引物設(shè)計(jì)原則(最全匯總)

1、引物設(shè)計(jì)原則（匯總）普通引物設(shè)計(jì)（適用于從載體上擴(kuò)增模板） ：1. 普通引物長(zhǎng)度一般在 20-30bp 之間，常用 24-28bp 左右以保證基因特異性；2. 下載基因序列到 Vector NTI ； 3. 找到所需安裝載體序列； 4. 將基因序列的 CDS 高亮標(biāo)記；5. 尋找載體序列中常用酶切位點(diǎn)，一般為 EcoRI、 BamHI 、 HindIII 、 XhoI 等等，比對(duì)檢測(cè)基因序列中是否有這些位點(diǎn)，有的話舍棄，最后選擇兩個(gè)酶切位點(diǎn)，最好離得遠(yuǎn)一點(diǎn)， 并且最好 buffer 用一樣的。酶切位點(diǎn)一般是6bp 的回文序列；6. 從基因 ATG 開(kāi)始往后選擇 10-20bp 均可 （我的習(xí)慣

2、是27bp-6bp 酶切位點(diǎn) -2bp 保護(hù)堿基 -xbp補(bǔ)齊序列） ，但最好保證最后兩個(gè)是G 或者 C ，以減少錯(cuò)配率；7. 將上游酶切位點(diǎn)序列補(bǔ)在 ATG 前方，并根據(jù)載體對(duì)框情況補(bǔ)足兩者之間的空缺，再根據(jù)序列的 GC 含量和 TM 值在酶切位點(diǎn)前補(bǔ)足保護(hù)堿基，以保證 GC 和 AT 的含量不能過(guò)高。注意，所有的補(bǔ)齊不能用到終止密碼子；8. 檢測(cè)上游序列的結(jié)構(gòu)情況，理論上不要太多二級(jí)結(jié)構(gòu)以及3 端匹配即可；不過(guò)重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；9. 從下游終止密碼子開(kāi)始向前選擇 10-20bp 均可， 但最好保證最后兩個(gè)是G 或者 C， 以減少錯(cuò)配率；10. 選才Co complementa

3、ry sequence,在N端補(bǔ)齊下游酶切位點(diǎn)，如果 tag在C端（即下游），則在第 9 點(diǎn)中應(yīng)該從終止密碼子前開(kāi)始選擇 （即舍棄終止密碼子） ， 并且下游引物也要對(duì)框，如果 tag 在 N 端，則下游引物不需要對(duì)框，只要在N 端加上下游酶切位點(diǎn)，再根據(jù)情況加上 2 個(gè)保護(hù)堿基，然后檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，原則上3 端部匹配即可。不過(guò)重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；11. 將設(shè)計(jì)好的上下游引物放在一起檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，原則上3 端部匹配即可。不過(guò)重復(fù)的序列也不能太多，以免移碼；12. 最后在 NCBI 的 primer Blast 網(wǎng)站上比對(duì)引物序列，看是否基因特異性的。2011 年 10 月 18 日左潔

4、1. 引物的長(zhǎng)度一般為 15-30 bp ，常用的是 18-27 bp ，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于Taq DN咪合酶進(jìn)行反應(yīng)。2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3 端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如 GGG£ CCC也會(huì) 使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3,引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DN給成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率， 末位堿基為 A 的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿 基， 因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。 另外， 引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR5

5、應(yīng)失敗。5'端序列對(duì)PCF®響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位 點(diǎn)或標(biāo)記物。4,引物序列的GC含量一般為40-60%,過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游 引物的G*量不能相差太大。5,引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì) 算有多種方法，如按公式Tm= 4（G+C）+ 2（A+T）,在Oligo軟件中使用的是最鄰 近法 （the nearest neighbor method） 。6. AG值是指DNA（鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的 相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端AG值較低（絕又t值不超過(guò)9）,而5'端和中間 AG

6、值相對(duì)較高的引物。引物的3'端的AG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈 結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNAK合反應(yīng)。7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol ）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使 PC阪應(yīng)不能正常進(jìn)行。8. 對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫(xiě)成5-3 方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺(jué)得擴(kuò)增長(zhǎng)度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNAf列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。 如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)， 就要避開(kāi)它。 如這

7、一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。 G+*量在40%60無(wú)間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物5'端可以修飾。 引物3'端不可修飾。 引物3'端要避開(kāi)密碼子的第3位。1. 引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。2 .避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNAZ級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件

8、可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA勺穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)， 有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域 自由能（ G° ）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一 區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2'-脫氧GTPWt dGTP寸擴(kuò)增的成功是有幫助的。3 .長(zhǎng)度 寡核甘酸引物長(zhǎng)度為1530bp, 一月殳為2027mes引物的有效長(zhǎng)度： Ln=2（G+C） +（A+T），Ln 值不能大于38，因?yàn)?gt;38 時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度（74c）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G+C含量G+C含量一般為40%60%其Tm值是寡核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50

9、%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度， 一般高于Tm值510Co若按公式Tm=4（G+C +2 （A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引 物的Tm為5580C,其Tm值最好接近72 c以使復(fù)性條件最佳。5 . 堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的， 不要有聚嘌呤或聚喀噬的存在。尤其3'端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C 富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6 . 引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列， 否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。 這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自 身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。 7. 引物之間 兩引物之

10、間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免 3'端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8.引物的3'端 引物 的延伸是從3'端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3'端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCRAS-PCR反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯(cuò) 配。在 標(biāo)準(zhǔn)PCR5應(yīng)體系中，用2U Taq DN咪合酶和800 mol/L dNTP（四種dNTP 各 200仙 mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按 95C , 25s； 55C , 25s； 72C, 1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV- 1 gag基因區(qū)的條件下，引物3'

11、端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn) 物的影響是有一定規(guī)律的。A： A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20 , A： G和C： C錯(cuò)七 下降至1/100。引物A:模板G與引物G模板A錯(cuò)配對(duì)PCR響是等同的。9.引物的5'端 引物的5'端限定著PCRT物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響 不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物 5'端修飾包括：加 酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒 光、地高辛、Eu3將；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNAff列； 引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。 10. 密碼子的 簡(jiǎn)并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的 第 3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)

12、增特異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于 0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)如果自由能值小于 0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對(duì)區(qū)域在3 末端問(wèn)題會(huì)更為嚴(yán)重 3 末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使Pair Rating 匹配度評(píng)分匹配度低的引物對(duì)常常不太有效是因?yàn)樵谕瑯油嘶饻囟认耇M氐的引物決定擴(kuò)增的特異性而Tm高的引物更易于形成非特異性結(jié) 合而造成錯(cuò)誤的起始【 1】引物的長(zhǎng)度以 15 30bp 為宜，否則會(huì)影響擴(kuò)增的特異性。2堿基盡可能隨機(jī)分布，避免相同的堿基成串排列，引物的 G+輸量 在40% 60%之間，若G+若量太低，可

13、在5"端加上一些G或C,若G+ C 含量太高，可在5"端加上一些A或T。【 3】 應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)及兩條引物的 3" 端互補(bǔ)形成引物二聚體，避免在引物的3"端有3個(gè)G或3個(gè)C成串排列，3"端的末位堿基最好 選T、C、G,而不選A,也有建議在引物的兩端用12個(gè)喋吟堿基。4盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過(guò)5C）,退火溫 度根據(jù)較低的Tm值選定，也可以通過(guò)改變引物的長(zhǎng)度來(lái)平衡兩條引物的退火 溫度。Tm值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物，Tm值需 要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，

14、現(xiàn)有的PCRSI物設(shè)計(jì)軟件大 多數(shù)都采用這種方式。（注：對(duì)于 Tm值的計(jì)算有爭(zhēng)議的地方是附加 序列應(yīng)不應(yīng)該計(jì)算在內(nèi)，我覺(jué)得有值得商討的地方。因?yàn)閺睦碚撋现挥凶铋_(kāi)始的循環(huán)引物的附加 序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來(lái)的PCRS應(yīng)中，引 物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【 5】 引物的3端要與模板嚴(yán)格配對(duì)，而 5端堿基沒(méi)有嚴(yán)格的限制，只要與模板DN閣合的部分足夠長(zhǎng)，其5'端堿基可不與模板DNA!己對(duì)而呈游離 狀態(tài)，這樣， 我們可以在引物的 5 末端加上酶切位點(diǎn)（引入酶切位點(diǎn)時(shí)，要考慮到進(jìn)行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來(lái)困難）、啟動(dòng)子，方便下游操作?！?6】 不要在擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

15、區(qū)設(shè)計(jì)引物，以免退火困難。也要考慮引物設(shè)計(jì)處模板的特異性。引物設(shè)計(jì)原則1 .引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng) 會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC,也會(huì)使 錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。3 .引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿 基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3&#

16、39;端使用堿基Ao另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾 位點(diǎn)或標(biāo)記物。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%,過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游 引物的GC含量不能相差太大。5 .引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì) 算有多種方法，如按公式Tm = 4(G+C) + 2(A+T),在Oligo軟件中使用的是最鄰 近法(the nearest neighbor method)6 .是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端AG值較

17、低(絕對(duì)值不超過(guò)9),而5'端和中間AG 值相對(duì)較高的引物。引物的3'端的AG值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并 引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高(超過(guò) 4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚 體帶，并且降低引物有效濃度而使 PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8 .對(duì)引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物序列應(yīng)該都是寫(xiě)成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內(nèi)，另外我覺(jué)得擴(kuò)增長(zhǎng)度大一些比較好，500bp左右。要設(shè)計(jì)引物首先要找到 DNA 序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)?

18、否形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)， 就要避開(kāi)它。 如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。 G+C 含量在40%60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物5端可以修飾。引物3端不可修飾。 引物3端要避開(kāi)密碼子的第3位。1 .引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8 個(gè)互補(bǔ)堿基同源。2 .避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響， 選擇擴(kuò)增片

19、段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。 用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì) mRNA 的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（ G° ）小于 58.6lkJ/mol 時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza2-脫氧GTP取彳t dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。3 .長(zhǎng)度寡核苷酸引物長(zhǎng)度為1530bp， 一般為2027mer。 引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2（ G+C） + （ A+T ）， Ln 值不能大于38，因?yàn)?gt;38 時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)TaqDNA 聚合酶的最適溫度（74）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G+C含量G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡

20、核甘酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下， 50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm 值 510。若按公式Tm=4 （G+C） +2 （A+T ）估計(jì)引物的Tm 值，則有效引物的Tm 為 5580，其Tm 值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧噬的存在。尤其3'端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。 這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。 若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能

21、大于3bp。7 .引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于 4 個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8 .引物的3端 引物的延伸是從3端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形 成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的 PCR （AS-PCR）反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生 錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800仙mol/L dNTP（四 種dNTP各200仙mol/D以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95 C, 25s； 55C, 25s； 72 C, 1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)

22、 物的影響是有一定規(guī)律的。A ： A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20, A ： G和C ： C錯(cuò)七 下降至 1/100。 引物 A ： 模板 G 與引物 G： 模板 A 錯(cuò)配對(duì) PCR 影響是等同的。 9. 引物的5端 引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因 此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、 插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。10.密碼子的簡(jiǎn)并如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3'端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影 響擴(kuò)增特

23、異性與效率。Hairpin 發(fā)卡結(jié)構(gòu)如果自由能值大于 0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)如果自由能值小于 0 則 該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向。引物之間形成如果配對(duì)區(qū)域在3末端問(wèn)題會(huì)更為嚴(yán)重3 末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增使Pair Rating 匹配度評(píng)分匹配度低的引物對(duì)常常不太有效是因?yàn)樵谕瑯油嘶饻囟认?Tm 低的引物決定擴(kuò)增的特異性而Tm 高的引物更易于形成非特異性結(jié)合而造成錯(cuò)誤的起始【 1】引物的長(zhǎng)度以15 30bp 為宜，否則會(huì)影響擴(kuò)增的特異性。【 2】 】堿基盡可能隨機(jī)分布，避免相同的堿基成串排列，引物的 G+C 含量在40% 60%之間，若G+C含

24、量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+C含量 太高，可在5'端加上一些A 或 T 。【 3】 應(yīng)避免每條引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)及兩條引物的 3'端互補(bǔ)形成引物二聚體，避免在引物的 3'端有 3 個(gè) G 或 3 個(gè) C 成串排列，3'端的末位堿基最好選T 、C、G,而不選A,也有建議在引物的兩端用12個(gè)喋吟堿基。【 4】 盡可能使用兩條引物的 Tm 值相同（最好相差不要超過(guò)5），退火溫度根據(jù)較低的 Tm 值選定，也可以通過(guò)改變引物的長(zhǎng)度來(lái)平衡兩條引物的退火溫度。 Tm 值可以根據(jù)Tm=4（G+C）+2（A+T） 計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物， Tm 值需要考慮動(dòng)

25、力學(xué)參數(shù)、從 “最近鄰位 ”的計(jì)算方式得到，現(xiàn)有的 PCR 引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。 （注：對(duì)于Tm 值的計(jì)算有爭(zhēng)議的地方是附加序列應(yīng)不應(yīng)該計(jì)算在內(nèi)， 我覺(jué)得有值得商討的地方。 因?yàn)閺睦碚撋现挥凶铋_(kāi)始的循環(huán)引物的附加序列是不與模板鏈結(jié)合的，而在后來(lái)的PCR反應(yīng)中，引物的附加序列是和模板鏈結(jié)合了的。）【 5】引物的3端要與模板嚴(yán)格配對(duì)，而5端堿基沒(méi)有嚴(yán)格的限制，只要與模板 DNA 結(jié)合的部分足夠長(zhǎng)，其5端堿基可不與模板DNA 配對(duì)而呈游離狀態(tài)，這樣， 我們可以在引物的 5 末端加上酶切位點(diǎn) （引入酶切位點(diǎn)時(shí)， 要考慮到進(jìn)行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來(lái)困難）、啟動(dòng)子，方便下游操

26、作。【 6】 不要在擴(kuò)增序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)設(shè)計(jì)引物， 以免退火困難。 也要考慮引物設(shè)計(jì)處模板的特異性。PCR 引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板 DNA 序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。要設(shè)計(jì)引物首先要找到 DNA 序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。 如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)， 就要避開(kāi)它。 如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物。現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。 一般引物長(zhǎng)度為 1530 堿基， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100600堿基對(duì)。讓我們先看看P1 引物。一般引物序列中G C 含量一般

27、為 40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1 引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4 個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點(diǎn) 序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3'端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?端開(kāi)始的。這里還需提醒的是 3'端不要終止于密碼子的第 3 位， 因?yàn)槊艽a子第 3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并， 會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR 引物的設(shè)計(jì)原則： 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)

28、計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。G C含量在40%60%問(wèn)。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物5'端可以修飾。 引物3'端不可修飾。 引物3'端要避開(kāi)密碼子的第3位。PCR 引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA 序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到 PCR 的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR 的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。1 .引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連

29、續(xù)8 個(gè)互補(bǔ)堿基同源。2 .避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū) DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA 的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（ G0 ）小于58.6lkJ/mol時(shí)， 擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用 7-deaza2'-脫氧GTP取彳t dGTP 對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。3 .長(zhǎng)度寡核苷酸引物長(zhǎng)度為1530bp， 一般為2027mer。 引物的有效長(zhǎng)度： Ln=2（ G C）（ A T ， Ln 值不能大于38，因?yàn)?gt;38 時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq D

30、NA 聚合酶的最適溫度（74 ）,不能保證產(chǎn)物的特異性。4 .G C含量G C 含量一般為40%60%。其 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度， 一般高于 Tm 值 510。若按公式Tm=4(G C) 2(A T)估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580C , 其 Tm 值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。5 .堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚喋吟或聚喀呢的存在。尤其3'端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C,因這樣會(huì)使引物在G C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。6 .引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾

31、狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。7 .引物之間兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一 對(duì)引物間不應(yīng)多于 4 個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。8 .引物的3端引物的延伸是從3'端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié) 構(gòu)可能，除在特殊的PCR (AS-PCR)反應(yīng)中，引物3'端不能發(fā)生錯(cuò)配。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800 mol/L dNTP(四種dNTP 各 200仙 mol/D 以質(zhì)粒(103 拷貝)為模

32、板，按 95C, 25s； 55C, 25s； 72C, 1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影 響是有一定規(guī)律的。A : A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20, A ： G和C ： C錯(cuò)七下降至 1/1000引物A:模板G與引物G:模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的。9 .引物的5端引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被 修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物 5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒 光、地高辛、 Eu3 等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA 序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。10 .密

33、碼子的簡(jiǎn)并如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā) 生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。特殊目的的引物設(shè)計(jì)將在有關(guān)章節(jié)討論。 隨著人們對(duì)引物的認(rèn)識(shí)， 一些引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序也應(yīng)運(yùn)而生，下面將討論有關(guān)引物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法引物設(shè)計(jì)重點(diǎn)考慮因素、設(shè)計(jì)技巧及引物設(shè)計(jì)軟件推薦urbest發(fā)表于 2007-07-14 16:35我最近合成了幾十對(duì)引物， ，在實(shí)戰(zhàn)中多多少少有些心得，拿出來(lái)給大家分享。我感覺(jué)想把引物合成的比較好， 除了前引物和后引物的 Tm 不能相差太大， 我們還要重點(diǎn)考慮以下 因素：1、 GC% GC 含量對(duì)于 PCR 反應(yīng)來(lái)說(shuō) GC 含量在40% 60% ，一般

34、50%左右比較合適；而對(duì)于測(cè)序引物和雜交探針來(lái)說(shuō) GC 含量至少應(yīng)為50% 。產(chǎn)物中 GC 含量最好大于引物中的 GC 含量。2、 Degeneracy 多義性當(dāng)設(shè)計(jì)多義引物時(shí)應(yīng)盡量減少引物多義性，這樣會(huì)帶來(lái)更好的特異性，應(yīng)盡量避免 3 末端的多義性，因?yàn)檫@里即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。3、 3End Stability 3 末端穩(wěn)定性引物穩(wěn)定性影響它的錯(cuò)配效率，一條理想的引物應(yīng)該有一個(gè)穩(wěn)定性較強(qiáng)的 5 末端和相對(duì)穩(wěn)定性較弱的 3 末端。如果引物 3 穩(wěn)定性強(qiáng)，有可能在即使5 末端不配對(duì)的情況下造成錯(cuò)配，形成非特異性擴(kuò)增條帶( secondary bands)。而 3 末端穩(wěn)定性低的引

35、物較好的原因是在引物發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，由于3 末端不太穩(wěn)定引物結(jié)合不穩(wěn)定而難以延伸。4、 GC Clamp GC 鉗引物與目的位點(diǎn)的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的 5 末端。這一段有較強(qiáng)穩(wěn)定性的 5 末端稱為GC 鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。5、 Secondary Structures 二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計(jì)中必須考慮的一個(gè)重要因素。 二級(jí)結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量， 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點(diǎn)的結(jié)合能力， 從而降低擴(kuò)增效率，形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR 擴(kuò)增中發(fā)揮作用。6、 Hairpin 發(fā)卡

36、結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補(bǔ)堿基分子內(nèi)配對(duì)造成引物折疊形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個(gè)連續(xù)堿基配對(duì)就可以形成。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對(duì)釋放的能量以及折疊DNA 形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會(huì)干擾反應(yīng)，如果自由能值小于 0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。7、 Dimer 二聚體引物之間的配對(duì)區(qū)域能形成引物二聚體， 它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 它造成引物二聚體擴(kuò)增并減少目的擴(kuò)增產(chǎn)物， 二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對(duì)區(qū)域在3 末端問(wèn)題會(huì)更為嚴(yán)重， 3

37、 末端配對(duì)很容易引起引物二聚體擴(kuò)增。8、 False Priming 錯(cuò)配如果引物可以結(jié)合除目的位點(diǎn)外的其他區(qū)域， 擴(kuò)增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布 ( smear) 。 3 末端連續(xù)幾個(gè)堿基配對(duì)形成錯(cuò)配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對(duì)，在使用引物設(shè)計(jì)軟件時(shí)，您可以分別設(shè)定確認(rèn)為錯(cuò)配的 3 末端或引物全長(zhǎng)形 成連續(xù)堿基配對(duì)的數(shù)量。順便說(shuō)一下，如果是新手，剛開(kāi)始接觸引物設(shè)計(jì)，推薦使用 Primer Premier 5.0 ，因?yàn)樗?界面簡(jiǎn)單，易學(xué)易用；如果你想把引物設(shè)計(jì)得盡善盡美，公認(rèn)的首選軟件是Oligo ，其次我認(rèn)為是 DNAstar 。 Oligo 功能強(qiáng)大，所以使用

38、起來(lái)就沒(méi)有Primer Premier 5.0 那么簡(jiǎn)便。先用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)，然后把設(shè)計(jì)好的引物拿到 Oligo 里去檢測(cè)這對(duì)引物的優(yōu)劣，我想這 對(duì)大多數(shù)引物設(shè)計(jì)者是一個(gè)不錯(cuò)的選擇！本實(shí)驗(yàn)心得來(lái)自丁香園論壇，查看原帖 分享到網(wǎng)友評(píng)論補(bǔ)充一：具體說(shuō)一下引物中 GC 含量問(wèn)題引物的 GC 含量一般為 40-60% ，以 45-55 為宜，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高， 導(dǎo)致引物的 GC 含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近（上下游引物的 GC 含量不能相差太大） ，以有利于退火溫度的選擇。

39、如果 G-C比例超出，則在引物的 5'端增加As或Ts；而如果A-T比例過(guò)高，則同樣在5端增加Gs 或 Cs 。但也有認(rèn)為：原來(lái)普遍認(rèn)為PCR 引物應(yīng)當(dāng)有50%的 GC/AT 比率的觀點(diǎn)其實(shí)是不對(duì)的，以人基因組DNA 為模板，用 81%AT 的引物可以產(chǎn)生單一的、專一的、長(zhǎng)250bp ，含有70% AT 的產(chǎn)物。完全沒(méi)有必要復(fù)雜地去計(jì)算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度， PCR 引物的 GC/AT 比率應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓?GC/AT 比。發(fā)表于2014-12-18您無(wú)權(quán)限看這個(gè)帖子，您的積分需要大于5 如何獲得積分？發(fā)表于2014-12-18補(bǔ)充二：b關(guān)于自由能問(wèn)題（如何根據(jù)自由能判斷

40、引物質(zhì)量）/b1、AG值（自由能）反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，物物白U G值最好呈正弦曲線形狀，即5'端和中間A G值較高，而3'端A G值相對(duì)較低，且不要超過(guò)9 （AG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。3的末端雙鏈的A G是02kcal/mol時(shí)， PCR 產(chǎn)量幾乎達(dá)到百分之百，隨著其絕對(duì)值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在 6 時(shí)只有 40% 、 到 8 時(shí)少于 20%、 而 10 時(shí)接近于0。 2、 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過(guò)4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進(jìn)行，與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布， 3 端的連續(xù) GGG 或 CCC 會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。 二聚體形成 的能值越高越穩(wěn)定， 越不符合要求。 與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能