大腸桿菌基因工程——人胰島素PPT學習教案

1、會計學1大腸桿菌基因工程大腸桿菌基因工程人胰島素人胰島素目錄目錄1.利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽2.胰島素的生產(chǎn)方法3.產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工程菌的構(gòu)建策略第1頁/共10頁利用重組大腸桿菌生產(chǎn)醫(yī)用蛋白或多肽 由于大腸桿菌繁殖迅速價格低廉，培養(yǎng)代謝易于控制，因此重組大腸桿菌在醫(yī)用蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟意義。盡管有些生物活性嚴格依賴于糖基化作用的真核生物功能蛋白無法用重組大腸桿菌進行生產(chǎn)，蛋白質(zhì)生物合成后加工系統(tǒng)的缺乏使得某些人體蛋白難以折成天然構(gòu)象，但仍有100多種異源蛋白通過大腸桿菌基因工程菌實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化，其中包括一些結(jié)構(gòu)相當復雜的人體蛋白，如富含半胱氨酸的血清清蛋白（含半胱氨酸

2、的血清清蛋白（HSAHSA）、尿激酶原（）、尿激酶原（pro-UKpro-UK）、金屬硫蛋白（）、金屬硫蛋白（MTMT）、二硫）、二硫鍵共價交聯(lián)的二聚體蛋白巨噬細胞集落刺激因子（鍵共價交聯(lián)的二聚體蛋白巨噬細胞集落刺激因子（M-M-CSFCSF）以及四聚體的血紅蛋白）以及四聚體的血紅蛋白(Hb(Hb）等。 本次以重組人胰島素重組人胰島素為例，論述利用大腸桿菌生產(chǎn)外源基因表達產(chǎn)物的基本過程。第2頁/共10頁胰島素的生產(chǎn)方胰島素的生產(chǎn)方法法 人胰島素是一種由兩條多肽鏈 ( A 鏈和 B 鏈) 組成的蛋白質(zhì)。胰島素合成時，最初在胰島 B 細胞內(nèi)的附著核糖體上形成的是一條單鏈多肽前胰島素原，其進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

3、腔后，信號肽酶切除信號肽形成胰島素原，后者被運輸至高爾基體，在高爾基體中切除連接 序列( C 鏈) 形成 A 鏈和 B 鏈，然后通過二硫鍵將兩者結(jié)合形成有生物活性的胰島素。 工業(yè)上可采用下列四種方法大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素：（1）從人的胰中直接提取胰島素；（2）由單個氨基酸直接化學合成；（3）由豬胰島素化學轉(zhuǎn)型為人胰島素；（4 4）利用基因工程菌大規(guī)模大規(guī)）利用基因工程菌大規(guī)模大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素模發(fā)酵生產(chǎn)重組人胰島素。第3頁/共10頁產(chǎn)人胰島素大腸桿菌工 程 菌 的 構(gòu) 建 策 略第4頁/共10頁1 1 A鏈和B鏈的編碼區(qū)由化學合成，兩個雙鏈DNA片段分別克隆在含有Ptac啟動子和-半乳糖苷

4、酶基因的表達型質(zhì)粒上，后者與胰島素編碼序列形成雜合基因，其連接位點處為甲硫氨酸密碼子。 重組分子分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體細胞，兩種克隆菌分別合成-半乳糖苷酶-人胰島素A鏈以及-半乳糖苷酶-人胰島素B鏈兩種融合蛋白。經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，從菌體中分離純化融合蛋白，再用溴化氫在甲硫氨酸殘基的C端化學切斷融合蛋白，釋放出人胰島素的A鏈和B鏈。胰島素AB鏈分別表達法的基本原理AB鏈分別表達法第5頁/共10頁2 2人胰島素原表達法雖然上述工藝路線并不比AB鏈分別表達更為簡捷，而且需要額外使用兩種高純度的酶制劑，但由于其體外折疊成功率相當高，在一定程度上彌補了工藝繁瑣的缺陷，使得產(chǎn)品的生產(chǎn)成本僅為50美元/g。 將

5、人胰島素原cDNA編碼序列克隆在-半乳糖苷酶基因下游，兩個DNA片段的連接處仍為甲硫氨酸密碼子。該雜合基因在大腸桿菌中高效表達后，分離純化融合蛋白，并同樣采取溴化氫化學裂解法回收人胰島素原片段，然后將之進行體外折疊。由于C肽的存在，胰島素原在復性條件下能形成天然的空間構(gòu)象，為3對二硫鍵的正確配對提供了良好的條件，使得體外折疊率高達80%以上。為了獲得具有生物活性的胰島素，經(jīng)折疊后的人胰島素原分子必須用胰蛋白酶特異性切除C肽，可獲得完整的A鏈以及C端帶有精氨酸Arg的B鏈。第6頁/共10頁AB鏈同時表達法鏈同時表達法 這種方法的基本思路是將人胰島素的A鏈和B鏈編碼序列拼接在一起，然后組裝在大腸桿

6、菌-半乳糖苷酶基因的下游。重組子表達出的融合蛋白經(jīng)溴化氫CNBr處理后，分離傳話A-B鏈多肽，然后再根據(jù)兩條鏈連接處的氨基酸性質(zhì)，采用相應的裂解方法獲得A鏈和B鏈肽段，最終通過體外折疊制備具有活性的重組人胰島素。與第一種方法相似，其最大的缺陷仍是體外折疊的正確率較低，因此目前尚未進入應用階段。3 3第7頁/共10頁 上述三種工程菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所生產(chǎn)的融合型重組蛋白表達率高，且穩(wěn)定性強，但不能分泌，主要以包含體的形式存在與細胞內(nèi)。一種能促進融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列插入到表達型質(zhì)粒-內(nèi)酰胺酶基因的下游，后者所編碼是降解青霉素的酶蛋白，通常能被大腸桿菌分泌到細胞外。由此構(gòu)