食品中有毒微生物的測(cè)定

1、 第十二章食品中有害成分測(cè)定食品中有害成分測(cè)定第二節(jié)diyijie食品中有毒微生物的測(cè)定目錄12 食品中沙門氏菌的快速篩檢方法345 李斯特菌快速檢測(cè)方法微生物數(shù)量的快速檢測(cè)大腸桿菌O157:H7快速檢測(cè)方法金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法 微生物數(shù)量的快速檢測(cè)1.旋轉(zhuǎn)平皿計(jì)數(shù)方法2.疏水性柵格濾膜法或等格法3.皿膜系統(tǒng)4.酶底物技術(shù)5.直接外熒光濾過技術(shù)6.“即用膠”系統(tǒng)活細(xì)胞計(jì)數(shù)的改進(jìn)方法1.阻抗法2.ATP生物發(fā)光技術(shù)用于估計(jì)微生物數(shù)量的新方法旋轉(zhuǎn)平皿技術(shù)方法旋轉(zhuǎn)平皿技術(shù)方法標(biāo)題旋轉(zhuǎn)平皿計(jì)數(shù)方法即是把液態(tài)樣品螺旋式并不斷稀釋地接種到一個(gè)旋轉(zhuǎn)的平皿中。這一系統(tǒng)在美國已被廣泛采用，如AOAC方法

2、977.27食品和化妝品中的細(xì)菌旋轉(zhuǎn)平板法旋轉(zhuǎn)平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定原理原理:自食品或化妝品樣品制備的菌懸液被螺旋平板注入器連續(xù)不斷地注入分布到旋轉(zhuǎn)著的瓊脂平板的表面，在瓊脂表面形成阿基米德螺旋形軌跡。當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時(shí)，菌液體積減少，注入的體積和瓊脂半徑間存在著指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時(shí)菌落沿注液線生長。用一計(jì)數(shù)的方格來校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的已知菌落數(shù)，再計(jì)算細(xì)菌濃度?！啊笔杷詵鸥駷V膜法或等格法常規(guī)微生物項(xiàng)目：菌落總數(shù)、大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希菌及霉菌、酵母計(jì)數(shù)，也有用于彎曲桿菌計(jì)數(shù)的報(bào)道。LIM等研制了臺(tái)盼藍(lán)的培養(yǎng)基使等格法能直接用于酵母菌計(jì)數(shù)。皿膜系

3、統(tǒng)皿膜系統(tǒng)可用于輪廓總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希菌、霉菌、酵母和金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)。測(cè)定原理Happy every day5.12在一雙層膜系統(tǒng)內(nèi)含有干燥的營養(yǎng)物質(zhì)和冷水可溶的膠體物質(zhì)，以每系統(tǒng)1ML的加樣量講樣品直接加到基礎(chǔ)膜中間，蓋上含有膠凝劑和2,3,5-氯化三苯四氮唑的覆蓋膜，培養(yǎng)后細(xì)菌在雙層膜之間生長并顯色即可直接計(jì)數(shù)。測(cè)定原理測(cè)定原理底物酶技術(shù)直接外熒光過濾技術(shù)是測(cè)定許多食品如奶、肉、禽和禽制品、魚和魚制品、水果和蔬菜、啤酒和葡萄酒、輻射食品等食品及水中的微生物的一種快速方法。直接外熒光過濾技術(shù)原理:利用紫外光顯微鏡來快速測(cè)定活菌數(shù)。首先用一特殊濾膜過濾樣品，經(jīng)吖啶橙染色后，用紫外光顯

4、微觀察活細(xì)胞呈橙色熒光、死細(xì)胞呈綠色熒光。“即用膠”系統(tǒng)是根據(jù)選擇的培養(yǎng)基不同可分別用于菌落總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希菌計(jì)數(shù)和霉菌、酵母計(jì)數(shù)，以及彎曲桿菌的計(jì)數(shù)?！凹从媚z”系統(tǒng)原理:此系統(tǒng)盛有無菌液體（或脫水干燥）培養(yǎng)基的試管，在此專用培養(yǎng)基內(nèi)含有與多種細(xì)菌酶類所對(duì)應(yīng)的底物，撿樣被細(xì)菌污染時(shí)，只要具有一種酶的活性即能與底物作用生成4-甲基傘形酮，培養(yǎng)一定時(shí)間后，在波長365的紫外光下發(fā)出藍(lán)色熒光。把樣品傾入該試管中，混勻后再將混合物倒入一個(gè)裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中。混合物與膠質(zhì)接觸后便形成與瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)顏色指示或在紫外光下產(chǎn)生熒光計(jì)數(shù)。用于估計(jì)微生物數(shù)量的方法123這些方法主要是

5、將物理化學(xué)領(lǐng)域中的新知識(shí)新技術(shù)應(yīng)用于微生物檢測(cè)中。通過測(cè)量微生物在生長和代謝活動(dòng)中發(fā)生的變化來估測(cè)微生物數(shù)量。, ,Bactometer系統(tǒng)1 1Malthus微生物發(fā)光技術(shù)2 2阻抗法Bactometer系統(tǒng)是利用阻抗變化來測(cè)定，當(dāng)培養(yǎng)基因微生物的代謝活動(dòng)而發(fā)生化學(xué)改變時(shí)，阻抗也發(fā)生變化。在微生物生長過程中，大分子營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)檩^小但更為活躍的分子。在某些測(cè)定實(shí)例中，當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生的離子濃度達(dá)到比培養(yǎng)基初始離子濃度稍低時(shí)，電導(dǎo)改變即可檢出。ATP生物發(fā)光技術(shù)是利用產(chǎn)生于生物體內(nèi)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象而建立起來的一種檢測(cè)方法。目前發(fā)現(xiàn)的熒光素酶有細(xì)菌熒光酶和螢火蟲熒光素酶兩大類，前者是從海洋放光細(xì)菌

6、中提取，后這是從螢火蟲中提取。其方法是先將螢火蟲螢光素酶基因克隆在大腸桿菌中表達(dá)，然后將轉(zhuǎn)化體置37的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，到對(duì)數(shù)期收集菌體，用滲透壓法，凍融法提取細(xì)菌胞質(zhì)組分，經(jīng)均質(zhì)，離心，用凝膠排阻，離心交換色譜提取純酶。食品中沙門菌的快速篩檢方法沙門菌 寄居在人類動(dòng)物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌。它是人類食物中毒的主要病原之一。 沙門菌廣泛分布于自然界，而且種類多，所以，沙門菌日益引起人們的高度重視，食品中的沙門菌的檢驗(yàn)也顯得非常重要。食品中沙門菌的快速篩檢方法免疫學(xué)方法分子生物學(xué)方法沙門菌顯色培養(yǎng)基法自動(dòng)化傳導(dǎo)法免疫學(xué)方法1單克隆酶免疫色度分析篩選方法2多克隆酶免疫分析篩選方

7、法3熒光酶免疫分析篩選方法4金標(biāo)免疫分析方法分子生物學(xué)方法DNA探針檢測(cè)法 DNA探針技術(shù)是最新發(fā)展起來的一向特異，靈敏，快速的檢測(cè)方法。特別適用于直接檢驗(yàn)出致病性微生物，而不受非致病性微生物的影響。 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)【PCR】技術(shù) 該技術(shù)是由美國cetus公司和美國加利福尼亞大學(xué)于1985年聯(lián)合創(chuàng)建的，自PCR方法創(chuàng)建以來其已廣泛地應(yīng)用于致病性微生物的診斷中。自動(dòng)化傳導(dǎo)法 自動(dòng)化傳導(dǎo)法是根據(jù)電阻抗測(cè)量的原理，關(guān)鍵是選用適宜的培養(yǎng)基，以保證任何電導(dǎo)或電阻抗的變化都是由目標(biāo)微生物的生長所致，通過儀器檢測(cè)電導(dǎo)或電阻抗的改變來確定是否存在被檢微生物。 根據(jù)選用的專一性培養(yǎng)基不同，電導(dǎo)或電阻抗法還可用于

8、大腸桿菌，李斯特菌，彎曲桿菌等菌的初篩檢驗(yàn)。也許對(duì)于大家而言，大腸桿菌已然并不陌生，但是你對(duì)于大腸桿菌O157：H7了解多少？它到底對(duì)于我們生活有何影響？接下來就讓我們走進(jìn)今天的學(xué)習(xí)大腸桿菌大腸桿菌O157：H7的特性介紹及檢測(cè)它的意義的特性介紹及檢測(cè)它的意義腸出血性大腸桿菌（EHEC）是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌。以O(shè)157:H7血清型為代表菌株。EHEC O157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬。革蘭氏染色陰性，無芽胞，有鞭毛。危害：本菌與輕度腹瀉、溶血性尿毒綜合癥、出血性腸炎等多種人類病狀密切相關(guān)。根據(jù)大腸桿菌O157：H7的某些生化特征設(shè)計(jì)些選擇性培養(yǎng)基，在這些培養(yǎng)基上大

9、腸桿菌O157：H7與其他大腸桿菌或雜菌區(qū)分開。另一類根據(jù)菌落顏色來識(shí)別大腸桿菌O157：H7有法國梅里埃公司的“O157ID”，在這種培養(yǎng)基上大腸桿菌O157：H7顯藍(lán)色，其他大腸桿菌顯紫色。1.免疫磁珠分離法：利用磁場(chǎng)作用將磁珠從增菌液中沉淀，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，讓成分分離2.金標(biāo)免疫分析法：免疫分析法利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測(cè)各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方法。3.酶聯(lián)免疫吸附法：酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測(cè)。4.乳膠凝集實(shí)驗(yàn)：以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗(yàn)。即吸附可溶性抗原于其

10、表面，特異性抗體與之結(jié)合后，可產(chǎn)生凝集反應(yīng)。1.DNA探針：DNA探針是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標(biāo)記的單鏈DNA片段，可用來快速檢測(cè)病原體。2.聚合酶鏈反應(yīng)：聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR），又稱無細(xì)胞克隆技術(shù)(“free bacteria”cloning technique)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)概況l葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個(gè)菌種，從人體上可檢出12個(gè)種。l葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血?jiǎng)游锏恼衬は嚓P(guān)系，有些種是人及動(dòng)物的條件致病菌

11、。l金黃色葡萄球菌對(duì)人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性形態(tài)與染色：l 金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.41.2m，大小不一，平均直徑約為0.8m。l 革蘭氏染色陽性，呈葡萄串狀排列。無鞭毛、無芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。培養(yǎng)特性：l 易培養(yǎng)，對(duì)營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長良好。l 需氧或兼性厭氧。l 最適生長溫度37，最適生長pH 7.4。耐鹽性強(qiáng)，在含1015%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長，可用于篩選菌種。l 在普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)1824，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落。可產(chǎn)生

12、金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。l 在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為型溶血。l 可產(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。l 大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)、 VP試驗(yàn)多為陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽性。金黃色葡萄球菌的酶l 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。l 血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認(rèn)為，血漿凝固陽性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無力的菌株。血漿凝固酶對(duì)熱穩(wěn)定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活

13、性。l 耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標(biāo)之一。該酶的最適pH為9.0。血漿凝固酶試驗(yàn) l 試驗(yàn)原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w蛋白，附著于細(xì)菌表面 ，產(chǎn)生凝固。l 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。血漿凝固酶試驗(yàn) l 挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，361培養(yǎng)18 h24 h。 l 取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2

14、mL0.3mL，振蕩搖勻，置361溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結(jié)果。 l 同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。 l 結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL BHI，361培養(yǎng)18h48h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果報(bào)告l如血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，可判定為金黃色葡萄球菌 。l報(bào)告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。2015李斯特菌快速檢測(cè)方法2015李斯特菌李斯特菌(學(xué)名:Listeria monocytogenes)，又名單核球增多性李斯特菌、李氏菌，是一種兼性厭氧細(xì)菌，為李斯特菌癥的病原體。李斯特菌是革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門，取名自約瑟夫李斯特。它主要以食物為傳染媒介，是最致命的食源性病原體之一。 2015 李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到李斯特菌。肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品、蔬菜等都已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品