VP-A-010-00紅霉素中二氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案(0112)

1、編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告0紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告Validation Report of Methylene Chloride and Chloroform Residue Test Method in Erythromycin驗(yàn)證方案編號(hào)：VP-A-012-00版 本 號(hào)：00編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告1目目 錄錄1.概述概述 .21.1 產(chǎn)品概述.21.1.1產(chǎn)品名稱.21.1.2產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)

2、式.21.2 方法建立概述.22.檢測(cè)方法檢測(cè)方法 .32.1 溶劑殘留接受標(biāo)準(zhǔn).32.2 方法描述.32.2.1 儀器.32.2.2 試劑.32.2.3 溶液配制.32.2.4 色譜條件.32.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性.42.2.6 計(jì)算.43 驗(yàn)證內(nèi)容驗(yàn)證內(nèi)容 .53.1 試劑及儀器.5A檢測(cè)用試劑.5B樣品 .5C儀器和設(shè)備 .53.2 驗(yàn)證溶液配制.53.3 操作.63.4 驗(yàn)證項(xiàng)目.63.4.1精密度.63.4.2線性.83.4.3 回收率.83.4.4 定量限、檢測(cè)限.93.4.5耐用性.104.驗(yàn)證結(jié)果評(píng)定與結(jié)論驗(yàn)證結(jié)果評(píng)定與結(jié)論 .11編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉

3、素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告21.1.概述概述1.11.1 產(chǎn)品概述產(chǎn)品概述1.1.1 產(chǎn)品名稱中文名：紅霉素英文名：ERYTHROMYCIN1.1.2 產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)式分子式：C37H67NO13 結(jié)構(gòu)式：1.21.2 方法建立概述方法建立概述我公司生產(chǎn)的紅霉素在生產(chǎn)過程中使用了二氯甲烷，該溶劑的測(cè)定方法按照 VP-A-004-00 進(jìn)行了驗(yàn)證，但是由于使用了 FID 檢測(cè)器，對(duì)二氯甲烷的靈敏度不高，因此驗(yàn)證結(jié)并不是很理想，特別是當(dāng)二氯甲烷的濃 度較低時(shí)，準(zhǔn)確度難以保證，該方法使用電子捕獲檢測(cè)器（ECD）對(duì)二氯甲烷的檢測(cè)重新驗(yàn)證。試劑二氯甲烷中含有少量三氯甲烷，因此同時(shí)對(duì)三氯甲烷

4、也需要檢測(cè)監(jiān)控。色譜系統(tǒng)和條件參照美國(guó)藥典（USP）467 專論和歐洲藥典（Ph.Eur）2.4.24 專論。編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告32.2.檢測(cè)方法檢測(cè)方法2.12.1 溶劑殘留接受標(biāo)準(zhǔn)溶劑殘留接受標(biāo)準(zhǔn)溶劑二氯甲烷三氯甲烷限度600ppm60ppm2.22.2 方法描述方法描述2.2.1 儀器萬分之一分析天平 Agilent6890N GC with 7694E Headspace2.2.2 試劑DMSO(HPLC)；二氯甲烷(AR)；三氯甲烷（AR） 2.2.3 溶液配制樣品溶液：取樣品約 0.50g，精密稱定，用 DMS

5、O 溶解，并稀釋至 50ml；溶劑溶液：取二氯甲烷約 3.0g，三氯甲烷約 0.3g，精密稱定，用 DMSO 溶解，并稀釋至 100ml，精密量取 1.0ml，用水稀釋至 100ml,精密量取 1.0ml，用水稀釋至 10ml。 空白溶液：按照溶劑溶液的配制方法配制空白溶液，但是沒有二氯甲烷和三氯甲烷。 供試液：精密量取 5.0ml 樣品溶液+1.0ml 空白溶液于 20ml 頂空瓶中；（三樣） 對(duì)照液 A：精密量取 5.0ml 樣品溶液+1.0ml 溶劑溶液于 20ml 頂空瓶中；（三樣） 對(duì)照液 B：精密量取 5.0ml DMSO +1.0ml 空白溶液于 20ml 頂空瓶中.2.2.4

6、色譜條件色譜柱：DB624， 30m0.32mm1.8um載氣：氮?dú)?；流速?5cm/s ；頂空溫度：樣品瓶溫 105；定量環(huán)溫 110；傳輸線溫 110；進(jìn)樣條件：加熱平衡 45min，樣品瓶加壓 0.5min，定量環(huán)充樣 0.03min，定量環(huán)平衡0.2min，進(jìn)樣 1.0min；爐溫：40保持 15min，以 20/min 的速度升溫至 240，保持 2min；檢測(cè)器：ECD，溫度 250，進(jìn)樣口溫度 140。操作編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告4進(jìn)樣對(duì)照液 B；進(jìn)樣對(duì)照液 A；進(jìn)樣供試液。2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性對(duì)照液 A 三針的

7、 RSD 不大于 10%2.2.6 計(jì)算 22100TRRTTAMCH CLppmAAM（）3100TRRTTAMCHCLppmAAM（）其中：AT為供試液平均峰面積；AR 為對(duì)照液平均峰面積； MR為對(duì)照液二氯甲烷或三氯甲烷的稱樣量；MT為樣品的稱樣量。編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告53 3 驗(yàn)證內(nèi)容驗(yàn)證內(nèi)容3.13.1 試劑及儀器試劑及儀器A檢測(cè)用試劑檢測(cè)用試劑試劑名稱批號(hào)廠家等級(jí)DMSO408168美國(guó)天地公司HPLC二氯甲烷20040325國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司AR三氯甲烷0603092廣東汕頭市西隴化工廠ARB樣品樣品樣品

8、名稱紅霉素/批號(hào)ERY2-200707001/C儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備儀器名稱型號(hào)數(shù)量校正有效期至氣相色譜儀6890N12009 年 5 月 17 日自動(dòng)頂空進(jìn)樣器7694E12009 年 5 月 17 日3.23.2 驗(yàn)證溶液配制驗(yàn)證溶液配制 樣品溶液配制：取樣品約 2.5g，精密稱定,用 DMSO 溶解并稀釋至 250ml。 對(duì)照儲(chǔ)備液：取二氯甲烷約 3.0g，三氯甲烷約 0.3g，精密稱定，用 DMSO 溶解并稀釋至 100ml，精密量取 1.0ml， 用水稀釋至 100ml。 各濃度對(duì)照液：分別取對(duì)照儲(chǔ)備液 1.0ml，2.0ml，4.0ml，5.0ml 和 7.5ml 于 5 個(gè)50m

9、l 容量瓶中，用水稀釋至刻度。配制成 20%，40%，80%，100%和 150%的對(duì)照液。 空白溶液：按照對(duì)照液的配制方法配制空白溶液，但是沒有二氯甲烷和三氯甲烷。 0%溶液：精密量取 5.0ml 樣品溶液+1.0ml 空白溶液于 20ml 頂空瓶中(平行三樣)； 20%-150%樣品溶液：精密量取 5.0ml 樣品溶液+1.0ml 對(duì)應(yīng)濃度對(duì)照液于 20ml 頂空瓶中(平行三樣)；100% 對(duì)照溶液：精密量取 5.0ml DMSO +1.0ml 對(duì)應(yīng)濃度對(duì)照液 (100%)于 20ml 頂空瓶中（平行六樣） 。編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方

10、法驗(yàn)證報(bào)告63.33.3 操作操作按照 0%、20%、40%、80%、100%、150%樣品溶液、100%對(duì)照的順序進(jìn)樣，記錄各樣的峰面積，結(jié)果見表 1。 （以下記錄峰面積均為扣除空白后面積）表 1溶液0%20%40%80%100%150%100%對(duì)照55.4373.6719.41221.21516.12159.51615.01536.651.5383.6713.11233.91480.52099.61535.51546.5二氯甲烷56.0390.6736.01178.41450.02011.61516.21545.8平均值54.3382.6722.81211.21482.22090.2154

11、9.3RSD4.5%2.2%1.6%2.4%2.2%3.6%2.2%372.01329.42634.44841.56295.39615.56536.66326.9332.51357.72603.44905.56144.99277.76271.76359.5三氯甲烷363.81415.52707.44724.56039.58909.26184.36296.2平均值256.11367.62648.44823.86159.99267.56329.2RSD5.8%3.2%2.0%1.9%2.1%3.8%1.9%操作人/日期： 3.43.4 驗(yàn)證項(xiàng)目驗(yàn)證項(xiàng)目3.4.1精密度精密度1系統(tǒng)精密度計(jì)算 40%

12、、80%、150%樣品溶液各自三針的 RSD，查看系統(tǒng)精密度（具體數(shù)據(jù)參見表 1） ，結(jié)果見表 2。表 2溶液濃度40%80%150%二氯甲烷 RSD1.6%2.4%3.6%三氯甲烷 RSD2.0%1.9%3.8%編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告72方法精密度計(jì)算 100%對(duì)照液 6 針的 RSD， 查看方法精密度，結(jié)果見表 3。表 3測(cè)定次數(shù)123456RSD二氯甲烷面積1615.01536.61535.51546.51516.21545.82.2%三氯甲烷面積6536.66326.96271.76359.56184.36296.21

13、.9%結(jié)論： 該方法精密度良好，RSD 均小于 3.0%，能滿足分析要求。操作者/日期： 3中間精密度按照 3.3.2 配制溶液 40%（三份） 、80%（三份） 、和 150%（三份） ，100%對(duì)照溶液（六份） ，在另一天由另一 QC 員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。計(jì)算中間精密度，結(jié)果見表 4、表 5。表 4溶液濃度40%RSD80%RSD150%RSD482.5998.61621.7477.41028.91583.3二氯甲烷444.14.5%1011.61.5%1647.22.0%1951.54298.57371.91981.94464.97197.7三氯甲烷1850.13.6%4366.41.9%752

14、3.32.2%結(jié)論：中間精密度良好，RSD 均小于 5.0%，表明方法重現(xiàn)性較好操作者/日期：編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告8表 5測(cè)定次數(shù)123456RSD二氯甲烷面積1290.01264.41216.01211.71226.21201.92.8%三氯甲烷面積6046.95560.45353.25309.25384.35366.85.1%結(jié)論：結(jié)果表明儀器精密度良好，RSD 小于 10.0%。操作者/日期： 3.4.2線性線性把 20%、40%、80%、100%，150%樣品溶液的峰面積平均值分別減去溶液 0%的平均值，以溶液中二氯

15、甲烷和三氯甲烷的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行二元線性回歸，計(jì)算方法的線性和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表 6。表 6溶液濃度0%20%40%80%100%150%峰面積54.3382.6722.81211.21482.22090.2二氯甲烷調(diào)整面積/328.3668.51156.81427.92035.9峰面積256.11367.62648.44823.86159.99267.5三氯甲烷調(diào)整面積/1059.52351.34368.45683.48553.1二氯甲烷線性公式： y=43.215x112.26 r2=0.9976三氯甲烷線性公式： y=1957.5x52.095 r2=0.9996要求

16、：r20.98結(jié)論：線性關(guān)系良好,線性范圍分別為: 二氯甲烷 119891ppm，三氯甲烷 1287ppm。操作者/日期： 3.4.3 回收率回收率把樣品溶液 20%、40%、80%、100% 150%的峰面積平均值分別減去溶液 0%的平均值，再除以對(duì)照 100%的平均值，分別乘以 5、2.5、1.25、1.0、0.667。以考察各個(gè)濃度下方法的回收率?；厥章蕬?yīng)在 80%-120%之間，結(jié)果見表 7。編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告9表 7溶液濃度0%20%40%80%100%150%峰面積54.3382.6722.81211.2148

17、2.22090.2調(diào)整峰面積/328.3668.51156.81427.92035.9二氯甲烷回收率/106%108%93%92%88%峰面積256.11367.62648.44823.86159.99267.5調(diào)整峰面積/1059.52351.34368.45683.48553.1三氯甲烷回收率/84%93%86%90%90%結(jié)論：二氯甲烷及三氯甲烷回收率均在 80%120%之間，符合回收率要求。二氯甲烷平均回收率為 97%，說明用該方法進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確度高；三氯甲烷平均回收率為 89%，略偏低，但仍能滿足分析要求。操作者/日期： 3.4.4 定量限、檢測(cè)限定量限、檢測(cè)限把對(duì)照 100%用 D

18、MSO 不斷稀釋，計(jì)算待測(cè)信號(hào)的信噪比，以確定 待測(cè)溶劑的檢測(cè)限和定量限，以及他們?cè)跇悠分械暮肯薅?，結(jié)果見表 8。 表 8檢測(cè)限定量限S/N濃度(ug/ml) 樣品中殘留量S/N濃度(ug/ml) 樣品中殘留量二氯甲烷2.90.36ppm11.9120ppm三氯甲烷3.80.010.3ppm11.70.031ppm結(jié)論：由上述實(shí)驗(yàn)可以看出，使用 ECD 檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，響應(yīng)值大。二氯甲烷檢測(cè)限為 6ppm，定量限為 20ppm；三氯甲烷檢測(cè)限為 0.3ppm，定量限為 1ppm。操作者/日期： 編號(hào)：VP-A-012-00 版本號(hào)：00 紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)

19、告103.4.5耐用性耐用性 用對(duì)照 100%溶液來考察方法的耐用性，僅進(jìn)行單因素條件試驗(yàn)，不進(jìn)行正交試驗(yàn)（即只改變某一個(gè)條件，其它條件不變） ，以二氯甲烷及三氯甲烷的峰面積為考查對(duì)象，計(jì)算 RSD，結(jié)果見表 9。方面包括如下： 1）頂空瓶平衡時(shí)間考查 40min、45min、50min； 2）色譜柱初始溫度考查 42、40、38 3）載氣流速 35cm/s、38cm/s、32cm/s 表 9二氯甲烷三氯甲烷123RTAreaRSDRTAreaRSD4540354.6811104.48.5763997.34538354.8721082.69.0923902.34542354.4601097.61.0%8.0213942.41.2%4040354.6571285.58.5354542.24540354.6561266.48.5324494.65040354.6581214.12.9%8.5374295.32.9%4540384.3131207.17.8884421.1454