土壤真菌的分離

1、土壤真菌的分離實(shí)驗(yàn)口的：掌握從土壤中初步分離培養(yǎng)真菌的方法，從而獲得真菌純培養(yǎng)技能； 了解基本接種技術(shù)。建立嚴(yán)格的無菌操作概念，掌握無菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理:土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生 物的主要菌源。真菌在土壤中的數(shù)量僅次于細(xì)菌和放線菌，主要在有機(jī)質(zhì)豐富、透 氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的真菌并不難，但由于其菌落大，容易擴(kuò) 展，技術(shù)準(zhǔn)確性較低。本實(shí)驗(yàn)采用加有鏈霉素（或氯霉素、慶大霉素）和孟加拉紅的 馬丁氏培養(yǎng)基分離及訃數(shù)土壤中的真菌。在此培養(yǎng)基上，放線菌和細(xì)菌被鏈霉素和 孟加拉紅所抑制，但大多數(shù)真菌能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小，從 而避免了某些

2、真菌的擴(kuò)散蔓延而帶來的數(shù)量上的誤差。實(shí)驗(yàn)器材和材料：（1）器材:臺秤、電子秤、燒杯、試管、三角瓶、量筒、酒精燈、移液管、移液槍、ImL無菌吸管、無菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)。（2）材料:新鮮土 樣、無菌水、馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基。試驗(yàn)方法和步驟：1. 培養(yǎng)基的制備（1）配方：葡萄糖10. 0g、蛋白腺5.0g、瓊脂20g、KHP024l.Og、MgS07, 0 0. 5g、1/3000 孟加拉紅水溶液 100mL、? 420. 03?鏈霉素稀釋液lOOmL、自來水800mL.=（2）操作步驟：1）用搪瓷杯量取自來水500mL置小鋁鍋中，在電爐上加熱。2）按配方分別 稱取各種藥品，加入自來水中，邊加邊攪拌，

3、然后量取100mLl/3000孟加拉紅水溶液加入。3）加入20名浸洗過的瓊脂煮沸至溶化。4）總體積定容至900mL,無需調(diào)節(jié)pH值。5）趁熱分裝于18mmX 180mm試管，每管15mL,塞好棉塞，貼好標(biāo)簽，裝入小鐵絲筐，并用舊報紙將棉塞部分包好。6）高壓蒸汽滅菌，121?滅菌 30mino注意：1）取國產(chǎn)鏈霉素1”瓶，用無菌吸管吸入10mL無菌水溶解，得到10%鏈霉素溶液。取0. 3mL該溶液定容于lOOmL滅菌容量瓶即可得到0.03%鏈霉素溶液。2）使用前，將上述培養(yǎng)基熔化冷卻至55,60?,按每10mL培養(yǎng)基加入ImLO. 03%鏈霉素溶液，即可使每毫升培養(yǎng)基含30ug鏈霉素。2. 土壤

4、稀釋液的制備-5用“稀釋平板計數(shù)法”中的方法進(jìn)行，將土樣稀釋至10。稱取土樣10g放入盛90mL無菌水的三角瓶中，振搖約20分鐘，使土與水充分 混合，將菌分散。在無菌操作條件下，用ImL無菌移-1液管吸取ImLlO濃度的菌液于一管9mL無菌水中，將移液管吹洗三-2-5次，搖勻即為10濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10。注意：在土壤稀釋過程中，吸取不同梯度的菌液需換用不同的吸管。3. 平板分離（1）倒平板將加入鏈霉素溶液的馬丁氏培養(yǎng)基倒平板（方法:右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角 瓶，左手拿平皿并松動棉塞，用小指和無名指夾住拔出，試管（瓶）口在火焰上滅 菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開少許，迅速注

5、入培養(yǎng)基約15mL左右，加 蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板）。（2） 涂布-1-2-3將上述每種培養(yǎng)基的三個平板分別標(biāo)上10、10、10三種稀釋-1-2-3度，然后用三支ImL無菌吸管分別由10、10、10三管土壤稀釋液中各 吸取0. ImL對號放于已標(biāo)好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地 涂布均勻。4. 恒溫培養(yǎng)將上述接種土壤懸液的平板倒置于28?培養(yǎng)3-5do5.挑菌純化從長有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落轉(zhuǎn)接斜面，并同時制片作純度檢 查，若不純，應(yīng)進(jìn)一步挑取該菌落制成菌懸液進(jìn)一步作稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng) 體為止。6. 計數(shù)選擇每皿出現(xiàn)10, 100個菌落的平板，訃算土壤真菌（包括酵母菌）的含量。選擇好訃數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)訃結(jié)果按下式計 算：每呂樣品的菌數(shù)二同一稀釋度兒次重復(fù)的菌落平均數(shù)X10X稀釋倍數(shù)注意：同一稀釋度各個重復(fù)的菌數(shù)相差不太懸殊。這樣求得的是每克原始土樣中的活菌數(shù)，若要折算為每克干土的含菌數(shù)，還應(yīng) 將此數(shù)值除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（烘干土的質(zhì)量/原土樣的質(zhì)量）注:土壤含水量的測定是將一定質(zhì)量的土樣在105,110?下烘干至恒重，再稱干 重。7. 菌種保存將分離到的真菌轉(zhuǎn)