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1、奧林巴斯光學(xué)北京辦事處奧林巴斯光學(xué)北京辦事處齊冬齊冬1.明場(chǎng)觀察明場(chǎng)觀察2.暗場(chǎng)觀察暗場(chǎng)觀察(暗視野暗視野)3.相差觀察相差觀察(相襯觀察相襯觀察)4.偏光觀察偏光觀察5. DIC觀察觀察(微分干涉微分干涉)6. RC觀察觀察(浮雕相襯浮雕相襯)7.熒光觀察熒光觀察常規(guī)觀察方式常規(guī)觀察方式應(yīng)用領(lǐng)域:應(yīng)用領(lǐng)域:常規(guī)鏡檢、病理、染色標(biāo)本優(yōu)點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):視野亮度高、均勻,應(yīng)用范圍廣,操作簡(jiǎn)單,價(jià)格低,物鏡適用于熒光觀察缺點(diǎn):缺點(diǎn):透明標(biāo)本對(duì)比度低,標(biāo)本沒(méi)有立體感刻度指示刻度指示調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)指示N.A聚= =(0 0.6-06-0.8 8)N.A物100%70%30%HRLCHCLRMRMC1 原理
2、原理丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象,微粒對(duì)斜射光反射或衍射,增大了人眼可見(jiàn)性。2 特點(diǎn)特點(diǎn)觀察到極其微小物體,分辨率可達(dá)0.02 0.004 um (明場(chǎng)0.24um)”超顯微“。3 缺點(diǎn)缺點(diǎn)只能觀察到物體存在、運(yùn)動(dòng)和外部形態(tài)不方便調(diào)節(jié)標(biāo)本要求高(灰塵、蓋片、載片)4 應(yīng)用:應(yīng)用:微小粒子、細(xì)菌形態(tài)觀察、細(xì)菌記數(shù),透明標(biāo)本觀察等1 原理原理利用被檢物體的光程(折射率 x 厚度)差進(jìn)行鏡檢,即利用干涉現(xiàn)象,將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€,直射光通過(guò)共軛面:吸收光線,直射光通過(guò)補(bǔ)償面:相位推遲,衍射光通過(guò)補(bǔ)償面:相位推遲,衍射光通過(guò)物鏡物鏡相板相板 聚光鏡環(huán)狀光闌聚光鏡環(huán)狀光闌2
3、特點(diǎn)特點(diǎn)鑒定活體細(xì)胞最實(shí)用、最經(jīng)濟(jì)的方法3 缺點(diǎn)缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高切片不能太厚(210um)蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場(chǎng)物鏡4 應(yīng)用:應(yīng)用:無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu),檢查,鑒定活體細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞,分離細(xì)胞)5 調(diào)節(jié):調(diào)節(jié):苛勒照明調(diào)節(jié)將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路(物鏡聚光鏡相襯環(huán)型號(hào)匹配)對(duì)樣品聚焦取下目鏡,裝上CT望遠(yuǎn)鏡,調(diào)節(jié)CT焦距看到清晰的相差環(huán)調(diào)節(jié)聚光鏡上定位螺絲,使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合1 原理原理依據(jù)波動(dòng)光學(xué)原理觀察和精密測(cè)定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡自然光(多自然光(多振動(dòng)面)振動(dòng)面)偏振器偏振器1偏振器
4、偏振器2偏振光(單偏振光(單一振動(dòng)面)一振動(dòng)面)各向同性:?jiǎn)握凵潴w,光性質(zhì)不因照射方向而改變,普通氣體、液體、非結(jié)晶固體等各向異性:雙折射體,光速度、折射率、吸收和振動(dòng)面、振幅隨照射方向不同,晶體、纖維等應(yīng)用:應(yīng)用:礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別鑒別纖維、染色體、淀粉粒、細(xì)胞中晶體植物病理檢驗(yàn)鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等1 原理原理通過(guò)特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直,強(qiáng)度相等的光束,光束載極近的兩點(diǎn)(小于顯微鏡的分辨率)上通過(guò)被檢物體,從而在相位上略有差別,使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺(jué)。2 特點(diǎn)特點(diǎn)可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺(jué)觀察效果更直觀無(wú)須特殊物鏡,與熒光觀察配合更好可以
5、調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而達(dá)到理想的效果。3 缺點(diǎn)缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高,雙折射物質(zhì)不能達(dá)到DIC鏡檢效果,不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察,鏡檢靈敏度有方向性,調(diào)節(jié)較復(fù)雜4 應(yīng)用:應(yīng)用:無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu),無(wú)無(wú)色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu),無(wú)色熒光標(biāo)本,染色標(biāo)本,顯微操作色熒光標(biāo)本,染色標(biāo)本,顯微操作等等1 原理原理斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射,光線通過(guò)物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影,從而使透明標(biāo)本表面產(chǎn)生明暗差異,增加觀察對(duì)比度。2. 歷史歷史1975年,Robert Hoffman 博士發(fā)明2002年,專利到期,各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品3. 特點(diǎn)特點(diǎn)提高未染色標(biāo)
6、本的可見(jiàn)性和對(duì)比度;圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會(huì)產(chǎn)生光暈;可檢測(cè)雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭) ;可檢測(cè)玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,器官和組織;聚光鏡的工作距離可以設(shè)計(jì)的更長(zhǎng); RC物鏡也可用于明場(chǎng),暗場(chǎng)和熒光觀察4. 缺點(diǎn)缺點(diǎn)觀察效果與標(biāo)本方向密切相關(guān)操作較復(fù)雜必須有多元件,結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高數(shù)值孔徑RC物鏡觀察熒光效果不如明場(chǎng)物鏡5. 應(yīng)用應(yīng)用所有類型的細(xì)胞,組織(無(wú)論活體,染色,未染色),晶體表面細(xì)節(jié),透明聚合物,玻璃和其它類似材料,尤其適用于顯微操作l 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲镔|(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài),再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光,是非高能狀態(tài),
7、再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光,是非溫度輻射光溫度輻射光冷光。即:物質(zhì)吸收短波光,發(fā)冷光。即:物質(zhì)吸收短波光,發(fā)射出的長(zhǎng)波光。射出的長(zhǎng)波光。l顯微鏡熒光利用光源激發(fā)顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光光化熒光寬譜線發(fā)射光寬譜線發(fā)射光(汞燈)(汞燈)濾掉其他光,透過(guò)濾掉其他光,透過(guò)激發(fā)光激發(fā)光激發(fā)濾激發(fā)濾色片色片吸收濾吸收濾色片色片濾掉激發(fā)光,透過(guò)濾掉激發(fā)光,透過(guò)熒光熒光標(biāo)本受激發(fā)產(chǎn)生標(biāo)本受激發(fā)產(chǎn)生熒光向四周發(fā)散熒光向四周發(fā)散激發(fā)光受反射、折射激發(fā)光受反射、折射或衍射向四周發(fā)散或衍射向四周發(fā)散l吸收光,必需有激發(fā)光源吸收光,必需有激發(fā)光源l熒光波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(損失熱能)熒光波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(損失熱能)l熒光強(qiáng)度
8、極小于激發(fā)光的強(qiáng)度熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度l有不同程度的衰減有不同程度的衰減l熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率度、熒光效率優(yōu)點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):l檢出能力高(放大作用)檢出能力高(放大作用)l對(duì)細(xì)胞的刺激?。梢曰铙w染色)對(duì)細(xì)胞的刺激小(可以活體染色)l能進(jìn)行多重染色能進(jìn)行多重染色用途:用途:l物體構(gòu)造的觀察物體構(gòu)造的觀察熒光素?zé)晒馑豯熒光的有無(wú)、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別熒光的有無(wú)、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別抗體抗體熒光等熒光等l發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析發(fā)熒光量的測(cè)定對(duì)物質(zhì)定性、定量分析 透射式透射式l吸收濾色鏡吸收濾色鏡l暗場(chǎng)聚光鏡暗場(chǎng)聚光鏡l激發(fā)濾色
9、鏡激發(fā)濾色鏡l汞燈光源汞燈光源 落射式落射式l吸收濾色鏡吸收濾色鏡l分光鏡分光鏡l激發(fā)濾色鏡激發(fā)濾色鏡l汞燈光源汞燈光源 汞燈光源汞燈光源: :提供激發(fā)光提供激發(fā)光( (U U、V V、B B、G) G) 氙燈光源:氙燈光源: 高峰值更寬,更穩(wěn)定高峰值更寬,更穩(wěn)定 激發(fā)激發(fā)濾色鏡濾色鏡: : 激發(fā)波長(zhǎng)選擇激發(fā)波長(zhǎng)選擇 激發(fā)透鏡組激發(fā)透鏡組(激發(fā)塊)(激發(fā)塊): : T%nmBAND PASS入射光入射光發(fā)射光發(fā)射光激發(fā)激發(fā) 濾色鏡濾色鏡分光分光 濾色鏡濾色鏡吸收吸收 濾色鏡濾色鏡 吸收濾色鏡吸收濾色鏡: :熒光透過(guò)熒光透過(guò), ,阻擋雜光阻擋雜光 分色鏡分色鏡: :反射激發(fā)光反射激發(fā)光, ,熒光
10、透過(guò)熒光透過(guò)A 透過(guò)透過(guò)AA 反射反射BB 透過(guò)透過(guò)B 阻擋阻擋nmnmT%T%A 吸收濾色鏡吸收濾色鏡: :熒光透過(guò)熒光透過(guò), ,阻擋雜光阻擋雜光 分色鏡分色鏡: :反射激發(fā)光反射激發(fā)光, ,熒光透過(guò)熒光透過(guò)A 透過(guò)透過(guò)AA 反射反射BB ,C 透過(guò)透過(guò)nmnmT%T%AC熒光素?zé)晒馑丶ぐl(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange490490590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565
11、565TRITC541541572572Propidium Iodide530530615615SWB: BP420-480SWB: BP420-480WB: BP450-480WB: BP450-480WIB: BP460-490WIB: BP460-490NB: BP470-490NB: BP470-490 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIB光欄全開(kāi)啟光欄全開(kāi)啟光欄適當(dāng)關(guān)小光欄適當(dāng)關(guān)小減少雜散光干擾減少雜散光干擾 防衰減的方法防衰減的方法l使用抗衰減劑使用抗衰減劑l選擇衰減小的熒光素選擇衰減小的熒光素l降低激發(fā)光強(qiáng)度降低激發(fā)光強(qiáng)度l降低標(biāo)本中氧的濃度降低標(biāo)本中氧的濃度有衰減的標(biāo)本有衰減的標(biāo)本燈室,上下、左右旋鈕,聚光鏡旋鈕燈室,上下、左右旋鈕,聚光鏡旋鈕1.明場(chǎng)觀察明場(chǎng)觀察常規(guī)染色片(常規(guī)染色片(HE染色等)染色等)2.暗場(chǎng)觀察暗場(chǎng)觀察微粒外觀(細(xì)菌記數(shù)等)微粒外觀(細(xì)菌記數(shù)等)3.相
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