蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀與展望

1、學(xué)院畢業(yè)論文論文題目：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀與展望學(xué)生院（系）名稱(chēng) 專(zhuān)業(yè)名稱(chēng) 年級(jí)班級(jí) 指導(dǎo)教師 指導(dǎo)教師職稱(chēng)雪化學(xué)與化工學(xué)院生物制藥技術(shù)2009級(jí)2班磊山副教授目錄容摘要1關(guān)鍵詞1AbstractlKey wordsl前言22蛋白質(zhì)的作用222.1 研究方法簡(jiǎn)介32.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的方法45蛋白質(zhì)幾何的表示方法6與勢(shì)能搜索方法66與比擬74.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確定788899與蛋白質(zhì)折疊的研究概況96.2 蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)106.3 蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶11 前景展望11參考文獻(xiàn)13致14容摘要：蛋白質(zhì)是一種生物大分子，多是由20種氨基酸以肽鍵連接成肽鏈。肽 鏈再進(jìn)一步空間卷曲折疊成為特

2、定的空間結(jié)構(gòu)，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。有的蛋白質(zhì)由多條肽鏈組成，每條肽鏈稱(chēng)為亞基，亞基之間又有特定的空間關(guān)系，稱(chēng)為蛋白質(zhì) 的四級(jí)結(jié)構(gòu)。因此蛋白質(zhì)分子往往具有特定的復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析可以從根本上說(shuō)明蛋白質(zhì)功能的分子機(jī)制和根底，同時(shí)也是研究蛋白質(zhì)功能的一個(gè)重途徑。本文將對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究概況以與意義進(jìn)展綜述，并在此根底之上對(duì)今后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究提出了一些自己的看法。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究相互作用折疊Abstract: Proteins are biological macromolecules,mostly from 20 kinds of amino acids connecte

3、d by peptide bonds into the peptide chain. Further space in the peptide chain folds into a specific space curled structure, including secondary and tertiary structure. Some of the protein by the number of peptide chains, called subunits of each peptide chain, subunits have specific spatial relations

4、hips between the known quaternary structure of proteins. So often with a specific protein plex spatial structure.For protein structure analysis can clarify the fundamental mechanism of protein function and molecular basis of protein function is also an important way.This paper will overview the stud

5、y of protein structure and meaning are reviewed,and on this basis for future studies of protein structure presented some of his views.Key words: Protein structure interaction fold、/' 、.刖B人類(lèi)進(jìn)入21世紀(jì)之際，生命科學(xué)也迎來(lái)了一個(gè)嶄新的時(shí)代。2001年2月12日參與人類(lèi)基因組計(jì)劃的六國(guó)科學(xué)家共同向世人正式公布了人類(lèi)基因組圖譜與初步分析結(jié) 果，這是生命科學(xué)史，也是人類(lèi)科學(xué)史上的又一次飛躍，同時(shí)標(biāo)志著后基因

6、組時(shí)代的 降臨，但是隨著大量生物體全基因組序列的獲得， 人們發(fā)現(xiàn)僅從基因組序列的角度根 本無(wú)法完整、系統(tǒng)地說(shuō)明生物體的功能。蛋白質(zhì)作為生命體的主要組成成分和生命活 動(dòng)的主要執(zhí)行者，正在成為新的研究熱點(diǎn)；而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)如此是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的 一個(gè)重要環(huán)節(jié)。以蛋白質(zhì)為主體的生物大分子的功能主要取決于它們的三維結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)與相互作用。只有全面了解相關(guān)蛋白質(zhì)與其復(fù)合物、組裝體的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng) 和相互作用網(wǎng)絡(luò)，與其在亞細(xì)胞、細(xì)胞層次上表現(xiàn)出來(lái)的生命活動(dòng)的功能關(guān)系，才能 最終闡釋人類(lèi)個(gè)體發(fā)育、生長(zhǎng)、衰老和凋亡機(jī)理，才能在分子和原子水平上理解神經(jīng) 活動(dòng)、認(rèn)知等腦功能表現(xiàn)機(jī)理，細(xì)胞增殖、分化和凋亡機(jī)理，信息

7、傳遞和作用機(jī)理， 疾病發(fā)生、開(kāi)展機(jī)理等一切生命科學(xué)問(wèn)題。1 .蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介蛋白質(zhì)的作用蛋白質(zhì)Protein是細(xì)胞組分中含量最為豐富、功能最多的高分子物質(zhì)，在生命 活動(dòng)過(guò)程中起著各種生命功能執(zhí)行者的作用，幾乎沒(méi)有一種生命活動(dòng)能離開(kāi)蛋白質(zhì)， 所以沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。在人體中，蛋白質(zhì)的主要生理作用表現(xiàn)在六個(gè)方面：（1） 構(gòu)成和修復(fù)身體各種組織細(xì)胞的材料；（2）構(gòu)成酶、激素和抗體；（3）維持正常的血漿 滲透壓，使血漿和組織之間的物質(zhì)交換保持平衡；（4）供應(yīng)肌體能量；（5）維持肌體的酸堿平衡；（6）運(yùn)輸氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。1.2蛋白質(zhì)的元素組成與分子組成蛋白質(zhì)是化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一類(lèi)有機(jī)化合物，是人體的必須營(yíng)養(yǎng)

8、素。其主要是由碳、 氫、氧、氮、硫、磷、碘、鐵、鋅等元素組成。蛋白質(zhì)分子的根本單位是氨基酸，它是由多種不同的氨基酸通過(guò)肽鍵相互連接而 成。蛋白質(zhì)在受到酸、堿或酶的作用下最終水解成氨基酸。 組成自然界蛋白質(zhì)的氨基 酸主要有20種，具化學(xué)結(jié)構(gòu)具有共同的特點(diǎn)，即在連接竣基的e碳原子上，還有一個(gè)氨基，故稱(chēng)a-氨基酸。可用下式表示：不同的氨基酸其側(cè)鏈（R）各異。除甘氨酸外， 其余氨基酸的a-碳原子均為不對(duì)稱(chēng)碳原子，故有 L型或D型之分。組成天然蛋白質(zhì) 的氨基酸，除甘氨酸外，都是 L-0-氨基酸。2 .蛋白質(zhì)的研究研究方法簡(jiǎn)介目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法按照其對(duì)模板的依賴(lài)與否主要分為兩類(lèi)：模板依賴(lài)模型以與從頭預(yù)

9、測(cè)方法自由模型。模板依賴(lài)模型又可以分為兩種模型：同源模型（比擬 模型）和折疊識(shí)別模型（穿線(xiàn)法）。兩種方法的差異在于模板的同源度。同源模型所 使用的模板擁有較高的同源度，序列相似度一般大于30 %;折疊識(shí)別模型所使用的模 板為遠(yuǎn)程同源關(guān)系。兩種方法所采用的預(yù)測(cè)步驟根本一致：（1）搜索結(jié)構(gòu)模型的模板： 即為待預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列尋找具有同源性的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)作為模板。（2）序列比對(duì)：將目標(biāo)蛋白質(zhì)的序列與模板蛋白質(zhì)序列進(jìn)展比對(duì)，使目標(biāo)序列的氨基酸殘基與模板蛋白 質(zhì)的殘基匹配。（3）建立骨架:將模板結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)拷貝到目標(biāo)序列，僅拷貝匹配殘基的 坐標(biāo)。通過(guò)這一步建立目標(biāo)蛋白質(zhì)的骨架。（4）構(gòu)建目標(biāo)蛋白質(zhì)的側(cè)鏈與環(huán)

10、區(qū)：可將模板一樣殘基的坐標(biāo)直接作為目標(biāo)蛋白質(zhì)的殘基坐標(biāo)，對(duì)于不完全匹配的殘基，其側(cè)鏈構(gòu)象是不同的，需要進(jìn)一步預(yù)測(cè)。其中前兩步是預(yù)測(cè)方法的關(guān)鍵。當(dāng)目標(biāo)序列沒(méi)有同源結(jié)構(gòu)時(shí)，進(jìn)展蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)就必須使用從頭預(yù)測(cè)方 法。從頭預(yù)測(cè)方法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)一般由如下3個(gè)局部組成：（1） 一種蛋白質(zhì)幾何的表示方法：由于表示和處理所有原子和溶劑環(huán)境的計(jì)算開(kāi)銷(xiāo)非常大，因此需要對(duì)蛋白質(zhì)和溶劑的表示形式作近似處理，例如，使用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)原子代表一個(gè)氨基 酸殘基；（2） 一種勢(shì)能函數(shù)與其參數(shù)：或者一個(gè)合理的構(gòu)象得分函數(shù)，以便計(jì)算各種構(gòu) 象的能量；（3） 一種構(gòu)象空間搜索技術(shù)：必須選擇一個(gè)優(yōu)化方法，以便對(duì)構(gòu)象空間進(jìn)

11、展 快速搜索，迅速找到與某一全局最小能量相對(duì)應(yīng)的構(gòu)象。 其中，構(gòu)象空間搜索和能量函 數(shù)的建立是從頭預(yù)測(cè)方法的關(guān)鍵。2.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法主要包括 X射線(xiàn)晶體學(xué)、核磁共振波譜學(xué)技術(shù)和三維電鏡 重構(gòu)。這三種方法都可以完整獨(dú)立地在原子分辨水平上測(cè)定出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié) 構(gòu)。X-射線(xiàn)晶體學(xué)是最早也是最主要的測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，第一個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)一一血紅蛋白的結(jié)構(gòu)就是通過(guò)X-射線(xiàn)晶體學(xué)方法解析的。目前PDB中收錄的蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)85%左右是利用X射線(xiàn)晶體學(xué)方法解析的。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的 X射線(xiàn)衍射分 析包含樣品制備、蛋白質(zhì)結(jié)晶、衍射數(shù)據(jù)收集和處理、相位求解、模型建立和修正等 五

12、個(gè)主要步驟。五個(gè)步驟彼此密切相關(guān)，每一個(gè)局部取得進(jìn)展可以加快下一步的研究， 同樣任何一個(gè)局部的瓶頸也可以成為下一步的限速步驟。其中樣品制備和蛋白質(zhì)結(jié)晶階段是要獲得足夠量的蛋白樣品以與可以用于衍射數(shù)據(jù)收集的高質(zhì)量單品，前者可以通過(guò)針對(duì)所選目的基因的特性構(gòu)建和改造高效表達(dá)質(zhì)粒，而后利用多種表達(dá)系統(tǒng)，高質(zhì)量單晶的獲得是蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)研究的主要瓶頸之一，由于不同蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)差異以與各種修飾和相互作用更增加了蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，所以不是所有的蛋白質(zhì)都可以獲得單晶的。1990年以后，利用X-射線(xiàn)晶體學(xué)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)取得了突飛猛進(jìn)的開(kāi)展，目前 平均每天有15個(gè)蛋白質(zhì)通過(guò)該方法獲得結(jié)構(gòu)。X-射線(xiàn)晶體學(xué)的缺

13、點(diǎn)是分子在晶體中往 往是被鎖定于某一狀態(tài)，所得到的晶體往往是分子處于基態(tài)或不同構(gòu)象的平均，而分子行使功能時(shí)多發(fā)生在激發(fā)態(tài)、過(guò)渡態(tài)、X-射線(xiàn)晶體技術(shù)很難捕捉到分子的動(dòng)態(tài)信息 10但是無(wú)論怎樣，X-射線(xiàn)晶體學(xué)方法無(wú)論過(guò)去、現(xiàn)在或?qū)?lái)都會(huì)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究 的主要方法。2.2.2核磁共振波譜學(xué)核磁共振波譜學(xué)是對(duì)X-射線(xiàn)晶體學(xué)的有力補(bǔ)充。目前，該技術(shù)已經(jīng)成為確定生物 大分子溶液三維空間結(jié)構(gòu)的主要手段2。核磁共振波譜學(xué)技術(shù)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋 白質(zhì)-DNA等分子間的相互作用方面，具有高分辨率的特點(diǎn)，僅次于 X-射線(xiàn)晶體學(xué)技 術(shù)，可以在溶液中操作，在近似蛋白質(zhì)生理環(huán)境下測(cè)定其結(jié)構(gòu)，甚至可以對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)

14、進(jìn)展分析，獲得 活的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。核磁共振波譜學(xué)技術(shù)在分析蛋白質(zhì)折 疊穩(wěn)定性、運(yùn)動(dòng)性和蛋白質(zhì)復(fù)合體中各亞基的相互作用方面具有優(yōu)勢(shì)。核磁共振波譜學(xué)技術(shù)的缺點(diǎn)是只能測(cè)定小蛋白和中等大小的蛋白質(zhì)分子（相對(duì)分子質(zhì)量一般在30000以下），并且圖譜分析工作極為費(fèi)時(shí)，往往需要數(shù)月到一年的時(shí)間，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周 期延長(zhǎng)，速度緩慢；另外核磁共振衍射技術(shù)的反響是在溶液中進(jìn)展的，研究對(duì)象必須是可溶的蛋白，對(duì)不溶蛋白的研究就比擬困難；而且樣品需要同位素標(biāo)記等，這些在 一定程度上制約了核磁共振波譜學(xué)技術(shù)的應(yīng)用。隨著一些新技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，如G矩陣傅立葉變換式核磁共振波譜學(xué)技術(shù)等，使得核 磁共振波譜學(xué)的開(kāi)展速度也很快，目前PDB中收

15、錄的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)15%左右是利用核 磁共振波譜學(xué)方法解析的，具快速開(kāi)展主要?dú)w功于以下幾個(gè)方面： 儀器技術(shù)的不斷開(kāi) 展，計(jì)算速度的飛速提升和實(shí)驗(yàn)方法上的不斷創(chuàng)新和開(kāi)展3。1990年以前平均每年只能解10個(gè)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)在平均每天可以解2個(gè)結(jié)構(gòu)，相信隨著核磁共振波譜學(xué)技術(shù)不斷 的改良和開(kāi)展，核磁共振波譜學(xué)技術(shù)在未來(lái)結(jié)構(gòu)生物學(xué)上的貢獻(xiàn)將會(huì)越來(lái)越大。 2.2.3三維電鏡重構(gòu)電子顯微鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用近年來(lái)變得越來(lái)越重要，成為解析大型蛋白質(zhì)復(fù)合體、病毒乃至細(xì)胞器的三維納米分辨率結(jié)構(gòu)的有力手段，同時(shí)電子顯微鏡二維晶體學(xué)在膜蛋白的三維精細(xì)結(jié)構(gòu)解析上也有特殊的優(yōu)勢(shì)。冷凍電鏡三維重構(gòu)的根本技術(shù) 路線(xiàn)為：利用快速冷

16、凍技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)展冷凍固定，然后利用冷凍電鏡和低劑量成像技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)展電子成像，利用高靈敏底片進(jìn)展成像記錄，利用高分辨率掃描儀對(duì)底片 進(jìn)展數(shù)字化，對(duì)數(shù)字化的圖像進(jìn)展二維圖像分析 一一選點(diǎn)、分類(lèi)、校正和平均，最后 完成樣品的三維重構(gòu)計(jì)算。自從1968年DeRosier和Klug第一次用電子顯微鏡對(duì)T4 噬菌體的尾部進(jìn)展了結(jié)構(gòu)解析至今，已有140余種蛋白質(zhì)通過(guò)該方法獲得了結(jié)構(gòu)，尤 其是最近5年隨著計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)和顯微鏡設(shè)備的不斷開(kāi)展，使得三維電鏡重構(gòu) 技術(shù)成為繼X-射線(xiàn)晶體學(xué)和核磁共振波譜學(xué)技術(shù)后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的另一種重要 方法。三維重構(gòu)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：（1）可以直接獲得分子的形貌信息，即使在

17、較低分 辨率下，電子顯微學(xué)也可給出有意義的結(jié)構(gòu)信息；（2）適于解析那些不適合應(yīng)用 X-射線(xiàn)晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)進(jìn)展分析的樣品，如難以結(jié)晶的膜蛋白、大分子復(fù)合體等； 適于捕捉動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變信息；（4）易同其他技術(shù)相結(jié)合得到分子復(fù)合體的高分辨率的 結(jié)構(gòu)信息；（5）電鏡圖像中包含相位信息，所以在相位確定上要比X-射線(xiàn)晶體學(xué)直接和方便4。3 .蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)3 . 1蛋白質(zhì)幾何的表示方法限制蛋白骨架構(gòu)象中可采取的自由度是在模擬過(guò)程中簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的一種方法，其中一種限制是Ca只允許位于二維或三維格子（網(wǎng)格）的位置上。這種簡(jiǎn)化方法大大減 少了一個(gè)蛋白質(zhì)可以采取的構(gòu)象數(shù)目。 于是，對(duì)于一個(gè)中等大小的多肽鏈，我們可

18、以對(duì)它的構(gòu)象空間進(jìn)展窮舉搜索，直到找到能量全局最小的構(gòu)象。而對(duì)于比擬長(zhǎng)的多肽鏈，簡(jiǎn)化的格點(diǎn)模型可以使非窮盡的搜索方法對(duì)所有可能的構(gòu)象進(jìn)展較大比例的取樣，因此可以比擬準(zhǔn)確地估計(jì)出能量全局最小的構(gòu)象雖然使用格點(diǎn)模型，本身所能達(dá)到的準(zhǔn)確度比擬低，但是其計(jì)算上的優(yōu)點(diǎn)使其在低精度預(yù)測(cè)上依然有很大的開(kāi)展。4 . 2勢(shì)能函數(shù)與勢(shì)能搜索方法勢(shì)能函數(shù)的構(gòu)建從本質(zhì)上來(lái)講可以分兩類(lèi)：分子力學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。分子力 學(xué)方法假設(shè)正確的蛋白質(zhì)折疊對(duì)應(yīng)于最低能量的構(gòu)象。 分子力學(xué)勢(shì)能是原子坐標(biāo)的函 數(shù)，其極小值對(duì)應(yīng)于原子體系的局部能量最小點(diǎn)。 分子力學(xué)中的勢(shì)能參數(shù)有各種來(lái)源， 包括從頭計(jì)算和半經(jīng)驗(yàn)量子化學(xué)計(jì)算結(jié)果、氨基酸

19、和小分子的實(shí)驗(yàn)觀(guān)察結(jié)果等。分子 力學(xué)應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)，即力場(chǎng)方法模擬分子的結(jié)構(gòu)，計(jì)算分子的性質(zhì)。盡管計(jì)算量很 大，基于分子力學(xué)的勢(shì)能函數(shù)在計(jì)算高分辨率結(jié)構(gòu)方面依然有很大的應(yīng)用。另外一種 方法就是根據(jù)一些結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)構(gòu)象為一個(gè)未知結(jié)構(gòu)的蛋白設(shè)計(jì)一個(gè)經(jīng)驗(yàn)性的偽能 量函數(shù)。通常，為得到這種經(jīng)驗(yàn)性的能量函數(shù)表達(dá)式， 我們首先要選擇一系列結(jié)構(gòu)的 蛋白質(zhì)，然后對(duì)于每一個(gè)氨基酸，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析在三維空間上與其相鄰的氨基 酸?？梢愿鶕?jù)不同氨基酸的相對(duì)位置得到一個(gè)得分矩陣。依據(jù)這種方法在計(jì)算上非常高效，同樣也可以被用于全原子模型。對(duì)于勢(shì)能的搜索有多種方法。常用的方法是梯度下降法，其中最陡下降法是一種 最根本的

20、優(yōu)化算法。用這種方法可以迅速向極小點(diǎn)靠近， 但接近極小點(diǎn)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生振 蕩，收斂速度慢。共腕梯度法也是一種基于梯度的方法，其收斂的速度快，但是更容 易陷入能量局部極小點(diǎn)。牛頓-拉普森方法是另一類(lèi)能量?jī)?yōu)化方法。梯度方法在計(jì)算 時(shí)使用的是一階微分，而牛頓-拉普森方法除使用一階微分外還計(jì)算二階微分。應(yīng)用 該方法能夠迅速收斂，但是計(jì)算量非常大。蒙特卡羅算法是一種隨機(jī)采樣的方法， 通 過(guò)該方法可以期望找到非常接近于全局能量最優(yōu)的構(gòu)象。5 .蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類(lèi)人類(lèi)關(guān)于進(jìn)化的知識(shí)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相似性比擬方法的研究使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類(lèi)成為可能，而且近年來(lái)取得的研究進(jìn)展明確大局部蛋白質(zhì)可以成功地分入到適當(dāng)數(shù)目的家

21、族中。目前國(guó)際上流行的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)根本上采取兩種不同的思路。一種是數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存所有結(jié)構(gòu)兩兩比擬的結(jié)果。 第二種思路是致力于構(gòu)建非常正式的分類(lèi) 體系。由于所有分類(lèi)方法反映了各研究小組在探究這個(gè)重要領(lǐng)域的不同角度，所以這些方法是同等有效的。目前，被廣泛應(yīng)用的四種分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)是：手工構(gòu)造的層次分類(lèi)數(shù) 據(jù)庫(kù)SCOP5,全自動(dòng)分類(lèi)的MMDB和FSSP6,和半手工半自動(dòng)的CATH70蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)自動(dòng)分類(lèi)問(wèn)題可以被納入機(jī)器學(xué)習(xí)的疇， 通過(guò)提取分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 關(guān)鍵特征，構(gòu)造算法來(lái)學(xué)習(xí)蘊(yùn)含于大量結(jié)構(gòu)和分類(lèi)的數(shù)據(jù)中的專(zhuān)家經(jīng)驗(yàn)知識(shí)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)未知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分類(lèi)預(yù)測(cè)。目前，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同層次分類(lèi)，結(jié)果比擬好的

22、 機(jī)器學(xué)習(xí)方法是：神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)多層感知器、支持向量機(jī)和隱馬爾可夫模型。 支持向量機(jī) 應(yīng)用于分類(lèi)問(wèn)題最終歸結(jié)于求解一個(gè)最優(yōu)化問(wèn)題。上世紀(jì)90年代中期，隱馬爾可夫模型與其他機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)結(jié)合，高效地用于多重比對(duì)、數(shù)據(jù)挖掘和分類(lèi)、結(jié)構(gòu)分析和 模式發(fā)現(xiàn)。多層感知器即誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，它是在各種人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中， 在機(jī)器學(xué)習(xí)中應(yīng)用最多且最成功的采用 BP學(xué)習(xí)算法的分類(lèi)器8。4.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)確實(shí)定蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)確定的主要手段是：X-射線(xiàn)晶體衍分析和核磁共振。蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中80%的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是由X-射線(xiàn)衍射分析得到的，約15%的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是 由核磁共振這種新的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法得到。 X-射線(xiàn)衍射法的

23、分辨率可達(dá)到原子的水平， 使它可以測(cè)定亞基的空間結(jié)構(gòu)、 各亞基間的相對(duì)拓?fù)洳季?，還可清楚的描述配體存在 與否對(duì)蛋白質(zhì)的影響。多維核磁共振波譜技術(shù)已成為確定蛋白質(zhì)和核酸等生物分子溶 液三維結(jié)構(gòu)的唯一有效手段9。核磁共振波譜學(xué)技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是在于它能對(duì)溶液中 和非晶態(tài)的蛋白質(zhì)進(jìn)展測(cè)量。在晶體結(jié)構(gòu)分析中給定大量結(jié)構(gòu)因子，確定電子密度分布函數(shù)的位相的問(wèn)題其實(shí) 就是從圖像分析得到結(jié)構(gòu)坐標(biāo)數(shù)據(jù)過(guò)程中出現(xiàn)的數(shù)學(xué)問(wèn)題。當(dāng)給定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中局部原子的距離時(shí)，求解原子坐標(biāo)的方法是將距離空間的約束矩陣轉(zhuǎn)化為坐標(biāo)空間的矩 陣，由坐標(biāo)空間矩陣構(gòu)建蛋白質(zhì)分子的初始矩陣，運(yùn)用模擬退火等算法對(duì)初始結(jié)構(gòu)進(jìn)展優(yōu)化，經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)展

24、能量最小化，由此得到一組收斂的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)。 關(guān)于蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析，到目前為止，最經(jīng)典的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析方法 是，Sange等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白質(zhì)序列儀，與后來(lái)開(kāi)展的固相和 氣相的蛋白質(zhì)序列分析儀。人們通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和源后衰減基質(zhì)輔助的激光解析離子化，就可以從質(zhì)譜分析中獲得肽與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。6 .蛋白質(zhì)相互作用機(jī)體細(xì)胞每個(gè)蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立發(fā)揮作用，通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成較大 復(fù)合體,在特定的時(shí)間和空間行使特定的功能，構(gòu)成各項(xiàng)生命活動(dòng)的根底，因此解決蛋 白質(zhì)相互作用問(wèn)題具有舉足輕重的意義。目前，用于研究蛋白質(zhì)間相互作用的方法非 常多，包括酵母雙

25、雜交技術(shù)、用聯(lián)親和純化技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、蛋白質(zhì)芯 片技術(shù)、噬菌體外表展示技術(shù)、外表胞質(zhì)團(tuán)共振技術(shù)、免疫共沉淀等等。酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)是由Field和Songft 1989年研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控時(shí)首次發(fā)明,是 一種在酵母中利用轉(zhuǎn)錄激活物的重組來(lái)鑒定蛋白質(zhì)之間相互作用的方法，在蛋白質(zhì)相互作用方面扮演著重要角色。真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子具有兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，分別與誘餌蛋白與可能與誘餌蛋白相互作用的獵物蛋白相 連,并共同轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。如果兩個(gè)蛋白能夠發(fā)生相互作用就能使轉(zhuǎn)錄因子原來(lái)分開(kāi) 的兩局部結(jié)合，從而激活下游報(bào)告基因。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物就可判斷兩

26、種 蛋白是否發(fā)生相互作用10。雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白分子間兩兩相互作用的傳統(tǒng)技術(shù)，其假陽(yáng)性率和假陰性率比擬高，所以必須與其他技術(shù)聯(lián)用加以鑒定。串聯(lián)親和純化技術(shù)用聯(lián)親和純化是近些年來(lái)開(kāi)展起來(lái)的新技術(shù)，與酵母雙雜交系統(tǒng)不同，此方法可在生理?xiàng)l件下研究多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的相互作用， 兼具融合蛋白親和色譜法和免疫共 沉淀兩種生化方法的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)兩步特異性的親和純化可獲得與目的蛋白結(jié)合的高純 度蛋白質(zhì)復(fù)合物。該方法首先對(duì)目的蛋白進(jìn)展 TAP標(biāo)簽標(biāo)記，標(biāo)簽包括3個(gè)局部：蛋 白A、鈣調(diào)素結(jié)合多肽和中間連接的TEV酶識(shí)別的酶切位點(diǎn)。在蛋白復(fù)合物的別離純 化中，第一步利用與蛋白標(biāo)簽具有親和作用的色譜柱，采用TEV蛋白

27、酶斷裂TEV蛋白酶切位點(diǎn)的方式洗脫；第二步利用與鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽具有親和作用的鈣調(diào)蛋白色譜 柱，將蛋白復(fù)合物和TEV蛋白酶分開(kāi)，純化出的蛋白復(fù)合物用凝膠電泳、質(zhì)譜技術(shù)或 Edmarf竄解法進(jìn)展鑒定11。TAP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是利用酶切的方法進(jìn)展洗脫，條件溫和， 不破壞復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，并且經(jīng)兩步洗脫，去除了雜蛋白的干擾，提高了蛋白質(zhì)相互作 用結(jié)果的可靠性、特異性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了酵母雙雜交傳統(tǒng)技術(shù)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的根本原理是處于激活狀態(tài)的供體能在足夠近的距離（小于10nm）將本身的熒光傳遞到受體上。因此，用熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)熒光體 的能量傳遞來(lái)檢測(cè)兩蛋白質(zhì)的相互作用。此技術(shù)的優(yōu)

28、點(diǎn)是可以在生理?xiàng)l件下無(wú)損傷、 動(dòng)態(tài)地研究蛋白質(zhì)的相互作用，同時(shí)還能檢測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞的定位。 但是，該方法受 熒光發(fā)色基團(tuán)空間距離的限制，只能用于研究分子量小于 200 kD的蛋白12o目前隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的開(kāi)展，很多研究者運(yùn)用計(jì)算分析和構(gòu)建相互作用模型的方 法來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，從而發(fā)現(xiàn)更多未發(fā)現(xiàn)有相互作用的蛋白， 但這些發(fā)現(xiàn)的蛋 白需要利用以上提到的方法進(jìn)展鑒定?？傊糜谘芯康鞍踪|(zhì)相互作用的方法很多， 所有方法都各有千秋，但至今尚無(wú)十分理想的方法可以大規(guī)模獲得蛋白質(zhì)相互作用的 數(shù)據(jù)，故相互作用圖譜有賴(lài)于各種研究方法的綜合分析。7 .蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的研究長(zhǎng)期以來(lái)關(guān)于蛋白質(zhì)折疊，形成了自組裝的

29、主導(dǎo)學(xué)說(shuō)，因此，在研究新生肽段的 折疊時(shí)，就很自然的把在體外蛋白質(zhì)折疊研究中得到的規(guī)律推廣到體，用變性蛋白的復(fù)性作為新生肽段折疊的模型，并認(rèn)為細(xì)胞中新合成的多肽鏈，不需要?jiǎng)e的分子的幫 助，不需要額外能量的補(bǔ)充，就應(yīng)該能夠自發(fā)的折疊而形成它的功能狀態(tài)。九十年代一類(lèi)具有新的生物功能的蛋白，分子伴侶的發(fā)現(xiàn)，以與在更廣泛意義上說(shuō)的幫助蛋白 質(zhì)折疊的輔助蛋白的提出，說(shuō)明細(xì)胞新生肽段的折疊一般意義上說(shuō)是需要幫助的，而不是自發(fā)進(jìn)展的。分子生物學(xué)的中心法如此與 蛋白質(zhì)折疊的研究概況根據(jù)分子生物學(xué)中心法如此，生物遺傳信息的傳遞是由DNA到RNA、RNA到蛋白質(zhì)多肽鏈、再由多肽鏈形成具有生物活性的蛋白質(zhì)進(jìn)展的。目

30、前對(duì)前兩者的過(guò)程已有相當(dāng)深入和清晰的了解，但對(duì)后者尚不十分清楚。因此可以說(shuō)蛋白質(zhì)折疊是生物 學(xué)中心法如此中至今尚未解決的一個(gè)重大生物學(xué)問(wèn)題。通過(guò)蛋白質(zhì)折疊的研究發(fā)現(xiàn)一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)之間存在某種確定的關(guān)系，那么是否像核甘酸通過(guò)“三聯(lián)密碼決定氨基酸順序那樣有一套密碼呢？有人把這設(shè)想的 一級(jí)結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)的密碼叫作“第二遺傳密碼?，F(xiàn)已經(jīng)觀(guān)察出mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元數(shù)與其編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)a-螺旋與B-折疊單元數(shù)之間存在明顯 的相關(guān)性，二者的總符合率為97.3%,相關(guān)系數(shù)達(dá)；其次，mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中5/端 至3,端的每一發(fā)夾或復(fù)合發(fā)火與 PDB數(shù)據(jù)庫(kù)所提供的蛋白質(zhì)N端至C端的每一個(gè) a螺旋或B折

31、疊之間存在幾乎是一一對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象。 通過(guò)上述數(shù)據(jù)可以看出，mRNA 的三維結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中確實(shí)存在某種相關(guān) 13o我們知道，多數(shù)蛋白質(zhì)在體外是不穩(wěn)定的，外界環(huán)境的變化，如溫度、酸度等， 都可以導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)的破壞和生物活性的喪失，但卻并不破壞它的一級(jí)結(jié)構(gòu)，這稱(chēng)為蛋白質(zhì)的變性。變性的蛋白質(zhì)往往成為一條伸展的肽鏈，由于一級(jí)結(jié)構(gòu)仍然完整，根據(jù)Anfinsen 14原理它應(yīng)該可以在一定的條件下重新折疊成原有的空間結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原 有的活性。這就是長(zhǎng)時(shí)間來(lái)在體外研究蛋白質(zhì)折疊的根本模型。目前的實(shí)驗(yàn)和理論研究多以小分子量、單鏈蛋白質(zhì)為模擬體系，這類(lèi)蛋白質(zhì)通常采用稀釋法折疊、復(fù)性， 其中研究最多的模型蛋白是

32、溶菌酶1507.2 蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)折疊根本的科學(xué)問(wèn)題是具有完整一級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈又是如何折疊成為它 特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)？這是一個(gè)折疊的動(dòng)力學(xué)的問(wèn)題，長(zhǎng)期以來(lái)，主要用體外的實(shí)驗(yàn)方法研究，雖然已有四五十年，但至今尚未解決。由An巾nsen14等根據(jù)對(duì)RNase復(fù)性研究的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)提出的“熱力學(xué)假說(shuō)認(rèn)為 一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)。他們認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件 下熱力學(xué)上最穩(wěn)定的結(jié)果，采取天然構(gòu)象的多肽鏈和它所處的一定溶液組分、PH、溫度、離子強(qiáng)度等環(huán)境條件下整個(gè)系統(tǒng)的總自由能最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈 在一定的環(huán)境條件下能自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。“熱力學(xué)假說(shuō)提出后，得到

33、了許多實(shí)驗(yàn)證據(jù)的證明，因此得到廣泛支持。Bakei, D.等認(rèn)為，對(duì)某些蛋白質(zhì)而言，天然構(gòu)象也許并非是多肽鏈自由能最低狀態(tài)或唯一的低能量狀態(tài)，多肽鏈采取的某些非天然構(gòu)象也很穩(wěn)定。假如某一多肽鏈具有兩種低能量狀態(tài)： 一種是天然構(gòu)象，一種是非大 然構(gòu)象，而且處于這兩種低能量狀態(tài)的多肽鏈相互轉(zhuǎn)變由于要克制較高的能壘而難以 實(shí)現(xiàn)。那么在蛋白質(zhì)折疊過(guò)程中就會(huì)有兩種途徑相互競(jìng)爭(zhēng)。一種是正確折疊形成天然 構(gòu)象的途徑，另一種是錯(cuò)誤折疊成穩(wěn)定的非天然構(gòu)象的途徑。蛋白質(zhì)多肽鏈之所以能正確折疊是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動(dòng)力學(xué)過(guò)程中起著控制作用，促進(jìn)多肽鏈走入正確折疊途徑。蛋白質(zhì)的折疊是遵循“熱力學(xué)假說(shuō)的，從高能態(tài)

34、向低能態(tài)轉(zhuǎn)變， 但在這個(gè)過(guò)程中會(huì)受到動(dòng)力學(xué)上的控制，熱力學(xué)控制與動(dòng)力學(xué)控制在蛋白質(zhì)多肽鏈的折疊反響中是統(tǒng)一的，不同的蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)的二者所起作用大小可 能有所不同1607.3 蛋白質(zhì)折疊與分子伴侶蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)，除了共價(jià)的肽鍵和二硫鍵，還靠大量極其復(fù)雜的弱次級(jí) 鍵共同作用。因此新生肽段在一邊合成一邊折疊過(guò)程中有可能暫時(shí)形成在最終成熟蛋 白中不存在不該有的結(jié)構(gòu)，他們常常是一些疏水外表，它們之間很可能發(fā)生本不應(yīng)該 有的錯(cuò)誤的相互作用而形成的非功能的分子， 甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自組 裝學(xué)說(shuō)，每一步折疊都是正確的，充分的，必要的。實(shí)際上折疊過(guò)程是一個(gè)正確途徑 和錯(cuò)誤途徑相

35、互競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程，為了提高蛋白質(zhì)生物合成的效率的，應(yīng)該有幫助正確途 徑的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，分子伴侶就是這樣通過(guò)進(jìn)化應(yīng)運(yùn)而生的。它們的功能是識(shí)別新生肽段 折疊過(guò)程中暫時(shí)暴露的錯(cuò)誤結(jié)構(gòu)的， 與之結(jié)合，生成復(fù)和物，從而防止這些外表之間 過(guò)早的相互作用，阻止不正確的非功能的折疊途徑， 抑制不可逆聚合物產(chǎn)生，這樣必 然促進(jìn)折疊向正確方向進(jìn)展。分子伴侶的研究有利于蛋白質(zhì)折疊機(jī)理的探索。 其研究成果必然會(huì)大大加深我們 對(duì)生命現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也一定會(huì)增加我們與自然斗爭(zhēng)的能力和自身生存的能力。由于分子伴侶在生命活動(dòng)的各個(gè)層次都具有重要作用， 它的突變和損傷也必定會(huì)引起疾 病，因此可以期望運(yùn)用分子伴侶的知識(shí)來(lái)治療所謂的“分子

36、伴侶病。另一方面，利 用對(duì)分子伴侶的研究成果從根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必將對(duì)大幅度提高人類(lèi)生活水平起重要作用。前景展望根據(jù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)大概有 2000種不同的折疊類(lèi)型，3000-5000蛋白質(zhì)超家 族，當(dāng)前僅發(fā)現(xiàn)1000余種不同的折疊類(lèi)型和1600種蛋白質(zhì)超家族。人類(lèi)基因組測(cè)序 研究揭示，人體大約有3萬(wàn)個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因，這就是說(shuō)，人類(lèi)生命過(guò)程約需要3萬(wàn)種不同的根底蛋白質(zhì)，它們?cè)谏顒?dòng)中發(fā)揮著重要功能，而這些功能的發(fā)揮如此 依賴(lài)于這些蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此，獲得這些蛋白質(zhì)并說(shuō)明它們的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)與 與其生物功能的關(guān)系，成為揭示生物體活動(dòng)本質(zhì)的關(guān)鍵一步。近年來(lái)基因組工程的迅

37、猛開(kāi)展與生物信息學(xué)的新進(jìn)展，給結(jié)構(gòu)生物學(xué)開(kāi)創(chuàng)了道路，使此目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)成為可能。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的執(zhí)行，找到人類(lèi) 5萬(wàn)到10萬(wàn)個(gè)基因的堿基序列是指日可待的事，因而確定人的上千萬(wàn)個(gè)原癌基因和幾萬(wàn)個(gè)與疾病有關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸 順序也會(huì)逐漸實(shí)現(xiàn)。然而要了解它們的功能還必須知道它們的三維結(jié)構(gòu)，且藥物設(shè)計(jì)、 基因芯片均需要知道三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)前，雖然眾多技術(shù)為蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定提供了有 效的實(shí)驗(yàn)手段，但蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的增長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蛋白質(zhì)序列的增長(zhǎng)速度，并且這些方法仍然存在局限性。于是要求現(xiàn)代生物信息學(xué)工作者運(yùn)用數(shù)學(xué)物理思想、方法 和計(jì)算手段進(jìn)一步研究分子生物機(jī)理， 使人類(lèi)更準(zhǔn)確地掌握蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識(shí)，

38、從而促 進(jìn)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的開(kāi)展。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究是蛋白質(zhì)研究中的核心容之一， 雖然它還處于一個(gè)初級(jí)開(kāi)展 階段，其研究方法和系統(tǒng)還不夠完善，但隨著其不斷深入開(kāi)展，相信在揭示諸如生長(zhǎng)、 發(fā)育和代調(diào)控等生命活動(dòng)規(guī)律上將會(huì)有所突破。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究將為從細(xì)胞和分子水 平上探討人類(lèi)重大疾病的機(jī)制、診斷、防治和新藥開(kāi)發(fā)提供重要的理論根底從而使蛋 白質(zhì)科學(xué)研究達(dá)到一個(gè)新的高度。參考文獻(xiàn)1光地，陸長(zhǎng)德，金哲元.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究方法進(jìn)展Z.江南大學(xué)圖書(shū)館情報(bào)部，2006,3 (2): 4547.2閻隆飛，之榮.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)M.清華大學(xué)，1997, 258： 131154.3余亦華.蛋白質(zhì)三維空

39、間結(jié)構(gòu)研究的里程碑J.科學(xué)，2003, 55(2): 5758.4王大能，勇，隋森芳.電子顯微學(xué)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的新進(jìn)展J.電子顯微學(xué)報(bào)，2003,22(5): 449456.5T. J. Hubbard, B. Ailey, S. E. Brenner, A. G. Murzin and C.Chothia. SCOP: A structural classification of proteins databaseJ. Nucleic Acids Research, 1999, 27(1) : 254256.6L. Holm and C. Sander. Protein structure