醋酸乙酯萃取綠原酸過程研究

1、醋酸乙酯萃取綠原酸過程研究作者：楊海燕，孫海峰，汪愛國(guó)，陳福明，郭志剛【關(guān)鍵詞】萃取;，綠原酸;，純化摘要：對(duì)金銀花粗提粉中萃取高純度綠原酸的方法進(jìn)行了研究。萃取分配系 數(shù)d測(cè)定結(jié)果表明，醋酸乙酯是純化綠原酸的適用溶劑。四級(jí)萃取的綠原酸回收 率將近90%,得到的產(chǎn)品經(jīng)uv和hplc檢測(cè)綠原酸含量分別為69. 1%和35. 2%。 從lc-ms檢測(cè)結(jié)果推斷，產(chǎn)品中含有綠原酸異構(gòu)體和異綠原酸。關(guān)鍵詞：萃??；綠原酸；純化study of extracting process of chlorogenic acid by ethyl acetateabstract: the extraction me

2、thod of chlorogenic acid (cga) f rom the crude honeysuckle powder is studied the distribution coefficient d indicated: ethyl acetate was the most suitable extractant f or cga's pur ificat ion. after 4-stage extractions, test date showed that cga's content of the product were 35. 2% and 69. 1

3、% by hplc and uv respectively. the experimental cga recovery ratio was almost 90%. the product was determined containing cga's isomer and isochlorogenic acid by lcms testkey words: extraction; chlorogenic acid; purification綠原酸(chlorogenic acid )是由咖啡酸(caffeic acid )與奎尼酸(雞納 酸，quinic acid,即1輕基六氫沒食子

4、酸)組成的縮酚酸，異名咖啡軟酸，化學(xué) 名30咖啡酰奎尼酸(30caffeoylquinic acid ),分子量：354.30,是植物體在有 氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，為眾多藥材(如金銀花、 茵陳、杜仲)以及中成藥(如復(fù)肝寧、雙花注射液)抗菌解毒、消炎利膽的主要 有效成分，同時(shí)是某些中藥制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)1。隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程 的加快，制藥廠家對(duì)金銀花等的提取物要求越來越高，特別是歐、美國(guó)家制藥企 業(yè)要求中藥提取物中的單體成份越純?cè)胶?，以便定性定量分析、使用。目前，?國(guó)以金銀花為原料加工制成的市售產(chǎn)品除復(fù)方制劑外，多為浸膏或粗粉2,其 中綠原酸含量較低，高含量的綠

5、原酸產(chǎn)品上市量很少，且價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿 足市場(chǎng)需求。研究新的高含量綠原酸提取分離方法，降低提取分離成本是當(dāng)務(wù)之 急。目前從金銀花中提取高純度綠原酸的研究方法主要有溶劑萃取法和大孔樹脂 吸附法。前者容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，可選擇的溶劑包括醋酸乙酯、正丁醇、異戊 醇，后者在進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)時(shí)存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，故而本文以市售金銀花粗 粉為原料，選擇沸點(diǎn)低、價(jià)格低的醋酸乙酯為溶劑對(duì)綠原酸進(jìn)行萃取純化，探討 萃取過程的影響因素，為下一步工業(yè)化生產(chǎn)高純度綠原酸奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料與儀器采用水提制備的金銀花粗提粉，購于安徽宣城百草植物工貿(mào) 有限公司。綠原酸對(duì)照品購自美國(guó)sigma公司。醋酸乙酯

6、等均為分析純。美國(guó) agilent公司1100型高效液相色譜。美國(guó)agilent公司8453型分光光度計(jì)。 agilent 1100型高效液相色譜-esquire 2000型離子阱質(zhì)譜檢測(cè)儀。質(zhì)譜掃描條 件：離子化源為電噴霧離子化源esi,檢測(cè)方式為二級(jí)質(zhì)譜，全范圍為50 2 200 m/z,加熱毛細(xì)管溫度為300°co1.2工藝流程金銀花粗提粉-水溶一醇沉一蒸去乙醇一醋酸乙酯萃取 t減壓濃縮-冷凍干燥金銀花粗提粉水溶液的醇沉過程本文作者已進(jìn)行了詳細(xì) 研究，確定最佳醇沉度為60%,醇沉可有效去除金銀花粗粉中的雜質(zhì)，有關(guān)研究另 文陳述。醇沉后離心過濾，回收乙醇，剩余液用鹽酸調(diào)節(jié)ph后進(jìn)

7、行萃取。1. 3綠原酸含量測(cè)定1. 3. 1 uv法準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)品10 mg,用50%甲醇定容至100 ml,分別用 50%甲醇稀釋10, 5, 3. 33, 2. 5, 2, 167倍，以50%甲醇為空白，用1 cm比色 杯于327 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸收度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪 制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到回歸方程：y= 18. 302x, r=0. 999 5。綠原酸含量 在10.0-60.0 nig/ml,范圍內(nèi)，濃度與吸光度間呈良好的線性關(guān)系。1. 3.2 hplc法含量測(cè)定色譜條件：參照2005年版中國(guó)藥典附錄中綠原 酸的高效液相色譜法3。色譜柱：zorbax

8、c18 ods （ 250 mm x 4. 6 mm, 5 pm）; 流動(dòng)相：乙m-0. 4%磷酸溶液（13 : 87）;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;柱溫：25°c;進(jìn)樣 量：20 m l 線性回歸方程：y= 4& 64x-52. 57, r=0. 999 1 o 綠原酸在 26. 0- 173.3 mg/ml與峰面積呈良好的線性關(guān)系。14總糖含量測(cè)定采用蔥酮硫酸法4 。線性回歸方程：y= 196. 96 x, r=0. 998 9?？偺窃?.0-100.0 mg/ml范圍內(nèi)，濃度與吸光度間呈良好的線性關(guān)系。2結(jié)果與分析2.1原料含量分析將金銀花粗提粉制成供試液，其中總糖含量為4

9、3.33%,總 綠原酸含量為12. 0%,綠原酸含量為5. 5% （ hplc測(cè)定）。2.2金銀花粗提粉在醋酸乙酯水體系中的d值測(cè)定預(yù)先配制醋酸乙酯與去 離子水體積比為1 ： 1混溶分相后的上、下相。隨后稱取10 g粗粉，溶于100 ml 配制好的下相中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph=2. 0,量取50 ml該溶液，加入到100 ml分 液漏斗中，加入等體積預(yù)先混溶過的醋酸乙酯，充分振搖20 min,達(dá)到平衡后， 分出上、下相，分別取1 ml用甲醇稀釋測(cè)定濃度。測(cè)得在醋酸乙酯-水體系中的 萃取分配系數(shù)0=0.69.參考綠原酸在其它溶劑體系5的d值（見表1）可以 看出，綠原酸在醋酸乙酯里的分配比較大，醋酸乙

10、酯較正丁醇而言，沸點(diǎn)低，便 于回收溶劑，且價(jià)格低廉。表1綠原酸在不同溶劑體系的d值（略）2. 3 ph對(duì)萃取結(jié)果的影響分別稱10 g金銀花粗提粉配成50 ml水溶液，用 一定濃度的鹽酸溶液分別調(diào)ph值為1.0, 2.0, 7.0,用醋酸乙酯按相比1分別稱 10 g金銀花粗提粉配成50 ml水溶液，用一定濃度的鹽酸溶液分別調(diào)ph值為1. 0, 2.0, 7.0,用醋酸乙酯按相比1 ： 1四級(jí)錯(cuò)流萃取，各自合并上相。用紫外測(cè)定產(chǎn) 品中的總綠原酸和總糖量。結(jié)果見表2。1四級(jí)錯(cuò)流萃取，各自合并上相。用紫外 測(cè)定產(chǎn)品中的總綠原酸和總糖量。結(jié)果見表2。表2不同ph條件下萃取測(cè)定結(jié)果（略）結(jié)果表明，ph小于

11、2的酸性條件下綠原酸的萃取收率高，表明綠原酸以分子 酸的形式更容易被萃取到有機(jī)相，但相應(yīng)的產(chǎn)品中測(cè)到總糖含量也較高，分析認(rèn) 為，除了由于粗提物中的部分多糖被混溶到有機(jī)相的水帶進(jìn)產(chǎn)品以外，粗提物中 的黃酮昔也被萃取到了有機(jī)相所致。2.4萃取時(shí)間對(duì)綠原酸收率的影響采用電磁攪拌裝置考察醋酸乙酯對(duì)綠原酸 的萃取速率。結(jié)果見圖1。圖1表明，醋酸乙酯萃取綠原酸的過程為一快速過程, 3 min即已達(dá)到平衡，延長(zhǎng)萃取時(shí)間對(duì)綠原酸收率影響不大，因此其余實(shí)驗(yàn)的萃 取時(shí)間均選擇5 min。 圖1萃取時(shí)間對(duì)綠原酸收率的影響（略）2.5多級(jí)萃取實(shí)驗(yàn)醋酸乙酯在原料液ph=l. 5的條件下萃取綠原酸的分配比 為069,在該

12、萃取條件下，根據(jù)萃取公式計(jì)算，當(dāng)有機(jī)相和水相體積比等于1時(shí), 進(jìn)行n級(jí)萃取后，綠原酸的萃取回收率p=l-l/ （1+k） n,通過計(jì)算，當(dāng)進(jìn)行4 級(jí)萃取后綠原酸的萃取率可達(dá)87.74%。為此進(jìn)行4級(jí)萃取實(shí)驗(yàn)：將50 g粗提粉 用100 ml水溶解后，調(diào)節(jié)ph=25,加入醋酸乙酯經(jīng)過4級(jí)萃取，萃取液和萃余 液分別進(jìn)行濃縮、冷凍干燥得到產(chǎn)品。精密稱取樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果見表3。表3四級(jí)錯(cuò)流萃取測(cè)定結(jié)果（略）hplc分析結(jié)果得出，產(chǎn)品中綠原酸含量35.2%,收率為90.52%,實(shí)驗(yàn)值和理 論預(yù)測(cè)值吻合較好。根據(jù)綠原酸uv法分析結(jié)果，產(chǎn)品中綠原酸含量為69.1%,收 率為81.44%,這個(gè)結(jié)果比hp

13、lc法測(cè)定值偏高，表明產(chǎn)品中除綠原酸外還含有綠 原酸的異構(gòu)體、異綠原酸、咖啡酸等在327 nm處也有紫外吸收的物質(zhì)。2.6萃取產(chǎn)物成分鑒定將萃取產(chǎn)品進(jìn)行l(wèi)c-ms檢測(cè)，液相流動(dòng)相條件為：甲 醇-0.5%乙酸溶液（40 : 60 ）;檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm;柱溫：25°c。圖1所示為液相 的紫外圖譜，產(chǎn)品中有7個(gè)含量較高的化合物，分別對(duì)應(yīng)于7個(gè)峰，峰1, 2, 3,4, 5, 6, 7。其保留時(shí)間（tr）分別為 2. 260, 2.684, 3. 176, 3.709, 4. 831 ,5. 483, & 879 min,峰1至7分別所對(duì)應(yīng)的化合物準(zhǔn)分子離子峰m/z依次等于37

14、7, 377, 377, 391 , 539, 539, 539,均為m+na +峰，計(jì)算出對(duì)應(yīng)化合物的分子量 分別為354, 354, 354, 368, 516, 516, 516。因此推斷其中的峰1, 2, 3應(yīng)歸 屬為綠原酸及其同分異構(gòu)體（理論分子量354.30 ）,峰5、6、7歸屬為異綠原酸（理論分子量516. 44 ）。峰1,2,3的二級(jí)質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)了離子峰m/z等于214. 9 的碎片離子峰（參看圖3）,表明是綠原酸分子離子脫去咖啡酸后的奎尼酸。峰6 和7的二級(jí)質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)了離子峰m/z等于377的碎片離子峰（參看圖4）,表 明是異綠原酸分子離子脫去一分子咖啡酸所得。推測(cè)峰4為綠原酸甲酯。圖2萃取產(chǎn)物的hplc-ms譜圖分析結(jié)果示意圖（略）圖3組分2質(zhì)譜圖（略）圖4組分6, 7的質(zhì)譜圖（略）3結(jié)論對(duì)金銀花粗粉在醋酸乙酯-水體系中的萃取分配系數(shù)測(cè)定得d=0.69,表明醋 酸乙酯是萃取綠原酸的適用溶劑，ph小于2的酸性條件下綠原酸的萃取收率高。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過4級(jí)錯(cuò)流萃取，粗粉中將近90%的綠原酸被萃取到上相，所 得萃取產(chǎn)品中綠原酸的含量經(jīng)uv檢測(cè)為69. 1%,經(jīng)hplc檢測(cè)為35.2%。對(duì)醋酸 乙酯萃取產(chǎn)物做lc-ms檢測(cè)，結(jié)果推斷產(chǎn)品中含有綠原酸和異綠原酸。參考文