隨著稀釋物不同而變化。 4.2 回收率試驗(yàn)fda的分析方法中將提取之后的樣品離心，然后直接用上層液為待檢溶液，本研究發(fā)現(xiàn)這種方法得到的上層液比較渾濁，不能在培養(yǎng)基中充分?jǐn)U散，因此回收率的值不高，本研究中此方法對(duì)新霉素添加水平為1.0ug/g的肌肉組織的平均回收率只有74.4%用微生物學(xué)方法檢測(cè)雙氫鏈霉素和

39、四環(huán)素殘留時(shí)采用酸化樣品使蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行離心的方法，結(jié)果使回收率的比fao方法有顯著提高。本研究采用injlis等方法后發(fā)現(xiàn)酸化樣品，然后用堿調(diào)ph值的過程麻煩，并且難以計(jì)算樣品的終體積，另外，培養(yǎng)平板上抑菌圈的邊緣比較模糊，不容易進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)量。vilim等 報(bào)道在微生物學(xué)方法檢測(cè)動(dòng)物組織中青霉素類抗生素時(shí)，對(duì)提取之后的樣品加熱后進(jìn)行離心，平均回收率達(dá)94.6%99.1%；shaikh等在用hplc法檢測(cè)新毒素殘留時(shí)將樣品在沸水中加熱10min，使蛋白質(zhì)充分變性沉淀。新霉素是耐熱性很強(qiáng)的抗生素，在沸水中加熱不會(huì)破壞其活性。因此，本研究將加入氯仿去蛋白這一步驟加入fda方法中，結(jié)果得到的待

40、檢溶液澄清，新霉素添加水平為1.0ug/g的肌肉組織平均回收率為74.4%，比用fao方法得到的回收率提高近12.8%.fao方法中所用提取液體體積為組織樣品的3倍。當(dāng)提取液體積增大時(shí)，樣品稀釋的倍數(shù)隨之增加，因此組織中藥物含量低事難以檢測(cè)出來。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)2倍于組織樣本重量的提取液可以使藥物添加水平為0.53.0ug/g的組織的樣品得到滿意的回收率，本研究的結(jié)論同katz和bielecka的相一致。4.3 菌懸液細(xì)菌的濃度要控制在一定適當(dāng)?shù)臄?shù)量，一般在722型分光光度計(jì)560nm波長下，控制菌旋液的光透率在80%.細(xì)菌濃度過高過低都會(huì)影響藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。4.4 蛋白質(zhì)方法的選擇本試驗(yàn)過程中

41、遇到最大的問題是蛋白質(zhì)變性的問題。由于未變性的組織均漿有一定的的粘稠度，在瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定時(shí)，影響藥物的均勻擴(kuò)散，因此必須選擇合適的方法使其變性沉淀。新霉素對(duì)熱、酸、堿都很穩(wěn)定，可以考慮用磷酸鹽緩沖液處理后用以下方法使蛋白質(zhì)變性。4.4.1 加熱 將處理后的樣液于04靜置30min，放入100水浴加熱5min，取出冷卻，以4000r/min.本方法能使蛋白質(zhì)完全變性，但加熱后雞蛋完全凝固，難以獲取上清液。4.4.2 紫外線照射 將處理后的樣液于紫外燈下放置處理過夜。此法不能使蛋白質(zhì)完全沉淀。4.4.3 調(diào)節(jié)ph值 該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)有最大沉淀的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，先用磷酸調(diào)節(jié)處理液ph值為4

42、.04.5之間，使一部分酸性蛋白沉淀，以4000r/min離心15min，再用30%氫氧化鈉溶液將ph調(diào)至8.0，以4000r/min的速度離心15min，得上清液。該方法你能使蛋白質(zhì)完全沉淀，而且無法去除脂肪，抑菌圈小。4.4.4 乙睛或乙醇 處理后的樣液加入倍量（10ml）乙睛或乙醇，振搖，4000r/min離心15min,得上清液.該法能有效的使蛋白沉淀,并去處脂肪.但由于上述兩種有機(jī)溶劑都能與水互溶,用此法處理的上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)時(shí),有機(jī)溶劑影響了細(xì)菌的生長以及藥效,無抑菌圈出現(xiàn).4.4.5 氯仿 處理后的樣液加入1倍量(10ml)氯仿,振搖.4000r/min離心15min,得上清液

43、. 不同方法處理豬組織漿的試驗(yàn)結(jié)果表明,以氯仿處理豬組織勻漿的效果最好,抑菌圈邊緣清晰,檢出限最低.筆者認(rèn)為,氯仿是一種脂溶劑,豬組織經(jīng)氯仿處理后,可使脂蛋白變性,離心后介于中層,脂肪溶于氯仿沉于下層,藥物留在上清液中,排除了脂肪和蛋白質(zhì)的干擾,達(dá)到較好的提取效果.5 小結(jié) 本試驗(yàn)用提取空白組織(肌肉和腎臟)的緩沖液為介質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行了回收率的試驗(yàn),以表明新霉素能夠從組織中回收. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率在0.152.4ug/ml之間比較一致，具有良好的線性范圍。組織中的檢測(cè)限為0.50.75ug/g組織，在0.53.0ug/g組織的添加水平下，平均回收率為81.7% 。說明本次試驗(yàn)所用的方法能

44、夠有效的檢測(cè)出豬組織中的新霉素殘留量，是一套較可靠的動(dòng)物性食品中新霉素殘留量檢測(cè)的微生物學(xué)方法。在本次試驗(yàn)中用氯仿去除脂肪的影響有效的提高了組織中新霉素的藥液的提取效果，比以往只去除蛋白的效果更好。但回收率應(yīng)需在試驗(yàn)方法改進(jìn)的情況下有所提高。參考文獻(xiàn)：1王蘇華，周楊,雞肉中新霉素殘留的微生物學(xué)檢測(cè)方法,中國獸藥雜志j，2003,3（2）：1619。2王春奕，馬睿麟，馬玉蘭，馬北莉,雞和豬肉中抗菌素殘留和檢測(cè),中國家禽j，1997,11。3張治錟，抗生素藥品檢驗(yàn)、1991年版m.北京：人民衛(wèi)生出版社。4中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，動(dòng)物源食品中新霉素殘留的檢測(cè)方法微生物檢測(cè)法z，農(nóng)業(yè)發(fā)200138號(hào)。5鄭均鏞，王光寶，藥品微生物學(xué)及檢測(cè)技術(shù)m.北京：人民衛(wèi)生出版社，1989，364388。6沈川，肖希龍，新霉素在動(dòng)物機(jī)體中的殘留及其測(cè)定方法，中國獸藥雜志j，1998，32（2）：5356。7馬成林，動(dòng)物性食品理化檢驗(yàn)學(xué)m.長春：