幽門螺桿菌毒素相關(guān)基因的克隆、測(cè)序及表達(dá)

1、幽門螺桿菌毒素相關(guān)基因的克隆、測(cè)序及表達(dá) 作者：韓鋒產(chǎn)閆小君蘇成芝 【關(guān)鍵詞】 螺桿菌幽門細(xì)胞 關(guān)鍵詞: 螺桿菌幽門細(xì)胞;毒素相關(guān)基因;基因克隆;基因表達(dá);溫度誘導(dǎo) 摘 要:目的 分段擴(kuò)增、克隆幽門螺桿菌毒素相關(guān)基因cagA中間區(qū)cag1，cag2，并利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá). 方法 PCR法擴(kuò)增cagA基因，雙脫氧中止法測(cè)序正確后，克隆入大腸桿菌表達(dá)載體pBV220，受控于PR P L 啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，42進(jìn)行溫度誘導(dǎo). 結(jié)果 PCR分段擴(kuò)增出cagA中間區(qū)基因cag1，cag2，分別為975，755bp，克隆入pUC19質(zhì)粒，測(cè)序正確;在pBV中構(gòu)建cag1，cag2的重組表達(dá)載體

2、pBVcagA1，pBVcagA2，工程菌誘導(dǎo)后SDS-PAGE顯示新生表達(dá)蛋白帶，Mr :Cag136×103 ，Cag227.9×103 ，均與預(yù)期的cagA蛋白Mr 一致，約占菌體總蛋白的36%和24%. 結(jié)論 成功克隆分段擴(kuò)增的cagA中間區(qū)基因，并可在大腸桿菌DH5中高效表達(dá). Keywords:Helicobacter pylori;cytotoxin-associated gene（cagA）;gene cloning;gene expression;temper-ature induce 2 / 16Abstract:AIM To amplify and c

3、lone the middle region of Helicobacter pylori cagA gene，and express the proteins in E.coli.METHODS After the cag1and cag2were amplified by PCR and sequencd by dideoxy methods，they were insert-ed into expression vector pBV220in which exogenous genewas controlled by PR PL promoters.The recombinant pla

4、smids pBVcag1and pBVcag2were transformed into E.coli DH5and induced at42respectively to express the encoded proteins.RESULTS The middle region of cagA was amplified and975，755bp products were got as cag1，cag2，which were cloned into pUC19and sequenced correctly.Then，their recombination expression clo

5、nes pBVcagA1and pBVcagA2were constructed.When their engineered bactera were in-duced，the anticipated Mr 36×10 3 and27.9×103 proteins band appeared on SDS-PAGE gel and amounted to36%and24%of total bacterial protein respectively.CONCLUSION The H.pylori cagA middle region might be successfull

6、y cloned and efficiently expressed fractionally in E.coli. 0 引言 毒素相關(guān)基因A（cytotoxin-associated gene，cagA）基因是cag致病島的一部分，其OFR約3542bp左右，3端存在變異，相應(yīng)蛋白Mr 為（1.281.40）×1051 ，是胃內(nèi)致病微生物幽門螺桿菌（Hp）主要的毒力因子之一，參與胃、十二指腸潰瘍及胃癌等的發(fā)病，并與疾病的轉(zhuǎn)歸有關(guān)2-4 .中國(guó)Hp感染率高達(dá)80%以上，且大多為cagA+ Hp的感染5 .現(xiàn)在一些Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株的cagA基因已克隆6，7 ，其表達(dá)產(chǎn)物cagA具有較強(qiáng)的抗

7、原性，其滴度可反應(yīng)Hp株間的毒力差異，而且和疾病發(fā)展也有一定的相關(guān)性1 .對(duì)Hp感染的檢測(cè)可通過(guò)對(duì)抗cagA抗體的檢測(cè)進(jìn)行.將cagA分段表達(dá)，同時(shí)用來(lái)檢測(cè)患者血清，可以更全面、準(zhǔn)確、清晰地了解患者Hp的感染情況.我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)分段克隆表達(dá)cagA基因中間區(qū)，為Hp感染的檢測(cè)及治療提供基礎(chǔ). 1 材料和方法 1.1 材料 大腸桿菌JM109，DH5，pUC19及pBV220質(zhì)粒為本所保存;pMC3為含cagA基因5端大部分的pBluescript質(zhì)粒，由美國(guó)Vanderlilt大學(xué)Tummuru博士惠贈(zèng).限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸修飾酶及Taq酶均為寶生物公司產(chǎn)品. 1.2 方法 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

8、菌株cagA序列6，7 設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行分段擴(kuò)增: cag1正向ACAGAATTCATGGACATGGATCCC AATTACAAGT反向GTTGTCGACTTACTCGTCATAGTT GCCTGTGTT cag2正向AGAGGATCCATGGAGGTGAAACGA GCTCAG反向TCACTGCAGTGGCCTCTATTCCAG ATAACC cag1正向引物加起始碼（ATG）及EcoRI酶切位點(diǎn)，反向引物上加終止碼（TAA）及SalI酶切位點(diǎn);cag2正向引物加起始碼（ATG）及BamHI酶切位點(diǎn)，反向引物上加終止碼（TAA）及PstI酶切位點(diǎn).以pMC3為模板，反應(yīng)條件為955mi

9、n，941min，551min，721min.PCR產(chǎn)物克隆及鑒定用EcoRI+SalI（cag1），BamHI+PstI（cag2）分別雙酶切純化的PCR產(chǎn)物與pUC19質(zhì)粒，連接外源DNA與對(duì)應(yīng)線性化pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，氨芐青霉素抗性及藍(lán)白篩選，挑選白色克隆，酶切鑒定重組克隆.核苷酸序列由基康公司測(cè)序.H.pylori cag1，cag2與表達(dá)載體的重組. 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):工程菌在含氨芐青霉素（100mg L-1 ）的LB培養(yǎng)液中30振蕩過(guò)夜，次日按1%轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)30振蕩24h，當(dāng)A600nm =0.6時(shí)，立即轉(zhuǎn)入42水浴搖床快速振蕩5h. SDS聚丙

10、稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）:4離心收集菌體，用含3mL L-1 巰基乙醇載樣液處理（10068min），考馬斯亮藍(lán)R-250染色. 2 結(jié)果 PCR擴(kuò)增cag1，cag2，分別得到975和755bp的片段（Fig1）.隨機(jī)挑選白色克隆，經(jīng)雙酶切鑒定，證實(shí)含有975和755bp的插入片段（Fig2）.陽(yáng)性克隆送交基康公司測(cè)序，測(cè)序正確. 2.1 pBVcag1，pBVcag2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用EcoRI+SalI（c1），BamHI+PstI（c2）分別酶切pUC19-c1，pUC-c2重組克隆和pBV220，經(jīng)回收分別得到cag1，cag2基因和線性化pBV220，連接外源DNA和線性

11、化pBV220，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選，挑選菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒酶切鑒定，得到正確重組克隆pBV-cag1，pBV-cag2（Fig3）. 2.2 cagA在大腸桿菌中的表達(dá) pBV-cag1，pBV-cag2重組質(zhì)粒以大腸桿菌DH5宿主菌，按方法進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，42誘導(dǎo)培養(yǎng)的工程菌經(jīng)還原處理后作 SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色，與對(duì)照菌株比較，工程菌在Mr 36×103 ，27.9×103 處各出現(xiàn)一條明顯的新生蛋白帶，其含量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，56h達(dá)高峰，而后趨于穩(wěn)定，6h誘導(dǎo)工程菌電泳薄層掃描顯示目的蛋白約占菌體總蛋白的36%和24%（Fig4）.

12、 圖1 圖2 略 3 討論 Hp主要寄居在胃幽門附近的胃竇粘膜上，故名幽門螺桿菌.它可釋放多種毒性酶類（如尿素酶、脂酶、粘液酶等）和毒素引起對(duì)胃粘膜屏障的損害，還能使機(jī)體產(chǎn)生炎癥和免疫反應(yīng)，增加胃泌素的分泌，最終導(dǎo)致疾病形成.Hp的基因具有高度多態(tài)性，不同個(gè)體不同地區(qū)源性的Hp毒力不同;50%以上的Hp菌株可釋放空泡毒素（VacA）和毒素相關(guān)蛋白（CagA），這種Hp被稱為產(chǎn)毒型Hp，又稱I型Hp8 ，其致病力更強(qiáng)，通過(guò)患者血中CagA抗體檢測(cè)可診斷是否為這種產(chǎn)毒型Hp感染9 .cagA+ Hp是活動(dòng)性胃炎及消化性潰瘍的主要病因之一;在歐美，cagA+ Hp的感染已被認(rèn)為是胃癌可能發(fā)生的先兆，

13、但在cagA+ Hp感染率很高的亞洲，這種聯(lián)系并不緊密5，10 .但已證實(shí)的是，Hp可抑制胃粘膜上皮細(xì)胞的增殖，cagA+ Hp抑制作用明顯弱于cagA- Hp，原因在于cagA+ Hp可損傷胃粘膜上皮細(xì)胞使其持續(xù)增殖，提示cagA+ Hp和胃癌相關(guān)11 .研究還發(fā)現(xiàn)，97%胃腺癌患者為cagA + Hp感染者;和cagA- Hp感染相比，cagA+ 的Hp感染可明顯降低胃液中的Vit.C的水平，從而刺激胃癌的發(fā)生12 .也有報(bào)道認(rèn)為，cagA+ Hp感染和胃癌的發(fā)生沒有關(guān)聯(lián)5 .此外，cagA+ Hp感染還與功能性消化不良，低度惡性胃粘膜淋巴組織（MALT）淋巴瘤等相關(guān);在Hp感染后出現(xiàn)的M

14、ALT淋巴瘤在根除Hp感染后可以消退2-4，8 .cagA+ 的Hp菌株都表達(dá)CagA蛋白，感染后產(chǎn)生可測(cè)的抗體反應(yīng)5 ，CagA抗體的存在提示患者可能存在高危的或更嚴(yán)重的疾病.在兒童中，高滴度的CagA抗體反應(yīng)伴隨較嚴(yán)重的感染13 .Hp血清反應(yīng)陽(yáng)性與胃癌階段也有一定的關(guān)系，晚期癌癥患者對(duì)CagA的免疫反應(yīng)明顯受抑制，胃癌早期患者可出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)14 ，因此，CagA抗體的檢測(cè)十分重要. 圖3 略 pBV220為含PR PL 啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體， 它同時(shí)含有溫度敏感阻抑物cI調(diào)控基因，多酶切位點(diǎn)和兩個(gè)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列，全長(zhǎng)3.66kb9 .為使cagA獲得高效表達(dá)，我們選擇pBV220

15、非融合蛋白表達(dá)載體，用EcoRI+SalI（c1），BamHI+PstI（c2）酶切pUC/cagA，回收酶切目的片段，克隆入pBV220中，重組基因受控于溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子PR PL ，基因起始密碼子ATG與SD序列之間的長(zhǎng)度為713bp，距離合適，結(jié)構(gòu)利于mRNA翻譯起始，因此重組質(zhì)粒得以在宿主菌中高效表達(dá).SDS-PAGE顯示溫度誘導(dǎo)表達(dá)出Mr 36000，27900的單體蛋白，與預(yù)期CagA1，CagA2的Mr 一致.表達(dá)產(chǎn)物占菌體蛋白的36%和24%.這將為發(fā)展簡(jiǎn)便、廉價(jià)的免疫學(xué)診斷cagA+ Hp感染的方法及抗CagA+ Hp疫苗的制備奠定基礎(chǔ). 圖4 略 參考文獻(xiàn): 1Yamaoka

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