無(wú)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

1、勁芳生物醫(yī)藥孵化器有限公司目的：制定無(wú)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)操作正確。范圍：本標(biāo)準(zhǔn)適用于本公司大容量注射劑無(wú)菌檢驗(yàn)操作。責(zé)任者：質(zhì)管部、化驗(yàn)室主任、qc 檢驗(yàn)員內(nèi)容：1、標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：中國(guó)藥典 2015年版二部附錄 xi h 。2、簡(jiǎn)述：無(wú)菌檢查方法系用于檢查藥品是否無(wú)菌的一種方法。檢查項(xiàng)目包括需氣菌、厭氣菌及真菌檢查。若供試品符合該項(xiàng)檢查方法的有關(guān)規(guī)定，僅表明了在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。3、環(huán)境要求：該項(xiàng)檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度萬(wàn)級(jí)（c級(jí)）背景下的局部百級(jí)（a級(jí)）的單向流區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。其全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。防止微生物污染，但所采取的措施不得影響供試品中微生物的檢出。操作前

2、環(huán)境潔凈度應(yīng)經(jīng)驗(yàn)證。日常檢驗(yàn)需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。5、方法驗(yàn)證：進(jìn)行該項(xiàng)檢查前應(yīng)按照無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證規(guī)程確認(rèn)該方法的適用性。4、人員要求：無(wú)菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識(shí)，并經(jīng)過(guò)無(wú)菌技術(shù)培訓(xùn)。6、檢驗(yàn)數(shù)量及檢驗(yàn)量：6.1 、接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗(yàn)數(shù)量:2%或 10 個(gè)（取較少者），供試品無(wú)菌檢查若采用薄膜過(guò)濾法，應(yīng)增加1/2 的最小檢驗(yàn)數(shù)量作陽(yáng)性對(duì)照用；若采用直接過(guò)濾法，應(yīng)增加供試品無(wú)菌檢查時(shí)每個(gè)培養(yǎng)基容器接種的樣品量作陽(yáng)性對(duì)照用。6.2 、每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量: 半量（ 100mlv200ml） ，采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，檢驗(yàn)量應(yīng)不少于直接接種的供試品總接種量，只要供試品特性允

3、許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。7、細(xì)菌培養(yǎng)溫度為3035，真菌培養(yǎng)溫度為2328。8、儀器用具：垂直層流超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴箱、顯微鏡、離心機(jī)、雙碟、試管、三角瓶、刻度離心管、注射器（針頭） 、剪刀、鑷子、注射器盒、 75酒精棉球、紫外光燈 365nm 、真空泵、一次性使用集菌培養(yǎng)器。9、消毒劑配制：9.1 、75乙醇溶液（配制酒精棉球用） 。9.2 、0.2新潔爾滅溶液（配制消毒棉球用） 。9.3 、2來(lái)蘇爾溶液（配制消毒棉球用） 。10、試劑及培養(yǎng)基的配制：10.1 、0.1 蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g ，加水 1000ml,微溫使溶解，濾清，調(diào)節(jié)ph文件名稱無(wú)菌

4、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（sop ）頁(yè)碼： 1/5文件編號(hào)yz-q3(z)-zl-10-2016 版次第三版制定審核批準(zhǔn)制定日期審核日期批準(zhǔn)日期頒發(fā)部門(mén)頒發(fā)數(shù)量生效日期分發(fā)單位勁芳生物醫(yī)藥孵化器有限公司值至 7.1 0.2 ，分裝，滅菌。10.2 、ph7.0 滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀 3.56g、磷酸氫二鈉 7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨 1.0g，加水 1000ml微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。10.3、根據(jù)供試品特性，可選用其他經(jīng)驗(yàn)證的適宜溶液作為稀釋液、沖洗液。如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑。10.4 、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：按商品說(shuō)明稱取

5、培養(yǎng)基，配制，搖勻，分裝，按培養(yǎng)基說(shuō)明高壓滅菌，保存?zhèn)溆?。分裝的容器應(yīng)適當(dāng)，其裝量與容器高度比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/2 。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的高度不得超過(guò)培養(yǎng)基深度的1/5 ，否則須經(jīng) 100水浴加熱至粉紅色消失（不超過(guò)20 分鐘） ，迅速冷卻只限加熱一次，并應(yīng)防止被污染。10.5 、改良馬丁培養(yǎng)基： 取商品干燥培養(yǎng)基28.5g，加水 1000ml，加熱溶解，分裝，121高壓滅菌 15 分鐘（若干燥培養(yǎng)基結(jié)塊應(yīng)勿使用） 。10.6 、選擇性培養(yǎng)基：按上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量的中和劑、滅活劑

6、或表面活性劑，其用量同方法驗(yàn)證試驗(yàn)10.7 、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：按商品說(shuō)明稱取培養(yǎng)基，配制，加熱，溶解，分裝，按培養(yǎng)基說(shuō)明高壓滅菌，保存?zhèn)溆谩?0.8 、 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：取商品干燥培養(yǎng)基3.4g， 加蒸餾水 1000ml， 加熱溶解分裝，121高壓滅菌 15 分鐘。10.9 、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基： 取商品干燥培養(yǎng)基制備或按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入 14.0g 瓊脂，調(diào)節(jié) ph值使滅菌后 ph值為 6.4 0.2 ，分裝， 121高壓滅菌 15分鐘。10.10 、制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在225，避光的環(huán)境中。培養(yǎng)基若保存于非密閉容器中，一般在三周內(nèi)使用。若保存于密閉容器中，一般可在一年內(nèi)使

7、用。11、試驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作11.1 、用具的洗刷11.1.1 、玻璃器皿：如試管、量筒、移液管、刻度吸管、離心管、三角瓶、雙碟等用清潔液浸泡，用流水洗滌，再用蒸餾水洗滌45 次，倒置，晾干。試管、移液管、三角瓶等使用過(guò)后，應(yīng)先消毒倒出內(nèi)容物后，再清洗晾干。11.1.2 、注射器用水沖洗后，用洗滌劑沖洗，然后用水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗3 次。11.1.3 、剪刀、鑷子用水及去污粉洗滌，用水沖洗干凈，再用蒸餾水洗滌3 次。11.1.4 、多用薄膜過(guò)濾器，玻璃管等用飲用水及蒸餾水洗凈、晾干。11.1.5 、潔凈服、褲、帽子、口罩等用水洗滌潔凈后，晾干。11.2 、用具的包扎及滅菌11.2.1 、移

8、液管、刻度吸管在管口上端內(nèi)，松松塞入少許脫脂藥物，然后每支管用白紙嚴(yán)密卷好，再用兩層牛皮紙一起包扎。11.2.2 、洗滌潔凈的注射器及適配針頭各部件與剪刀、鑷子一并入墊有紗布的鋁盒內(nèi)，一層層放好，蓋上紗布，將鋁盒蓋好，用牛皮紙包扎。11.2.3 、試管、三角瓶等在管（瓶）口塞上紗布棉紗用牛皮紙包裝嚴(yán)密。11.2.6 、將潔凈服、等用布口袋配套裝入，扎緊口袋，用牛皮紙包扎好。勁芳生物醫(yī)藥孵化器有限公司11.2.7 、將以上包扎好的用具在121蒸汽滅菌 20 分鐘?；虿扇∵m宜的滅菌方法。 （適宜高溫滅菌的器皿可采用160干熱滅菌）11.2.8 、物品滅菌完畢，勿立即置冷處，以免急速冷卻導(dǎo)致染菌，應(yīng)

9、置恒溫培養(yǎng)箱中干燥。11.3 、潔凈室的清潔與滅菌11.3.1 、潔凈室及超凈臺(tái)，每周用高錳酸鉀加甲醛薰蒸滅菌。11.3.2 、在每次操作前，應(yīng)作好清潔工作，并用0.2%新潔爾滅溶液或2% 來(lái)蘇爾或 75乙醇擦洗超凈臺(tái)工作臺(tái)面及可能污染的死角，然后開(kāi)啟紫外線燈殺菌半小時(shí)，超凈臺(tái)空氣過(guò)濾器自凈半小時(shí)。操作完畢后，用上述消毒液，再次處理工作臺(tái)面，開(kāi)紫外光燈殺菌30 分鐘以上。12、操作12.1 、開(kāi)啟傳遞窗外側(cè)門(mén)，將物品表面消毒后置傳遞窗內(nèi)，關(guān)閉窗門(mén)。12.2 、操作人員按進(jìn)入潔凈室更衣程序洗手、更衣?lián)Q工作鞋，換無(wú)菌衣、褲、口罩。進(jìn)入潔凈室內(nèi)，開(kāi)啟內(nèi)側(cè)門(mén)，取出物品，關(guān)閉內(nèi)側(cè)門(mén)，經(jīng)緩沖間帶入潔凈室內(nèi)

10、，物品放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，關(guān)閉潔凈室門(mén)，人員離開(kāi)潔凈室，繼續(xù)用紫外燈照射半小時(shí)，關(guān)燈，再將用具放入超凈臺(tái)內(nèi)。12.3 、培養(yǎng)基適用性檢查：無(wú)菌檢查用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基等應(yīng)符合的無(wú)菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品檢查前或與供試品檢查同時(shí)進(jìn)行。12.3.1 、無(wú)菌效果檢查：每批培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5 支（瓶）培養(yǎng) 14 天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。12.3.2 、靈敏度檢查：12.3.2.1 、菌種及菌液制備：12.3.2.1.1、檢查用菌種包括：金黃色葡萄球菌（ staphylococcus aureus）cmcc(b)26 003 銅綠假單胞菌（ pstudomonas aerug

11、inosa ）cmcc(b)10 104 枯草芽孢桿菌（ bacillus subtilis）cmcc(b)63 501 生孢梭菌（ clostridium sporgenes）cmcc(b)64 941 白色念珠菌（ candida albicaus）cmcc(f)98 001 黑曲菌（ aspergillus niger）cmcc(f)98 003 12.3.2.1.2、菌液制備方法：銅綠假單胞菌菌懸液的制備方法同金黃色葡萄球菌菌懸液制備方法。12.3.2.2 、培養(yǎng)基接種：取每管裝量為12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基9 支，分別接種小于 100cfu 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草

12、芽孢桿菌、生孢梭菌各2 支，另一支不接種，作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3 天；每管裝量為 9ml 的改良馬丁培養(yǎng)基5 支分別接種小于 100cfu的白色念珠菌、黑曲菌各2 支，另一支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5 天。逐日觀察結(jié)果。12.3.2.3 、結(jié)果判斷：空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判斷該培養(yǎng)基靈敏度符合規(guī)定。12.4 、配制的培養(yǎng)基應(yīng)在涼暗處保存，一般不得超過(guò)2 周。臨用前細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基分別經(jīng) 3035和 2025培養(yǎng)不少于 48 小時(shí)和 72 小時(shí)，證明無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)方可使用。12.5 、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)：勁芳生物醫(yī)藥孵化器有限公司12.5.1 、應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌，無(wú)

13、抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品以生孢梭菌為對(duì)照品；抗真菌的供試品以白色念珠菌為對(duì)照品。12.5.2 、陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。12.5.3 、取各陽(yáng)性對(duì)照菌懸液（含菌量小于100cfu ）及供試品（用量同供試品無(wú)菌檢查每份培養(yǎng)基接種的樣品量） ，以無(wú)菌操作加入相應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4872 小時(shí)，檢查應(yīng)生長(zhǎng)良好。 （陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)操作應(yīng)與微生物限度檢查操作隔離進(jìn)行，防止交叉污染）。12.6 、陰性對(duì)照試驗(yàn)：取供試品的相應(yīng)溶劑或稀釋劑沖洗液同法操作，培養(yǎng)14 日應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。12.7 、供試品檢查

14、：12.7.1 、供試品外部消毒：包裝瓶外壁用75乙醇擦拭，待干。12.7.2 、供試品的制備：用滅菌鑷子取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，注射器針頭應(yīng)迅速通過(guò)火焰數(shù)次，用注射器以無(wú)菌操作直接吸取供試液?；虺橹烈褱缇Ａ萜髦?，用稀釋劑稀釋為供試液，如為可溶于水的固體供試品，應(yīng)取規(guī)定量，加入適宜的滅菌稀釋液溶解做為供試液。12.7.3 、直接接種法：取供試品，按上述操作進(jìn)行外部消毒和制備后，用滅菌注射器以無(wú)菌操作自每管中吸取供試品，在近火焰旁以左手持培養(yǎng)基，右手半握拳，以小指和無(wú)名指拔開(kāi)培養(yǎng)基管棉塞，管口通過(guò)火焰，移至火焰下側(cè)，分別將各供試品1ml（或規(guī)定量，除另有規(guī)定外，每個(gè)容器

15、中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的10% ）沿培養(yǎng)基管壁加入各培養(yǎng)基管內(nèi)，每個(gè)供試品均分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基各5 管，另取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基管一支，同法操作，操作結(jié)束后，接種對(duì)照菌液1ml（小于 100cfu ）作為供試品陽(yáng)性對(duì)照。硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，每管裝量不少于15ml，改良馬丁培養(yǎng)基不少于10ml。注入供試液時(shí)，切勿向液面直射，以免將空氣中的氧帶入培養(yǎng)基中，并在火焰旁將塞子塞嚴(yán)。接種后輕輕振動(dòng)使均勻。12.7.4 、薄膜過(guò)濾法12.4.1 水溶性供試液過(guò)濾前應(yīng)先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)

16、揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為 100ml，且總沖洗量不得超過(guò)1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。12.7.4 、2 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在3035培養(yǎng) 14 天，改良馬丁培養(yǎng)基在2328培養(yǎng) 14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日檢查是否有菌生長(zhǎng)，并填寫(xiě)無(wú)菌檢查記錄。如供試品管出現(xiàn)渾濁或沉淀，經(jīng)培養(yǎng)后不能從外觀判斷時(shí)，可取該培養(yǎng)液接種在另一支相同新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng) 2 天，真菌培養(yǎng) 3 天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。12.8 結(jié)果判斷：陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管不得有菌生長(zhǎng)。否則，試驗(yàn)無(wú)效。若供試品管均澄清， 或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定 ; 若供試品管中任何顯渾濁并確