熱力滅菌工藝的微生物學(xué)驗(yàn)證

1、熱力滅菌工藝的微生物學(xué)驗(yàn)證注射劑無(wú)菌保證工藝研究及評(píng)價(jià)的原則要求注射劑無(wú)菌保證工藝是指為實(shí)現(xiàn)規(guī)定的無(wú)菌保證水平所采取的經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證后的滅菌（無(wú)菌）生產(chǎn)工藝。目前，注射劑的無(wú)菌保證工藝主要有cmcm兩種:1 終端滅菌工藝：在控制微生物污染量的基礎(chǔ)上，在藥品灌封后，通過(guò)濕熱滅菌方式除菌。一般來(lái)說(shuō)，本方法成本低，無(wú)菌保證水平高，適宜 于大容量注射劑和小容量注射劑的滅菌。uy2無(wú)菌生產(chǎn)工藝：在無(wú)菌系統(tǒng)環(huán)境下，通過(guò)除菌過(guò)濾法或無(wú)菌操作法,以防止污染為目的，消除導(dǎo)致污染的各種可能性來(lái)保證無(wú)菌水平。一般來(lái) 說(shuō)，由于本方法對(duì)環(huán)境系統(tǒng)的要求高，且影響無(wú)菌操作的因素多而使得無(wú)保證水平比終端滅菌工藝低。無(wú)菌生產(chǎn)工藝

2、一般適宜于粉針劑，亦可適 宜于臨床需要但不能進(jìn)行終端滅菌的小容量注射劑。由此，終端滅菌工藝和無(wú)菌生產(chǎn)工藝具有不同的系統(tǒng)要求、不同的除方法和不同的無(wú)菌保證結(jié)果。評(píng)價(jià)無(wú)菌保證工藝是否有效曾一度主要通過(guò)對(duì)終產(chǎn)品抽樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)來(lái)判斷；由于微生物在產(chǎn)品中的分布是不均勻的，且抽檢樣品的數(shù)量有 限，故抽檢的結(jié)果不能真實(shí)代表整批產(chǎn)品的無(wú)菌狀態(tài)。國(guó)際上更為注重?zé)o保證工藝的設(shè)計(jì)是否合理、所用的設(shè)備與工藝是否經(jīng)過(guò)充分的驗(yàn)證，在 此基礎(chǔ)上，切實(shí)按照驗(yàn)證后的工藝進(jìn)行生產(chǎn)，這樣才能保證滅菌（無(wú)菌） 工藝的可靠性。在業(yè)界，常用"無(wú)菌保證水平” （sterility assurance level,sal）概念

3、來(lái)評(píng)價(jià)滅菌（無(wú)菌）工藝的效果，sal的定義為產(chǎn)品經(jīng)滅菌/除菌后微生物 殘存的概率。該值越小，表明產(chǎn)品中微生物存在的概率越小。為了保證注 射劑的無(wú)菌安全性，國(guó)際上一致規(guī)定，采用濕熱滅菌法的sal不得大于106,即滅菌后微生物存活的概率不得大于百萬(wàn)分之一；而采用無(wú)菌生產(chǎn)工 藝的產(chǎn)品，其sal 般只能達(dá)到10二故僅限于臨床必需注射給藥而確實(shí)無(wú)法耐受終端滅菌的產(chǎn)品。無(wú)菌生產(chǎn)工藝只適用于粉針劑或部分小容量注 射劑。、注射劑劑型選擇的原則從無(wú)菌保證水平的角度考慮，注射劑劑型選擇的一般原則如下:1.首先要考慮被選劑型可采用的滅菌工藝的無(wú)菌保證水平的高低。原 則上首選劑型應(yīng)能采用終端滅菌工藝(f0>8)

4、,以保證sal<10 6o2.對(duì)于有充分的依據(jù)證明不適宜采用終端滅菌工藝(f0>8)且臨床必需注射給藥的品種，可考慮選擇采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝的劑型。通常無(wú)菌生產(chǎn) 工藝僅限于粉針劑或部分小容量注射劑o二、無(wú)菌保證工藝的技術(shù)要求1.大容量注射劑(1) 應(yīng)采取終端滅菌工藝，建議首選過(guò)度殺滅法(f0212),如產(chǎn)品不能耐受過(guò)度殺滅的條件，可考慮采用殘存概率法(8<f0<12),但均應(yīng)保證 產(chǎn)品滅菌后的sal不大于io %釆用其它f0值小于8的終端滅菌條件的工藝，原則上不予認(rèn)可。(2) 如產(chǎn)品不能耐受終端滅菌工藝條件，應(yīng)盡量?jī)?yōu)化處方工藝，以改善制劑的耐熱性。如確實(shí)無(wú)法耐受，則應(yīng)考慮選

5、擇其他劑型，而非大容 量注射劑。(3) 工藝驗(yàn)證：應(yīng)進(jìn)行規(guī)范的滅菌工藝驗(yàn)證，部分驗(yàn)證工作可結(jié)合生產(chǎn)線驗(yàn)證一并進(jìn)行。主要包括以下試驗(yàn): 滅菌前微生物污染水平測(cè)定，包括滅菌前產(chǎn)品中的污染菌及其耐熱性d值的測(cè)定； 熱穿透試驗(yàn); 微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)：所用生物指示劑的耐熱性及數(shù)量應(yīng)對(duì)滅菌工藝構(gòu)成必要的挑戰(zhàn)，生物指示劑的耐熱性應(yīng)大于產(chǎn)品中常見(jiàn)污染菌的耐熱性。2.粉針劑采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝的粉針劑，應(yīng)能保證sal不大于10=這主要依賴(lài)于無(wú)菌生產(chǎn)工藝是否嚴(yán)格按照藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（gmp）的要求進(jìn)行 生產(chǎn)與驗(yàn)證。（1）凍干粉針劑凍干粉針劑無(wú)菌生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證中的設(shè)備驗(yàn)證、環(huán)境監(jiān)測(cè)是凍干粉針劑生產(chǎn)線gmp要求的常規(guī)內(nèi)容

6、；培養(yǎng)基灌裝驗(yàn)證是對(duì)設(shè)備、環(huán)境以及人 員操作的一種系統(tǒng)驗(yàn)證，是判斷無(wú)菌保證水平的關(guān)鍵手段。常規(guī)的工藝驗(yàn)證試驗(yàn)包括: 培養(yǎng)基模擬灌裝驗(yàn)證試驗(yàn)：最少在線灌裝三批，每批的批量詳見(jiàn)附表，每瓶產(chǎn)品均應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查，判斷該試驗(yàn)是否合格的標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附表。除菌過(guò)濾系統(tǒng)適應(yīng)性驗(yàn)證試驗(yàn)：包括過(guò)濾系統(tǒng)相容性測(cè)試、過(guò)濾前后濾膜完整性測(cè)試、濾膜的微生物截留量測(cè)試。（2）無(wú)菌分裝粉針劑無(wú)菌分裝粉針劑的質(zhì)量保證主要依賴(lài)于無(wú)菌生產(chǎn)線的基本條件和對(duì)生產(chǎn)工藝各環(huán)節(jié)嚴(yán)格的質(zhì)量控制。生產(chǎn)工藝的控制和驗(yàn)證要求對(duì)不同的無(wú) 分裝產(chǎn)品是一致的。嚴(yán)格執(zhí)行g(shù)mp的有關(guān)要求，是無(wú)菌粉針劑生產(chǎn)的重 要質(zhì)量保證。工藝驗(yàn)證工作主要為培養(yǎng)基灌裝驗(yàn)證試驗(yàn)。灌裝

7、的批數(shù)、批量與合格標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)附表。對(duì)于同時(shí)申報(bào)無(wú)菌分裝用原料藥的產(chǎn)品，需關(guān)注原料藥精制、干燥.包裝應(yīng)在百級(jí)環(huán)境下進(jìn)行。如涉及無(wú)菌分裝用輔料，技術(shù)要求同前。3小容量注射劑（1）應(yīng)首選終端滅菌工藝，相關(guān)技術(shù)要求同大容量注射劑。（2）如有充分的依據(jù)證明不能采用終端滅菌工藝的品種，且為臨床必需注射給藥的品種，可考慮采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝，相關(guān)技術(shù)要求同凍干粉針 劑。(3)對(duì)于過(guò)濾除菌工藝同時(shí)采用了流通蒸汽輔助滅菌的品種，建議修改為終端滅菌工藝，技術(shù)要求同大容量注射劑；對(duì)確實(shí)無(wú)法采用終端滅工藝的品種，應(yīng)修改為無(wú)菌生產(chǎn)工藝，技術(shù)要求同凍干粉針劑。對(duì)于采用無(wú)菌生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的小容量注射劑，生產(chǎn)線的驗(yàn)證應(yīng)結(jié)合無(wú)生產(chǎn)工藝進(jìn)

8、行。三、其它相關(guān)要求1在劑型選擇的研究中，為判斷滅菌工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，應(yīng)進(jìn)行滅菌前后產(chǎn)品質(zhì)量對(duì)比的研究，且應(yīng)注意考察條件和方法的合理性，考察項(xiàng)目需全面，相關(guān)分析方法需驗(yàn)證。同時(shí)研究用樣品應(yīng)具有代表性。2 容器的密封性對(duì)于無(wú)菌產(chǎn)品在有效期內(nèi)保持無(wú)菌性能具有重要作用，故非常有必要推動(dòng)此項(xiàng)工作，建議申報(bào)單位在工藝研究.包裝材料的 選擇以及穩(wěn)定性研究中，加強(qiáng)容器密封性的考察。、專(zhuān)業(yè)名詞1 滅菌工藝:是指通過(guò)適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段，將一定數(shù)量的活性微生物完全殺滅, 并且使其生命活動(dòng)不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程。目前在制藥工業(yè)中，滅菌就是使一批 產(chǎn)品中的非無(wú)菌品 符合一定的概率要求(不超過(guò)百萬(wàn)分之一)。2生物指示劑簡(jiǎn)

9、稱(chēng)為bi：是對(duì)特定滅菌工藝具有一定耐受性并且能夠定量測(cè)定滅菌效力的微生物制劑。3 帶菌量:原材料、半成品及成品中所有微生物含量的總和。這里專(zhuān)指滅菌前半成品中的微生物含量。4 無(wú)菌保證值（sal）：批無(wú)菌品中非無(wú)菌品概率的負(fù)對(duì)數(shù)，通常規(guī)定為大于等于6。即每批產(chǎn)品中非無(wú)菌產(chǎn)品的概率應(yīng)小于百萬(wàn)分之一（w106）。sal = -lg（微生物存活概率）在一定溫度下將微生物數(shù)量殺滅90%或下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位所需要的時(shí) 間。6z值：滅菌溫度系數(shù)即指使微生物d值改變（增加或減少）一個(gè)對(duì)數(shù)單位時(shí)，溫度應(yīng)變化（降 低或升高）的度數(shù)。是耐熱曲線或熱致死時(shí)間曲線斜率的負(fù)倒數(shù),7.ft： t°c滅菌時(shí)間指滅菌程

10、序賦予被滅菌品在t°c下的等效滅菌時(shí)間。8.f0：標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間% £3將121 °c作為標(biāo)準(zhǔn)滅菌溫度，當(dāng)z設(shè)定為10°c時(shí)，滅菌程序賦予被滅品121°c下的等效滅菌時(shí)間。二.熱力學(xué)滅菌工藝的基本原理（一）、熱對(duì)微生物細(xì)胞的效應(yīng)熱力學(xué)滅菌是使用最普遍并且研究最為徹底的滅菌方式。當(dāng)溫度超過(guò)細(xì)胞的生理活動(dòng)所需的溫度范圍時(shí)，細(xì)胞代謝就會(huì)減緩，并最終導(dǎo)致停止生長(zhǎng)及繁殖。一旦溫度超過(guò)上限，微生物細(xì)胞中主要的蛋白質(zhì)、酶及核酸便會(huì)被永久性破壞，細(xì)胞膜被融解，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的死亡。不具備真正核膜結(jié)構(gòu)的原核細(xì)胞（如細(xì)菌和藍(lán)綠藻）最為耐熱。一般說(shuō)來(lái),微生物

11、的耐熱性可按下列順序排列(耐熱性從高到低):細(xì)菌芽胞酵母孔 及霉菌>革蘭陽(yáng)性細(xì)菌革蘭陰性細(xì)菌病毒。具備核膜結(jié)構(gòu)的真核微生物, 在60 80°c下就可被迅速殺滅。絕大多數(shù)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在45°c以上就ed不能生長(zhǎng)，80 100°c下就可被迅速殺滅，但是，某些嗜熱細(xì)菌甚至可在 80°c以上的高溫中生存。多數(shù)病毒是熱敏性的。cry需氧菌中的芽胞桿菌屬(bacillus)和厭氧菌中的梭狀芽胞桿菌屬(clostridium ),也具有較強(qiáng)的耐熱性。這些細(xì)菌的細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源性芽胞或胞間休眠休，它們一旦成熟，便會(huì)對(duì)熱、干燥及有害化學(xué)物質(zhì)等有較強(qiáng) 的抗性。要想使這

12、些芽胞在一分鐘內(nèi)死亡90%,則必須使干熱溫度在100-170°c之間或濕熱溫度在80-129°c之間才能達(dá)到這一目的。在這樣的溫度范圍內(nèi)，對(duì)芽胞的殺滅效果要相差約io?；騣o55倍。細(xì)菌芽胞的耐熱性與很多因素相關(guān)，芽胞形成時(shí)，細(xì)菌停止生化反應(yīng),并將遺傳物質(zhì)包于芽胞內(nèi)。隨之進(jìn)行一系列生物物理變化:細(xì)胞質(zhì)大量脫水 并體積減小，然后在縮小的原生質(zhì)體周?chē)纬梢粚雍駳?。此過(guò)程中形成了 一種名為卩比旋二竣酸或dpa(毗呢一 2,6 二竣酸)的特殊化學(xué)物質(zhì)。芽胞 形成階段，毗噪二竣酸鈣與dna以及細(xì)胞內(nèi)的酶形成復(fù)合物，以保護(hù)處 于惡劣環(huán)境中的芽胞。芽胞可以在休眠狀態(tài)下存活多年，一旦條件利

13、于萌 發(fā)，便可在幾分鐘內(nèi)恢復(fù)到生長(zhǎng)狀態(tài)。(二) 、影響滅菌效果的因素1 物理/化學(xué)條件在細(xì)菌芽胞形成期，環(huán)境因子會(huì)影響其耐熱性。例如，在較高溫度下生 長(zhǎng)，并且有二價(jià)陽(yáng)離子(如ca 2 fe2+> mg2 mn")存在時(shí)，可增強(qiáng)芽胞的耐熱性，當(dāng)ph值超出6.0 - 8.0的范圍時(shí)，或在芽胞形成環(huán)境中存在高濃度的鹽水或磷酸鹽，均會(huì)降低芽胞的耐熱性。成熟芽胞的耐熱性亦與環(huán)境條件相關(guān)，如溶液濃度.水活度，ph值或在環(huán)境中存在對(duì)芽胞造成物理性損傷或抑制其萌發(fā)的化學(xué)類(lèi)物質(zhì)，均會(huì)影響芽胞的耐熱性。如果芽胞是包裹在晶體或有機(jī)物內(nèi)，其耐熱性通常明顯高于非包裹性芽胞。2 濕度水在熱力殺滅細(xì)菌芽胞時(shí)

14、起著重要作用。濕熱和干熱滅菌均與水相關(guān),當(dāng)濕度達(dá)到飽和時(shí)相對(duì)濕度(rh)為100%,所進(jìn)行的熱滅菌方式稱(chēng)為濕熱滅菌；在其他相對(duì)濕度下進(jìn)行的滅菌都稱(chēng)為干熱滅菌?，F(xiàn)已知道，在90cmcm一 125°c之間，當(dāng)相對(duì)濕度在20% 50%時(shí)，細(xì)菌芽胞表現(xiàn)出最大的耐熱性，而當(dāng)相對(duì)濕度超出這一范圍時(shí)，芽胞的耐熱性將會(huì)迅速下降。3 微生物的熱致死特性通過(guò)一條半對(duì)數(shù)關(guān)系直線最能說(shuō)明微生物的熱致死性，直線的斜率隨著 溫度升高而增大。這就是說(shuō)，在特定溫度下，任一時(shí)間點(diǎn)的芽胞死亡特性 僅與這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的芽胞濃度相關(guān)。這種一級(jí)致死特性是原核細(xì)胞獨(dú)有的現(xiàn) 象。(三) 、熱力學(xué)滅菌工藝原理簡(jiǎn)介1 濕熱滅菌對(duì)于適宜采

15、濕熱滅菌方式的產(chǎn)品或物品濕熱滅菌是一種十分經(jīng)濟(jì)有效 的方法。通常情況下，濕熱滅菌是指采用一定壓力下的蒸氣進(jìn)行滅菌，也 采用過(guò)熱水噴淋或浸沒(méi)。水由液態(tài)變成氣態(tài)時(shí)，會(huì)吸收大量的熱能 (540cavg),氣態(tài)冷凝成液態(tài)時(shí)，會(huì)釋放相等的能量(即汽化熱)。蒸氣接觸 到溫度較低的物體就會(huì)釋放潛熱而凝結(jié)成水，直到此物體的溫度與蒸氣溫度相等?，F(xiàn)已明確，濕熱滅菌的效應(yīng)是導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵性蛋白質(zhì)和酶發(fā)生熱變性或凝固。濕度對(duì)該破壞性過(guò)程起促進(jìn)作用，這就是濕熱滅菌較干熱滅需要較低溫度的原因。2 干熱滅菌干熱滅菌是指在非飽和濕度下進(jìn)行的熱力學(xué)滅菌。干熱滅菌時(shí)的相對(duì)濕 度范圍可從99.9%至1%以下。干熱滅菌用加熱介質(zhì)就

16、是一定濕度條件下 的空氣，通過(guò)強(qiáng)制對(duì)流而運(yùn)動(dòng)。由于熱空氣會(huì)帶走水分，被滅菌物品v包括 芽胞）也會(huì)逐漸失水，從而使微生物的滅菌率也發(fā)生相應(yīng)的變化。ctu干熱滅菌與濕熱滅菌的動(dòng)力學(xué)特征相似，但反應(yīng)機(jī)制卻有所不同。干熱滅菌是使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性，這就是干熱滅菌之所以要求相si對(duì)較高溫度的原因。在制藥工業(yè)中，干熱滅菌被廣泛用于不耐受高壓蒸氣的熱穩(wěn)定性物品的滅菌。常用干熱進(jìn)行滅菌物品有：甘油、油類(lèi).凡士林、石蠟以及一些 粉狀藥品，如滑石粉、磺胺類(lèi)藥物以及玻璃容器和不銹鋼設(shè)備等。3 干熱去熱原革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖對(duì)人有毒性。只有當(dāng)細(xì)胞破裂或溶解 時(shí)，這種毒素才釋放出來(lái)，故稱(chēng)之為內(nèi)毒素。由于

17、低劑量?jī)?nèi)毒素注入人體 后便會(huì)導(dǎo)致發(fā)熱反應(yīng)，故而也稱(chēng)之為熱原。任何旨在去除產(chǎn)品中所含的脂 多糖的工藝過(guò)程均稱(chēng)為去熱原工藝。干熱是去熱原最為有效的方法之一。去熱原要求的溫度很高，如170-250°c,甚至更高。在170°c下去熱原速度很慢，需約30分鐘方能使純內(nèi)毒素下降1個(gè)對(duì)數(shù)單位，而在250°c下達(dá)到同樣效果則僅需9秒。對(duì)干熱去熱原工藝進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，通常直接向待去熱原物品中加人已知最的內(nèi)毒 素。然后證明該工藝能使標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素至少下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位。（四）、無(wú)菌的影響因素?zé)o菌是一個(gè)概率函數(shù)，它的影響因素可用下式表示：pnsu=n（） dr其中，pnsu指非無(wú)菌品概率；no指

18、滅菌前產(chǎn)品的污染水平；dr指滅&時(shí)的殺滅水平。最終產(chǎn)品的無(wú)菌質(zhì)量取決于兩個(gè)因素:滅菌前的含菌量控制及滅菌工藝的殺滅效果。（五）、熱力學(xué)滅菌的動(dòng)力學(xué)原理根據(jù)質(zhì)量作用定律，在恒定溫度及保持其他條件不變的情況下，單位時(shí)間內(nèi)被殺滅的微生物數(shù)正比于to時(shí)原有的數(shù)目，即dn/dt=k（no-nk） 式中，no為t=0時(shí)，存活的微生物數(shù)；nk為t時(shí)被殺滅的微生物數(shù)；n 為t時(shí)存活的微生物數(shù)。將上式積分得到:ignt =lgn0-(k/2.303)t熱滅菌方式下，微生物的死亡是呈幾何級(jí)數(shù)變化的，在半對(duì)數(shù)圖紙上作圖，可以得到一條相對(duì)比較準(zhǔn)確的直線。數(shù)與滅菌時(shí)間的關(guān)系1.d值(對(duì)數(shù)下降值)d值是指在特定滅

19、菌條件下，使微生物數(shù)量下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位或減少90%所需的時(shí)間。它是分析滅菌工藝效果的重要生物學(xué)參數(shù)。并且其數(shù)值可通過(guò)殘存曲線法或陰性分?jǐn)?shù)法加以確定。lgn0-lgnt=lgn()/ nt=t(k / 2.303)=100 = 1，所以d=t=2.303 / k.即,d是直線斜率的負(fù)倒數(shù)。d值越大，該溫度下微生物的耐熱性就越強(qiáng)，在滅菌中就越難殺滅。tf21p下的暴熱時(shí)間(mm)殘存砲于數(shù)的對(duì)數(shù)值對(duì)某一種微生物而言，在其他條件保持不變的情況下，d值隨滅菌溫度的變化而變化。滅菌溫度升高時(shí)，直線方程的斜率變大，即使微生物殺滅90%所需的時(shí)間就短。圖37 d值與滅菌溫度關(guān)系在121°c下的d值

20、在153min之間。不同溫度下，不同的微生物在不同的環(huán)境條件下具有各不相同的d值。微生物名稱(chēng)溫度/c介質(zhì)d值/min微生物名稱(chēng)溫度/ °c介質(zhì)d值/min嗜熱脂肪桿菌105葡萄糖87.8嗜熱脂肪桿菌121注射用水3.0嗜熱脂肪桿菌110葡萄糖32.0梭狀芽抱桿菌105葡萄糖13嗜熱脂肪桿菌115葡萄糖11.7梭狀芽抱桿菌105注射用水13.7嗜熱脂肪桿菌121葡萄糖2.4梭狀芽抱桿菌105注射用水2.1嗜熱脂肪桿菌121葡萄糖乳酸林格液2.1不同滅菌溫度下的d值表32.d值測(cè)定法殘存曲線法該法至少需要測(cè)試兩個(gè)樣品，分別在設(shè)定溫度下（如121°c）暴熱不同時(shí)間。測(cè)定每個(gè)熱處理

21、樣品及未經(jīng)熱處理的對(duì)照樣品中微生物含量?？刹捎闷矫笥?jì)數(shù)法或經(jīng)薄膜過(guò)濾并置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基表面培養(yǎng)。培養(yǎng)終了時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)樣品中的殘存微生物（ns），再將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值取常用對(duì)數(shù)（仗）， 并對(duì)相應(yīng)的曝?zé)釙r(shí)間u（以分鐘為單位）作圖，可得到存活曲線。在殘存曲線上，以一個(gè)對(duì)數(shù)單位的間隔點(diǎn)分別作與x軸和y軸相平行的直線，就可估測(cè)出d值；或是用下式計(jì)算:d12rc=u/（lgn0-lgns）o設(shè)在d值測(cè)定中，曝?zé)?min, lgn0為5, igns為2,則d121°c=5 / (52) = l7min。d值為存活曲線斜率的負(fù)倒數(shù)（一1/k）o因此，d值可在存活曲線的直線段，用最小二次方線性回歸分析

22、法求得5?廠-匕“式中，口為曝?zé)釙r(shí)間（min）： y為曝?zé)釛l件下存活菌落數(shù)的平均值;n指實(shí)驗(yàn)組數(shù)。*試驗(yàn)所用儀器應(yīng)能保持恒溫并迅速升溫，如生物指示劑耐熱性測(cè)定儀或毛細(xì)管一油浴測(cè)定法。陰性分?jǐn)?shù)法(不生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)法)一種稱(chēng)最可能數(shù)測(cè)定法(most probable number method),僅需一次加熱就可估算出d值。將一組樣品(至少10個(gè)樣本)置于設(shè)定滅菌溫度下,加熱到設(shè)定時(shí)間后，取出并分別作無(wú)菌檢查。該方法檢測(cè)靈敏度高于平板nito計(jì)數(shù)法。假設(shè)條件是微生物存活數(shù)從n。到滅菌終點(diǎn)始終與曝?zé)釙r(shí)間呈線性關(guān)系(對(duì)數(shù)規(guī)則)。在溫度t下，dt=u /lg1()no-lg2.3o31glo(n / q),式

23、中n樣品總數(shù)，q曝?zé)崽幚砗蟮臒o(wú)菌樣品數(shù)。另一種方法實(shí)驗(yàn)時(shí)每組至少需要10個(gè)樣品，將其置于預(yù)定溫度下，設(shè)置 不同的曝?zé)釙r(shí)間，但曝?zé)岬臅r(shí)間間隔相同，熱處理后，將樣品取出，放人 無(wú)菌液體培養(yǎng)基中，于適宜溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，記錄每組樣品中沒(méi) 有微生物生長(zhǎng)的樣品數(shù)。通過(guò)陰性分?jǐn)?shù)法估算d值【每組中無(wú)微生物生長(zhǎng)樣品數(shù)e (f) /每組樣品數(shù)(n)伽121 r下的暴熱時(shí)間(血)3579111315170/100/101/103/105/107/1c10/1010/10f0i35710選擇全部生長(zhǎng)組(0/10)中暴熱時(shí)間最長(zhǎng)者到全部不生長(zhǎng)組(10/10)中暴熱時(shí)間最短者之間的的數(shù)據(jù)計(jì)算d值。從表中可知，本次

24、試驗(yàn)中的兩個(gè)時(shí).5111間分別是5分鐘和15分鐘。芽胞完全殺滅(殘存芽胞數(shù)小于1)時(shí)間(t)可用下式計(jì)t=tk-d/2-(d/10xef)，其中，tk指陰性分?jǐn)?shù)范圍的下限(全部不生 長(zhǎng)微生物所需最短時(shí)間)，d指暴熱時(shí)間間隔。由表121數(shù)據(jù)計(jì)算，得到：t=15-2/2-(2/10 x 26) = 8.8分鐘然后，按下式計(jì)算d值：d=t/ (lg10no十0.2507),假設(shè)n0=105,則d=8.8/ (5+0.2507)=1.7 分鐘3.z值滅菌溫度系數(shù)z值系指使某一種微生物的d值變化一個(gè)對(duì)數(shù)單位或90%時(shí)，所需要的溫度變化值，它是制藥業(yè)滅菌工藝設(shè)計(jì)及過(guò)程監(jiān)控中的一個(gè)常用參數(shù)。在濕熱滅菌條件下

25、，實(shí)驗(yàn)測(cè)得細(xì)菌芽胞的z值在8-12ec之間，但計(jì)算滅菌率 時(shí)，z通常取10°c；而在干熱滅菌條件下，z通常取20°c。分別測(cè)定同一種微生物在不同溫度下(其他實(shí)驗(yàn)條件相同)的d值，以log10d與對(duì)應(yīng)溫度作圖，就可以得到一條直線。此直線斜率的負(fù)倒數(shù)即為溫度系數(shù)值，它反映了微生物的致死性隨溫度變化的特性。z值也可用 下式計(jì)算:z= (t2t|)/logio (d2/d)其中,di指溫度為ti時(shí)的d值，d2指溫度為t2時(shí)的d值。不同的微生物抱子，在不同的溶液中有各不相同的z值。同種抱子的z值 在不同溶液中亦有差異。嗜熱脂肪桿菌在不同溶液中的z值。10.38.4溶液葡萄糖水溶液注射

26、用水葡萄糖乳酸林格氏液ph7磷酸鹽緩沖液7.6平均在沒(méi)有特定要求時(shí)，z值通常都取10,以簡(jiǎn)化計(jì)算。z值被用于定量地描述抱子對(duì)滅菌溫度變化的敏感程度，z值越大，抱子對(duì)溫度變化的敏感性越弱，此時(shí)，企圖通過(guò)升高滅菌溫度的方式來(lái)加速殺滅微生物的收效hjz值與滅mfllt的艾系如果z = 10°c,貝!j1100c下的d值為1899min。z=7°c時(shí)，直線的斜率增大，此時(shí)d值升到57. 67mino當(dāng)z=12°c時(shí)，情況正相反，d值降至 1238min。當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，這3種微就不明顯。滅菌溫度/°cz=7°cz = 10°cz = 12&

27、#176;cd / mimigdd / mimigdd / mimigd105300.002.47760.001.77832.611.51311057. 691.76118.991.27812.401.09311510.971.0335.970.7764.750.6761202.080.3181.890.2761.820.2601211.500.1761.500.1761.500.176z值與滅菌溫度關(guān)系圖生物抱子相應(yīng)d值變化幅度隨z值的增大而減少的趨勢(shì)是顯而易見(jiàn)的。4. ft 值一t(°c)滅菌時(shí)間ft值指t(°c)滅菌值，系指一個(gè)給定z值下，滅菌程序在溫度t(°

28、;c)下的等效滅菌時(shí)間。ft=dtxalgn中，dt為在t(°c)下微生物 的d值；algn為t(°c)下滅菌程序使微生物數(shù)下降的對(duì)數(shù)單位數(shù)。當(dāng)algn=1時(shí)ft=dt，當(dāng)藥液滅菌前微生物總數(shù)為no時(shí)，則在t(°c)將其全部殺滅至10°所需的時(shí)間為ft=dtxlgn0o因此可以把ft理解為t(°c)滅菌值, 即滅菌程序賦予被滅菌品在t(°c)下的滅菌時(shí)間。由于d值隨滅菌溫度的變化而變化，所以不同溫度下達(dá)到相同滅菌效果時(shí)，ft值將隨d值變化而變化。滅菌溫度高時(shí)，所需的t(°c)滅菌時(shí)間 就短；滅菌溫度較低時(shí)，則所需的t(

29、76;c)滅菌時(shí)間就長(zhǎng)。5. fo值標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間系滅菌過(guò)程賦予一個(gè)產(chǎn)品121°c下的等效滅菌時(shí)間(z = 10°c作為參照標(biāo)準(zhǔn))。對(duì)于干熱滅菌而言，標(biāo)準(zhǔn)參照溫度為170°c滅菌值記作fh。6 滅菌率l指在某一溫度t(°c)下滅菌lmin所獲得的標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間。l沒(méi)有單位。如果己知(實(shí)驗(yàn)條件下)某微生物的z值，那么滅菌率:l=d/d121c =10(仆冬匚指各個(gè)滅菌時(shí)段的溫度，標(biāo)準(zhǔn)參照溫度(12fc),常取z=10°cof0=d|2irxalgn, ft=dtxalgn,達(dá)到同樣滅菌效果時(shí)，algn等值，所以 f（）/ ft=d2i，c / dtz

30、=10°c時(shí)不同溫度下的滅菌率和121°c下滅菌lmin時(shí)所相當(dāng)?shù)膖(°c)滅菌時(shí)間滅菌溫度ex滅菌率l=f0/ft = d121c / dt1221.261200.7941180.5011160.3161140.1991120.126116°c下滅菌lmin對(duì)芽抱殺滅效果只有標(biāo)準(zhǔn)滅菌狀態(tài)下的32%； 110°c下1 min,僅為標(biāo)準(zhǔn)滅菌狀態(tài)下的7.9%； 121°c下滅菌lmin相當(dāng)于110°c下滅菌12. 6min，112°c 下滅菌7 943min； 114°c 下滅菌5 012mino 7.滅菌值

31、（f值）計(jì)算實(shí)踐中，可用滅菌率計(jì)算ft值（或滅菌程序的滅菌值）。ft=（10 （t°-tn）/z dt,也可根據(jù)梯形規(guī)則，將整個(gè)滅菌過(guò)程（包括升溫、保溫和冷卻階段）的滅菌 率累加，從而估算出某滅菌程序在標(biāo)準(zhǔn)溫度下的等效滅菌時(shí)間：ft=at（l1/2+l2+l3+.+ln_1+ln/2） , at指測(cè)量溫度的時(shí)間間隔。每?jī)纱螠y(cè)量溫度的時(shí)間間隔必須相同。在初始及結(jié)束時(shí)間段的滅菌率非常小，可將公式簡(jiǎn)化為 sfrr=atlo 由 fy=(lgnolgnt)dt，ft/ dt =lgn°lgny,則 lgny =lgn0-ft/dto根據(jù)滅菌設(shè)備內(nèi)溫度監(jiān)控系統(tǒng)所測(cè)得的物理參數(shù)，可利用

32、該公式來(lái)估測(cè)某滅菌程序?qū)ξ⑸锏臍缧Ч?。此時(shí)，dt表示某實(shí)際微 生物（待滅菌物品中的污染菌）或假設(shè)的微生物（生物指示劑）在t°c下的d 值。例如，假設(shè)f。為8分鐘，耐熱芽胞的dt分=05分鐘，數(shù)量為10訂由 公式可以得出在滅菌結(jié)束時(shí)，芽胞的殘存數(shù)量（pusn）為10川。lgnr=68/05=10,在整個(gè)滅菌過(guò)程中，芽胞數(shù)量的對(duì)數(shù)下降:slr=lgno-lgnt=ft / dt =6(10) =8/0.5=16。一、定義生物指示劑生物指示劑，簡(jiǎn)稱(chēng)為bi,是對(duì)特定滅菌工藝具有一定耐受性并且能夠定量測(cè)定滅菌效力的微生物制劑，適用于制備生物指示劑的微生物多為芽胞類(lèi)細(xì)菌，這是因?yàn)椋椛錅缇?/p>

33、外，芽胞類(lèi)細(xì)菌比常規(guī)的生長(zhǎng)態(tài)微生物cm對(duì)滅菌工藝具有更強(qiáng)的耐受性。生物指示劑既可用來(lái)測(cè)定一個(gè)給定的滅工藝條件的滅菌效果，也可判別它是否符合無(wú)菌保證要求。將測(cè)溫探頭置于被滅菌物品內(nèi)，可獲得良多有價(jià)值的數(shù)據(jù)。盡管可用熱穿透數(shù)據(jù)來(lái)估測(cè)滅菌程序?qū)ξ⑸锏闹滤佬?，但采用生物指示劑做?duì)照試驗(yàn)，進(jìn)行完全或部分殺滅，是評(píng)判一個(gè)滅菌程序有效性的直接方法而且cm也是最佳方法。生物指示劑有不同的形式，可將細(xì)菌芽胞置于濾紙.玻璃纖維或不銹鋼等載體上，或直接接種到產(chǎn)品中。通常，當(dāng)芽胞接種到液體產(chǎn)品時(shí)，其耐熱性會(huì)有所增強(qiáng)或降低;而有時(shí)所用耐熱芽胞與產(chǎn)品不相適應(yīng)。如碰到后1=1一情況，可用生理鹽水或其他溶液代替產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

34、，但必須保證所用的替代品與產(chǎn)品具有相似的物理和化學(xué)性質(zhì)（如粘度和ph）,并且耐熱芽胞在替代品中的d值不得小于在產(chǎn)品中的d值。二、組成形式常用于滅菌工藝驗(yàn)證的生物指示劑主要有三種形式，它們都是用對(duì)特定滅菌工藝具有一定耐受性并已知其種類(lèi)的微生物芽胞制備而成。（一）芽胞條 將芽胞加在載體上，如接種于濾紙片.玻璃1塑料等薄片或條狀物，并用特定的材料包起來(lái)以保持其完整性和生物活性，俗稱(chēng)芽胞條。此類(lèi)指示劑比較適用于驗(yàn)證和監(jiān)控非溶液類(lèi)物品的滅菌工藝。（二）芽胞懸浮液 芽胞懸浮液可被接種于代表性的待滅菌產(chǎn)品溶液或模擬產(chǎn)品溶液中?？捎么搜堪麘腋∫褐苯咏臃N于產(chǎn)品內(nèi)或產(chǎn)品外表面, 這樣能更加直觀地考察產(chǎn)品的實(shí)際滅菌

35、效果;如果芽胞懸浮液不宜被直接 接種于產(chǎn)品內(nèi)（或外），則可用模擬產(chǎn)品替代，但要注意的是，芽胞在模擬 產(chǎn)品內(nèi)（或外）的耐熱性不得比在實(shí)際產(chǎn)品內(nèi)的低，否則將影響到滅菌工藝 驗(yàn)證或日常監(jiān)控的可靠性。因此，在使用此類(lèi)生物指示劑之前，務(wù)必側(cè)定 芽艷在產(chǎn)品或模擬產(chǎn)品內(nèi)（或外）的數(shù)量，d值、z值以及存活時(shí)間和死亡 時(shí)間。（三）自含型生物指示劑 這種指示劑的一種形式是將芽胞條（或片）加人到含有指示劑的培養(yǎng)基包裝內(nèi)（如：小瓶?jī)?nèi)），這些培養(yǎng)基事先單獨(dú)包裝 井與芽胞載體分離，經(jīng)滅菌處理后，擠碎培養(yǎng)基小瓶使芽地條（或片）浸沒(méi) 在培養(yǎng)基內(nèi)，在適當(dāng)溫度和時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)，通過(guò)觀察培養(yǎng)基內(nèi)的酸堿指示劑 的顏色變化判斷其生長(zhǎng)狀況;

36、另一種形式是將芽胞直接接種在含有指示劑 的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)的微生物使ph值發(fā)生變化，引起顏色變化來(lái) 以指示是否有微生物生長(zhǎng)。自含型生物指示劑的耐熱性與其載體、包裝的 材質(zhì).結(jié)構(gòu)有很大的相關(guān)性；生物指示劑的包裝要易于殺菌劑透過(guò)、因此,側(cè)定d值時(shí)務(wù)必要考慮這些因素，尤其是包裝可能會(huì)引起殺菌效來(lái)的滯后.因此，不能僅側(cè)定芽胞條（或片）的d值。當(dāng)生物指示劑經(jīng)受挑戰(zhàn)試驗(yàn)后，宜在4小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)。從質(zhì)量保證角度來(lái)看，我們應(yīng)當(dāng)盡可能地在較短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)經(jīng)受挑戰(zhàn)后的生物指示劑。每 個(gè)企業(yè)應(yīng)根據(jù)自身的條件和特點(diǎn)制定適當(dāng)?shù)臅r(shí)間限度。有兩種方法可用來(lái)判斷生物指示劑的芽胞生長(zhǎng)狀況，一種是通過(guò)肉眼觀察培養(yǎng)基的顏色變化（酸

37、堿指示劑）或濁度變化來(lái)判斷是否呈陽(yáng)性;另一種則是借助于相差顯微鏡觀察，在相差顯微鏡的視野中，生長(zhǎng)態(tài)細(xì)胞呈現(xiàn)暗色，而芽胞則呈現(xiàn)亮色。對(duì)一特定的滅菌工藝而言，盡可能購(gòu)買(mǎi)同一類(lèi)型的生物指示劑，這樣可以大大減少實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)在生物指示劑的質(zhì)量復(fù)核及滅菌工藝驗(yàn)證評(píng)價(jià)方 面的工作量。三.制備如必要用環(huán)境中的分離菌來(lái)驗(yàn)證滅菌程序時(shí)，有條件的微生物實(shí)驗(yàn)室可自行制備生物指示劑，包括選種、大規(guī)模芽胞培養(yǎng)、收集芽胞、純化和保藏等。cm種儲(chǔ)備液內(nèi)不得含有營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)以保證芽胞始終處于休眠狀態(tài)0對(duì)自制生物指示劑芽胞的貯存條件和貯存時(shí)間應(yīng)予驗(yàn)證，以確保芽胞數(shù)量 和d值的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)室自制生物指示劑時(shí)，應(yīng)按生物指示劑生產(chǎn)商的規(guī)范

38、要求制備生物 指示劑。有關(guān)生物指示劑的記錄均應(yīng)具有可追溯性，如種源.轉(zhuǎn)種時(shí)間、 傳代代數(shù)、培養(yǎng)及制芽胞用培養(yǎng)基和芽胞收集前后的熱處理方式等。參照 實(shí)驗(yàn)室菌種制備、保藏和使用要求管理滅菌工藝用生物指示劑。四、生物指示劑的選擇和使用一種生物指示劑不是萬(wàn)能的，要根據(jù)滅菌方式及工藝條件選擇適當(dāng)?shù)纳?物指示劑。事先要了解生物指示劑對(duì)相關(guān)滅菌工藝的耐受性能，以保證所 用生物指示劑的挑戰(zhàn)性大于自然存在于產(chǎn)品內(nèi)（或外）的微生物的挑戰(zhàn)性。生物指示劑對(duì)滅菌工藝的耐受性，不僅取決于生物指示劑本身，而且也取決于滅菌時(shí)其所處的環(huán)境條件，如生物指示劑包裝材料對(duì)殺菌劑的穿 透效果，芽胞溶液的ph值.粘度、金屬離子的濃度等都

39、是生物指示劑耐 受性的主要影響因素。為了確保生物指示劑在產(chǎn)品滅菌程序開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和 日常監(jiān)控中的有效使用，務(wù)必要充分了解相關(guān)產(chǎn)品的組分及其包裝材料的cry性能。需要確保所用生物指示劑賦予產(chǎn)品滅菌工藝的挑戰(zhàn)效果大于產(chǎn)品中 實(shí)際污染菌的挑戰(zhàn)性。如果因產(chǎn)品對(duì)滅菌條件敏感而無(wú)法采用過(guò)度滅菌工藝，則要根據(jù)滅菌前產(chǎn)品的含菌量資料來(lái)制定合理的滅菌工藝條件和選擇適當(dāng)?shù)纳镏甘緞缇に囬_(kāi)發(fā)x確立滅菌終點(diǎn)任何滅菌工藝的目的都是為了完全殺滅所有微生物。但是，從微生物死亡的概率特性以及低污染水平下的檢測(cè)難度來(lái)看，無(wú)法證明一個(gè)滅菌程 序已將所有的微生物都?xì)缌?。那么，又該如何確定滅菌終點(diǎn)呢?無(wú)菌定義 為:使微生物的殘

40、存概率下降到10°,并在此基礎(chǔ)上再下降6個(gè)對(duì)數(shù)單位(即 微生物的殘存概率不超過(guò)1/百萬(wàn)，或pnsuio 6)滅菌過(guò)程中所產(chǎn)生的各項(xiàng)物理和生物學(xué)參數(shù)應(yīng)能保證其滅菌效果達(dá)到pnsu=106o如果no和dt已知，為使滅菌終點(diǎn)達(dá)到10“的要求，ft =( lgno-lgnt)xdt物理因素滅菌工藝開(kāi)發(fā)所涉及的生物和物理學(xué)參數(shù)生物學(xué)因素1 滅菌前微生物量:no滅菌值:ft2滅菌前微生物的耐熱性:dr3滅菌終點(diǎn)的殘存概率:no （10"）例如，滅菌前半成品的每個(gè)容器內(nèi)含有100個(gè)耐熱芽胞，其dt=1分i-aii鐘，進(jìn)行濕熱滅菌時(shí)，滅菌值f。要達(dá)到8分鐘，才能使產(chǎn)品中的微生物降 至10&

41、#176;后，再下降6個(gè)對(duì)數(shù)單:f0=2-（-6）xl=8分鐘。f°=8分鐘是滅菌工 藝必須達(dá)到的最小目標(biāo)值。也可根據(jù)滅菌設(shè)備的性能和產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性確 定f。的上限。二、控制滅菌前含菌的滅菌工藝（一）工藝概述嚴(yán)格地說(shuō)，建立在含菌量控制基礎(chǔ)上的滅菌工藝，其滅菌終點(diǎn)是由滅 前半成品的含菌量及所含微生物的耐熱性來(lái)決定的。但是，生產(chǎn)時(shí)應(yīng)避免 產(chǎn)品被耐熱性微生物污染，而不能依賴(lài)于最終滅菌。為此，有些產(chǎn)品在滅前進(jìn)行無(wú)菌生產(chǎn)和灌裝。生產(chǎn)時(shí)，控制滅菌前產(chǎn)品中的含菌量，主要的好處在于可以降低滅條件，這樣就可以降低滅菌時(shí)對(duì)產(chǎn)品及其容器/密封件的潛在破壞性。這對(duì) 熱敏性產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)）來(lái)說(shuō)，是非常重要的。

42、如果在滅菌前產(chǎn)品中沒(méi)有耐熱菌，為便于工藝開(kāi)發(fā)，則可假設(shè)有一定數(shù) 量的芽胞存在于其中（常規(guī)生產(chǎn)時(shí)可能會(huì)碰到的最差狀況）。比如，可假設(shè)l-ai.每只容器內(nèi)含有d121c=0. 5分鐘的耐熱芽胞100個(gè)。開(kāi)發(fā)工藝時(shí)，可根據(jù)與假設(shè)菌的數(shù)量及耐熱性相當(dāng)?shù)膶?shí)際生物指示劑（bi）來(lái)確定一個(gè)滅菌工藝的 滅菌效果。根據(jù)置于滅菌產(chǎn)品內(nèi)的測(cè)溫探頭的測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算出理論f。值, 并對(duì)多次運(yùn)行的f。值進(jìn)行平均，將平均f。值與從接有生物指示劑（已知胞 子數(shù)量和d值）的類(lèi)似容器中得到的平均slr值進(jìn)行比較，根據(jù)生物指示etj劑的致死效果，估算出實(shí)際污染菌的下降水平：slr a=slrb xdb/da，slr a滅菌前產(chǎn)品中污

43、染菌的對(duì)數(shù)下降值;slr b生物指示劑的對(duì)數(shù)下降值;da滅菌前微生物的（已知或假定的）d值;db生物指示劑d值。例,如果da=0.5分鐘，db=2.0分鐘,在12fc，滅菌值fo=8分鐘,生物指示劑下降4個(gè)對(duì)數(shù)單位，則滅菌前微生物的數(shù)量可下降約16個(gè)對(duì)數(shù)單位：slra=4x (2.070.5)=16, lgnt =lgn0-slr=2-16=-14o圖12-2滅菌前彼生物相對(duì)丁生物指示刑的滅菌蛋4 1的對(duì)數(shù)價(jià)從圖可以看出，在滅菌結(jié)束時(shí)仍有一部分生物指示劑未被殺滅，但這并不意味著此滅菌程序無(wú)效。相反，生物指示劑起到了“生物積分器”作用。通過(guò)它們,證實(shí)了測(cè)溫探頭指示的f。值（8分鐘）所賦予容器內(nèi)物

44、品的實(shí)際滅菌效果。有些廠家誤認(rèn)為，在進(jìn)行工藝驗(yàn)證時(shí)，必須將耐熱性最強(qiáng)的芽胞，以106濃度接入產(chǎn)品中，并且要下降6d或12d,才能認(rèn)為此滅菌工藝有效。有時(shí)，生物指示劑在產(chǎn)品中的耐熱性會(huì)有所增強(qiáng)，這就需要賦予非常大的fo值才能將其完全殺滅。只要按下述方法對(duì)滅菌前的含菌量進(jìn)行控制.監(jiān)測(cè)并掌握其耐熱性，此種做法是完全沒(méi)有必要的。（二）滅菌前產(chǎn)品的微生物監(jiān)控如果能?chē)?yán)格執(zhí)行g(shù)mp規(guī)范。那么無(wú)菌生產(chǎn)的藥品中一般是不會(huì)含有耐熱芽胞的。即使在非無(wú)菌條件下生產(chǎn)，滅 前的產(chǎn)品中存在的微生物應(yīng)只是為數(shù)不多的不耐熱的生長(zhǎng)態(tài)菌。對(duì)于非無(wú)生產(chǎn)的藥品而言，必須對(duì)滅菌前產(chǎn)品的微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確保半成品 的微生物處于穩(wěn)定的受控

45、狀態(tài)。監(jiān)控方法是:1 在灌裝結(jié)束階段取樣。2 對(duì)這些樣品進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。3將樣品置于100°c下暴熱10分鐘后，過(guò)濾檢查并進(jìn)行需氧和厭氧條件培養(yǎng)，測(cè)定其中的總芽胞數(shù)。應(yīng)規(guī)定滅菌前產(chǎn)品中微生物含量的限度標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)微生物計(jì)數(shù)資料進(jìn)行趨勢(shì)分析，以考察批與批之間穩(wěn)定性。如果暴熱后樣品的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期 目標(biāo)一致，即沒(méi)有任何微生物生長(zhǎng)，則說(shuō)明在滅菌前產(chǎn)品中不存在任何耐 熱芽胞。一般情況下，暴熱后的樣品中是檢測(cè)不到微生物的，一旦發(fā)現(xiàn)，貝懦對(duì)其鑒別并測(cè)定其d值。若分離菌的d值大于滅菌工藝驗(yàn)證所用生物指示 劑的d值，則說(shuō)明滅菌程序不充分，應(yīng)采取措施以消除產(chǎn)品中的耐熱菌。如果這些措施不可行，則應(yīng)采用具有更

46、強(qiáng)耐熱性的生物指示劑，或是從產(chǎn) 品中分離出的耐熱性微生物，對(duì)滅菌程序進(jìn)行再驗(yàn)證。三、過(guò)熱滅菌及去熱原工藝采用過(guò)熱滅菌程序時(shí)，不用考慮滅菌前含菌量問(wèn)題。這并不意味著就不用對(duì)滅菌前含菌量進(jìn)行控制。相反，遵照良好的衛(wèi)生生產(chǎn)規(guī)范以控制滅前產(chǎn)品中的污染菌含量是非常重要的oi-aip過(guò)熱滅菌工藝是指能使d值不小于1.0分鐘的耐熱微生物（常指嗜熱脂 肪芽胞桿菌）在數(shù)量上至少下降12個(gè)對(duì)數(shù)單位的滅菌工藝。過(guò)熱滅菌工藝 常用于熱穩(wěn)定性物品的滅菌，如包裝材料和生產(chǎn)設(shè)備等。驗(yàn)證時(shí)，常常先 通過(guò)確定完全殺滅含有106個(gè)嗜熱脂肪芽胞桿菌的生物指示劑（dai值為1.5分鐘左右）所需的滅菌時(shí)間，再將這個(gè)時(shí)間加倍即為實(shí)際生產(chǎn)

47、時(shí)的過(guò)熱滅菌時(shí)間。去熱原工藝通常是和干熱滅菌聯(lián)系在一起的，去熱原的工藝條件比芽胞殺滅程序要苛刻得多，通常是fh（干熱致死時(shí)間）的數(shù)十倍。因此，如果干 熱去熱原工藝能使細(xì)菌內(nèi)毒素下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位，那么就沒(méi)必要再進(jìn)行生 物指示劑的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)。濕熱滅菌工藝的生物學(xué)驗(yàn)證一. 驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)最終產(chǎn)品的無(wú)菌質(zhì)量取決于兩個(gè)因素，即滅菌前產(chǎn)品中的微生物含量以及滅菌工藝的殺滅效果。微生物學(xué)驗(yàn)證就是在這兩個(gè)因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。任何滅菌工藝均應(yīng)當(dāng)能使產(chǎn)品中的污染菌含量下降至一個(gè)菌之后，再cmcel下降6個(gè)對(duì)數(shù)單位，這樣才能保證產(chǎn)品經(jīng)滅菌后其中非無(wú)菌品的概率不超 過(guò)1/百萬(wàn)。生物學(xué)驗(yàn)證就是要用與產(chǎn)品滅菌工藝相適應(yīng)的最苛刻

48、條件來(lái)挑戰(zhàn)該產(chǎn)品滅菌工藝的有效性、可靠性和穩(wěn)定性。二、過(guò)熱滅菌工藝（一）生物指示劑的選擇對(duì)過(guò)熱滅菌工藝是指能使d值不小于1分鐘的微生物至少下降12個(gè)對(duì) 數(shù)單位的滅菌工藝。對(duì)一般的液體產(chǎn)品而言，在121°c滅菌15分鐘即被認(rèn) 為過(guò)熱滅菌工藝。但對(duì)管路、膠塞.織物以及過(guò)濾器等熱穿透性較差的物 品則需要更長(zhǎng)的滅菌時(shí)間或更高的滅菌溫度，方能達(dá)到過(guò)熱滅菌要求。用做生物指示劑的微生物芽胞應(yīng)具有良好的耐熱性并且耐熱性也相對(duì)比較穩(wěn)定。根據(jù)滅菌工藝對(duì)微生物的強(qiáng)熱致死效應(yīng)，通常選用d值不低于1.5-3.0分鐘的嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞（每個(gè)指示劑的芽胞含量通常在105-107之間） 作為生物指示劑對(duì)過(guò)熱滅菌

49、工藝進(jìn)行驗(yàn)證。該類(lèi)指示劑在f。值低于其存活 時(shí)間（d值x芽胞數(shù)的對(duì)數(shù)值2）時(shí)，應(yīng)當(dāng)能全部呈陽(yáng)性結(jié)果;當(dāng)f。值高于其 殺滅時(shí)間（d值x芽胞數(shù)的對(duì)數(shù)值+4）時(shí)，所有的生物指示劑均應(yīng)呈陰性結(jié) 果。對(duì)fo值為15分鐘的滅菌工藝（藥典推薦的常用滅菌工藝），可選用d值為15分鐘、芽胞含量為106個(gè)的生物指示劑，或其他耐熱性相當(dāng)?shù)纳?指示劑，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)被滅菌物品的性質(zhì)來(lái)確認(rèn)所選用不同包裝方式的生物指示劑。滅溶液時(shí)，多選用自含型安瓶瓶生物指示劑;滅菌織物時(shí)，多選用芽胞條;滅菌管路時(shí)，則可能要選用特殊生物指劑（如用接有芽胞的鋼絲、線等）以 測(cè)試死角處（最冷點(diǎn)）的滅菌狀況。選擇時(shí)，首先。要掌握滅菌前產(chǎn)品

50、中污染菌狀況，包括污染菌的數(shù)量及其耐熱性;其次，測(cè)定生物劑在待驗(yàn)證產(chǎn)品及驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性（d值和z值）;最后，根據(jù)產(chǎn)品的最低滅菌工藝條件.滅菌前產(chǎn)品中的污染控制要求及最終產(chǎn)品的無(wú)菌保證要求，用相關(guān)公式計(jì)算出驗(yàn)證時(shí)每個(gè)生物指示劑所需要的抱子數(shù)量。滅菌方式微生物（抱子）d值范圍（分）嗜熱脂肪芽抱桿菌 bacillus stearothermophilus1.5-3.0濕熱121°c枯草芽抱桿菌bacillus subtilis凝結(jié)芽抱桿菌bacillus coagulans0.4-0.8梭狀芽抱桿菌 clostridium sporogenes0.4-0.8干熱150°

51、c枯草芽抱桿菌黑色變種bacillus subtilis var. niger>1.0下面我們將以用產(chǎn)芽胞梭菌(clostridium sporogenes)芽胞作為生物指示劑驗(yàn)證乳劑類(lèi)產(chǎn)品滅菌工藝為實(shí)例，具體介紹生物指示劑的選擇方法。1 收集與產(chǎn)品滅菌工藝相關(guān)的基本資料 案例:某制藥公司生產(chǎn)兩種 乳劑類(lèi)產(chǎn)品(a和b),h12-4乳刑產(chǎn)品a及乳刑產(chǎn)品b的相關(guān)復(fù)生需控制錨產(chǎn)品滅繃超tf我制般驗(yàn)if用袍子在其屮控制限度耐熱性限度溫度x時(shí)間(nin)附性aw100個(gè)觀袋恥1小分116515分鐘9-130.8分bw血個(gè)菌/袋血10分llfitxlj 分鐘8-120.9分注：產(chǎn)品a和產(chǎn)品睛為大容i

52、t注刪(rood/軌在進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證之前，產(chǎn)品滅菌工藝已經(jīng)過(guò)物理驗(yàn)證而確定下來(lái)。因此，以上產(chǎn)品資料均可在生物學(xué)驗(yàn)證之前獲取。滅菌前含菌量限度以及 污染菌的耐熱性限度均是以原材料的微生物含量和常規(guī)監(jiān)控資料為基礎(chǔ)而 建立的;滅菌條件及fq值控制是根據(jù)產(chǎn)品穩(wěn)定性研究資料而建立的;驗(yàn)證用 芽胞在每種產(chǎn)品中的實(shí)際耐熱性資料由微生物實(shí)驗(yàn)室測(cè)得，并且通過(guò)熱致 死曲線的線性度發(fā)現(xiàn)產(chǎn)芽胞梭菌(clostridium sparogenes)芽胞在上述兩種產(chǎn)品內(nèi)熱穩(wěn)定良好?？紤]到兩種產(chǎn)品的規(guī)格相同.且在同一滅菌設(shè)備內(nèi)滅菌并且滅菌工藝條件相似、以及生物指示劑芽胞在其中的耐熱性也較為相近，只要驗(yàn)證其 中的一個(gè)產(chǎn)品b即可

53、，因?yàn)橐捎胒o值控制范圍的較低下限進(jìn)行驗(yàn)證。但是，產(chǎn)品均是乳劑類(lèi)產(chǎn)品，如直接將芽胞接種在產(chǎn)品內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，勢(shì)必 給試驗(yàn)后的無(wú)菌檢測(cè)帶來(lái)很多麻煩。因此，可選擇一透明澄清的標(biāo)準(zhǔn)溶液 來(lái)替代上述二產(chǎn)品，只要芽胞在其中的耐熱性不低于在兩產(chǎn)品中的耐熱性 即可。經(jīng)測(cè)定，產(chǎn)芽胞梭狀菌芽胞在氯化鈉一磷酸鹽緩沖液(pbs，ph70)中的耐熱性為14分鐘，高于其在兩產(chǎn)品中的耐熱性，適合作為上述兩產(chǎn)品滅工藝驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)溶液。2確定驗(yàn)證條件 根據(jù)本案例,驗(yàn)證條件確定如下:滅菌前產(chǎn)品含菌量限度設(shè)定為100個(gè)菌/袋，滅菌溫度為116°c, fo值為8分鐘，以產(chǎn)芽胞梭&芽胞作為生物指示劑，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)溶液為氯化鈉一磷酸鹽緩沖液(pbs),驗(yàn) 證試驗(yàn)瓶數(shù)量為20袋/次。3確定芽胞的接種數(shù)量 我們知道，當(dāng)滅菌條件一定時(shí),fo=d(lgno-lgni)o產(chǎn)品中污染菌的最大耐熱性d121=1.0分鐘，那么，滅菌工藝使產(chǎn)品達(dá)到無(wú)菌保證值所需最小fo值為: