質(zhì)譜分析蛋白的原理與方法淺述

1、質(zhì)譜分析蛋日的原理與方法淺述摘要:隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，利用質(zhì)譜法進行蛋白質(zhì)分析愈來愈廣泛和深入。 本文簡要闡述蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理和方法。關(guān)鍵字：蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析原理與方法1概述質(zhì)譜技術(shù)具有較好的靈敏度、準確度，能準確測定蛋白質(zhì)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置，在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要的地位。1,2質(zhì)譜有進樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、控制電腦 及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-

2、MS）等，各種質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的且準確快速的途徑。目前，酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計算機算法的聯(lián)合應(yīng)用已成為鑒定蛋白質(zhì)的發(fā)展趨勢。2質(zhì)譜分析蛋白的原理：質(zhì)譜法分析蛋白的基本原理是通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值（M/Z）的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的 M/Z值，分析鑒定未知蛋白。通常結(jié)合相應(yīng)的處理及其他技 術(shù)，能夠比較準確、快速地鑒定蛋白質(zhì)。2.1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS簡而言之，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)

3、量/電荷之比（M/Z）來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（MALDI ）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用 激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān)系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時間（TOF）檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的研究。4,72.2電噴霧

4、電離質(zhì)譜（ESI-MS）電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS ）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍， 因而大大擴展了分子量的分析范圍， 離子的真實分子質(zhì)量 也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液-質(zhì)聯(lián)用（LC-M0是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質(zhì)的目的。2.3快

5、原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)(FABMS )是一種軟電離技術(shù)，是用快速惰性原子射擊存在于底 物中的樣品，使樣品離子濺出進入分析器，這種軟電離技術(shù)適于極性強、熱不穩(wěn)定的化合物的分析，特加適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。FABMS只能提供有關(guān)離子的精確質(zhì)量，從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而 FABMSMS串聯(lián)技術(shù)的應(yīng)用可以提供樣品較為詳細的分子結(jié)構(gòu)信息。3質(zhì)譜分析蛋白的方法：用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的方法主要有三種：肽質(zhì)量指紋圖譜法(PMF、串聯(lián)質(zhì)譜法(CID)和梯形肽片段測序法(ladderpeptide sequencing )。3.1肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF即用特異

6、性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白質(zhì)切成小的片段， 然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽的相對分子質(zhì)量，將所得的蛋白酶解肽段質(zhì)量數(shù)在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找相似肽指紋譜，從而繪制“肽圖”。由此可見，分子質(zhì)量的精確度是PMF勺關(guān)鍵指標所在，但蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可能使PMF勺質(zhì)量數(shù)與理論值不符，故這就需要與序列信息適當(dāng)結(jié)合。3.2串聯(lián)質(zhì)譜法(CID)串聯(lián)質(zhì)譜法(CID)是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)定離子，通過分析 相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基。串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列圖需要讀出部分氨基 酸序列與前后的離子質(zhì)量和肽段母質(zhì)量相結(jié)合，這種鑒定方法稱為肽序列標簽(PST)。3.3 梯形肽片段測序法(l

7、adder peptide sequencing )梯形肽片段測序法(ladder peptide sequencing ),與Edmarfe有相似之處，是用化學(xué) 探針或酶解使蛋白或肽從圈或嘲逐一降解下氨基酸殘基，產(chǎn)生包含僅異于1個氨基酸殘基質(zhì)量的系列肽，名為ladder，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰肽峰的質(zhì)量差而得知相應(yīng)氨基酸殘基。其中的問題是由于酶解速度不一，易受干擾。4.蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中的問題4.1蛋白質(zhì)消化蛋白消化蛋白的基團越大，質(zhì)譜檢測的準確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準確率。一般而言，6- 20個氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測。現(xiàn)今最常用的酶為胰

8、蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。4.2蛋白質(zhì)修飾問題在目前條件下，質(zhì)譜很難100%給出肽段的序列，經(jīng)常會丟失一些肽段，蛋白質(zhì)磷酸化修飾也會抑制胰蛋白酶的酶解，并且磷酸化肽的含量較非磷酸化肽段的含量少很多，質(zhì)譜對磷酸化肽的響應(yīng)就可能會被抑制。因此，要盡可能把非磷酸化肽段的含量降到最小。減少非磷酸化肽的方法有分儲、IMAC (固相化金屬親和色譜)和抗體結(jié)合。通過MALDI-TOF-MS測定肽段的分子量，根據(jù)所得肽段分子量比預(yù)計的分子量大80Da或其整倍數(shù)，判定是否存在磷酸化修飾。4.

9、3精確度問題在質(zhì)譜序列測定中，質(zhì)譜的準確性對測定結(jié)果有很大影響，這是由于質(zhì)譜測序的關(guān)鍵在于測定相鄰肽鏈之間的分子量差別以判斷相應(yīng)的氨基酸殘基。如果測量的絕對質(zhì)量誤差在0.5以上，則不能夠有效區(qū)分質(zhì)量數(shù)差在1以內(nèi)的氨基酸殘基。參考文獻：1 王嵐等.生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用.生物技術(shù)通訊J.Vol.18.2007.No.1:166 ;2 陳晶等.質(zhì)譜在肽和蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用.有機化學(xué).2002第22卷.第二期.81-90;3 鄭永紅等.生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用進展.解放軍藥學(xué)學(xué)報.第20卷第1期.62;4 劉驍勇等.蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的質(zhì)譜技術(shù).山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心；5 劉康等.蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的質(zhì)譜鑒定與生物信息學(xué)分析.棉花學(xué)報.2008.20 : 281-288;6 成海平等.蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)體系及進展.生物化學(xué)與生物物理進展.2000.27(6).588;7 呂茂民等.生物質(zhì)譜技術(shù)及其應(yīng)用.生物技術(shù)通報.2001年第4期；8 蔡耘等.生物質(zhì)譜技術(shù)在糖蛋白結(jié)