實(shí)驗(yàn)13經(jīng)典免疫技術(shù)

1、實(shí)驗(yàn)十三實(shí)驗(yàn)十三 經(jīng)典免疫技術(shù)經(jīng)典免疫技術(shù) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊髮?shí)驗(yàn)?zāi)康囊?1、掌握直接凝集反應(yīng)的原理和操作方法、掌握直接凝集反應(yīng)的原理和操作方法 2、熟悉免疫標(biāo)記技術(shù)的原理和操作方法、熟悉免疫標(biāo)記技術(shù)的原理和操作方法 一、凝集反應(yīng)一、凝集反應(yīng) （一）實(shí)驗(yàn)原理（一）實(shí)驗(yàn)原理 為一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原（完整的病原為一種血清學(xué)反應(yīng)。顆粒性抗原（完整的病原微生物或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電微生物或紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有電介質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼介質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時(shí)間，出現(xiàn)肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝可見的凝集小塊。參與凝集反應(yīng)的抗原稱為凝集原，抗體

2、稱為凝集素?？煞譃橹苯幽磻?yīng)集原，抗體稱為凝集素?？煞譃橹苯幽磻?yīng)和間接凝集反應(yīng)兩類。和間接凝集反應(yīng)兩類。 1、直接凝集反應(yīng)（原理）、直接凝集反應(yīng)（原理） 顆粒狀抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體直接結(jié)合顆粒狀抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體直接結(jié)合所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。分為玻片法和試管法。所出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。分為玻片法和試管法。 （1 1）玻片法玻片法是一種定性試驗(yàn)方法?？捎靡阎贵w來檢測(cè)是一種定性試驗(yàn)方法。可用已知抗體來檢測(cè)未知抗原。若鑒定新分離的菌種時(shí)，可取已知抗體滴加未知抗原。若鑒定新分離的菌種時(shí)，可取已知抗體滴加在玻片上，將待檢菌液一滴與其混勻。數(shù)分種后，如出在玻片上，將待檢菌液一滴

3、與其混勻。數(shù)分種后，如出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，為陽性反應(yīng)。該法簡(jiǎn)便快速，現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，為陽性反應(yīng)。該法簡(jiǎn)便快速，除鑒定菌種外，尚可用于菌種分型、測(cè)定人類紅細(xì)胞的除鑒定菌種外，尚可用于菌種分型、測(cè)定人類紅細(xì)胞的ABOABO血型等。血型等。 （2 2）試管法試管法是一種定量試驗(yàn)的經(jīng)典方法?？捎靡阎乖且环N定量試驗(yàn)的經(jīng)典方法。可用已知抗原來檢測(cè)受檢血清中有無某抗體及抗體的含量。用來協(xié)助來檢測(cè)受檢血清中有無某抗體及抗體的含量。用來協(xié)助臨床診斷或供流行病學(xué)調(diào)查研究。操作時(shí)，將待檢血清臨床診斷或供流行病學(xué)調(diào)查研究。操作時(shí)，將待檢血清用生理鹽水連續(xù)成倍稀釋，然后加入等量抗原，最高稀用生理鹽水連續(xù)成

4、倍稀釋，然后加入等量抗原，最高稀釋度仍有凝集現(xiàn)象者，為血清的效價(jià)，也稱滴度，以表釋度仍有凝集現(xiàn)象者，為血清的效價(jià)，也稱滴度，以表示血清中抗體的相對(duì)含量。診斷傷寒、副傷寒病的肥達(dá)示血清中抗體的相對(duì)含量。診斷傷寒、副傷寒病的肥達(dá)反應(yīng)、布氏病的瑞特氏反應(yīng)均屬定量凝集反應(yīng)。反應(yīng)、布氏病的瑞特氏反應(yīng)均屬定量凝集反應(yīng)。 2、間接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關(guān)的、一定大小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。在小的顆粒狀載體的表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用。在有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱

5、為間接凝集反有電介質(zhì)存在的適宜條件下，即可發(fā)生凝集，稱為間接凝集反應(yīng)。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（應(yīng)。用做載體的微球可用天然的微粒性物質(zhì)，如人（ O O型）和型）和動(dòng)物（綿羊、家兔等）的紅細(xì)胞、活性炭顆?；蚬杷徜X顆粒等；動(dòng)物（綿羊、家兔等）的紅細(xì)胞、活性炭顆?；蚬杷徜X顆粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，當(dāng)顆粒上的抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，敏感性抗原與微量抗體結(jié)合后，就足以出現(xiàn)肉眼可見

6、的反應(yīng)，敏感性比直接凝集反應(yīng)高得多。比直接凝集反應(yīng)高得多。 + ? 標(biāo)準(zhǔn)抗標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗、抗B診斷血清；受測(cè)者紅細(xì)胞、診斷血清；受測(cè)者紅細(xì)胞、鹽水、采血針、棉球、玻片等。鹽水、采血針、棉球、玻片等。 待測(cè)細(xì)菌純培養(yǎng)物，標(biāo)準(zhǔn)診斷血清待測(cè)細(xì)菌純培養(yǎng)物，標(biāo)準(zhǔn)診斷血清 （二）材（二）材 料料 （三）方（三）方 法（血型測(cè)定）法（血型測(cè)定） 1 1取一塊清潔玻片，用記號(hào)筆劃上取一塊清潔玻片，用記號(hào)筆劃上 記號(hào)記號(hào)，左上角寫，左上角寫A A字，右上角寫字，右上角寫B(tài) B字。字。 2 2用小滴管吸用小滴管吸A A型標(biāo)準(zhǔn)血清（抗型標(biāo)準(zhǔn)血清（抗B B）一滴加入左側(cè)，用）一滴加入左側(cè)，用另一小滴管吸另一小滴管吸B

7、B型標(biāo)準(zhǔn)血清（抗型標(biāo)準(zhǔn)血清（抗A A）一滴加入右側(cè)。）一滴加入右側(cè)。 3 3穿刺手指取血穿刺手指取血，玻片的每側(cè)各放入一小滴血，用牙，玻片的每側(cè)各放入一小滴血，用牙簽攪拌，使每側(cè)抗血清和血液混和。每邊用一支牙簽，簽攪拌，使每側(cè)抗血清和血液混和。每邊用一支牙簽，切勿混用。切勿混用。 4 4靜置室溫下數(shù)分鐘后，在靜置室溫下數(shù)分鐘后，在 白色背景下肉眼觀察白色背景下肉眼觀察 ，也，也可顯微鏡觀察?？娠@微鏡觀察。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 1 1、采血時(shí)要盡量、采血時(shí)要盡量避免用力擠壓避免用力擠壓手指或耳垂，以免發(fā)生手指或耳垂，以免發(fā)生溶血影響結(jié)果。溶血影響結(jié)果。 2 2、如肉眼觀察難以辨認(rèn)，可使用顯微鏡

8、觀察凝血現(xiàn)象。、如肉眼觀察難以辨認(rèn)，可使用顯微鏡觀察凝血現(xiàn)象。操作流程 （三）方（三）方 法（法（細(xì)菌菌型測(cè)定） 1.1.取一塊清潔取一塊清潔載玻片載玻片，用記號(hào)筆劃上，用記號(hào)筆劃上記號(hào)記號(hào)，在一側(cè)滴加，在一側(cè)滴加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的診斷血清準(zhǔn)的診斷血清一滴一滴, ,另一側(cè)滴加另一側(cè)滴加一滴生理鹽水一滴生理鹽水。 2.2.用接種環(huán)無菌操作取適量的待測(cè)細(xì)菌用接種環(huán)無菌操作取適量的待測(cè)細(xì)菌 , ,分別與標(biāo)準(zhǔn)診斷分別與標(biāo)準(zhǔn)診斷血清和生理鹽水混均。血清和生理鹽水混均。 3.3.靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯靜置室溫下數(shù)分鐘后，在白色背景下肉眼觀察，也可顯微鏡觀察。微鏡觀察。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：

9、 （1 1）生理鹽水、診斷血清要適量；）生理鹽水、診斷血清要適量； （2 2）待檢菌為腸道致病菌，注意無菌操作，玻片用后放）待檢菌為腸道致病菌，注意無菌操作，玻片用后放入消毒缸內(nèi)；入消毒缸內(nèi)； （3 3）用接種環(huán)取待檢菌時(shí)，不要挑取瓊脂；待檢菌與生）用接種環(huán)取待檢菌時(shí)，不要挑取瓊脂；待檢菌與生理鹽水、診斷血清混勻時(shí)，不要涂得太寬，否則影響結(jié)理鹽水、診斷血清混勻時(shí)，不要涂得太寬，否則影響結(jié)果觀察。果觀察。 （四）結(jié)果判斷 結(jié)果分析結(jié)果分析 人類人類ABOABO血型抗原是根據(jù)紅血型抗原是根據(jù)紅細(xì)胞膜上有無特異性抗原細(xì)胞膜上有無特異性抗原（凝集原）（凝集原）A A或或B B來劃分的來劃分的血液類型系

10、統(tǒng)，將血型分血液類型系統(tǒng)，將血型分為為A A型、型、B B型、型、ABAB型、型、OO型四種。型四種。 RBC膜膜 抗原抗原 血型血型 A A B B 抗抗A A和和B AB 無無 無無 O 抗抗A、抗、抗B) (血漿抗體血漿抗體 抗抗B 二 、沉淀反應(yīng)（雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)） （一）實(shí)驗(yàn)原理（一）實(shí)驗(yàn)原理 又稱雙向瓊脂擴(kuò)散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)又稱雙向瓊脂擴(kuò)散，是利用瓊脂凝膠作介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。的一種沉淀反應(yīng)。 瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)瓊脂是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可使大分子物質(zhì)通過，分子的擴(kuò)散作用使分別兩處的抗原抗體通過，分子的擴(kuò)散作用使分別兩處的抗原抗體相遇，比例合適時(shí)形成沉淀，可觀察

11、到沉淀線。相遇，比例合適時(shí)形成沉淀，可觀察到沉淀線。 沉淀線的特征與位置取決于抗原分子的大沉淀線的特征與位置取決于抗原分子的大小、結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體小、結(jié)構(gòu)、擴(kuò)散系數(shù)和濃度等。當(dāng)抗原、抗體存在多種體系時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多條沉淀線。存在多種體系時(shí)，會(huì)出現(xiàn)多條沉淀線。 因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點(diǎn)，因而應(yīng)用純度或濃度比較抗原之間的異同點(diǎn)，因而應(yīng)用范圍較廣。范圍較廣。 （二）材料（二）材料 玻片、瓊脂糖、抗原、抗體（玻片、瓊脂糖、抗原、抗體（0；1:2； 1:4； 1:8； 1:16）、微量加樣器、滴管、濕盒、）

12、、微量加樣器、滴管、濕盒、水浴箱等。水浴箱等。 （三） 操作步驟 1.1.制板制板：將溶化的：將溶化的1.5%1.5%瓊脂瓊脂3.5-4ml3.5-4ml倒在載玻片上，倒在載玻片上，使之能將表面覆蓋，制成厚度約使之能將表面覆蓋，制成厚度約2 23mm3mm厚厚的瓊脂的瓊脂糖凝膠板。糖凝膠板。 2.2.打孔打孔: :待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔, ,孔徑為孔徑為4mm4mm?？组g距離為孔間距離為4mm-5mm;4mm-5mm;瓊脂玻板的制備十字型打孔瓊脂玻板的制備十字型打孔圖。圖。 3.3.加樣加樣: :用微量加樣器取用微量加樣器取Ag10uLAg10uL加入中央孔加入中央孔

13、; ;將抗將抗體進(jìn)行倍比稀釋體進(jìn)行倍比稀釋, ,稀釋度分別為原液稀釋度分別為原液,1:2;1:4;,1:2;1:4;每每個(gè)稀釋度取個(gè)稀釋度取10uL10uL加入外圍抗體孔中。加入外圍抗體孔中。 4.4.擴(kuò)散擴(kuò)散: : 置濕盒置濕盒3737, 24, 24小時(shí)觀察結(jié)果小時(shí)觀察結(jié)果 每孔加入每孔加入 抗原抗原/ /抗體抗體10l10l 0 1/16 Ab Ab 1/8 1/1 Ab Ag 1/4 Ab Ab 1/2 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) （1）打孔時(shí)，不要將瓊脂劃破； （2）加樣時(shí)，不要溢出孔外； （3）加樣用的吸管不要混用。 （四）（四） 結(jié)果記錄結(jié)果記錄 三、膠體金標(biāo)記技術(shù)三、膠體金標(biāo)記技術(shù) 用膠

14、體金顆粒標(biāo)記已知抗體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中未用膠體金顆粒標(biāo)記已知抗體或抗原，檢測(cè)標(biāo)本中未知抗原或抗體的技術(shù)。知抗原或抗體的技術(shù)。 （一）原理（一）原理 ?以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用使標(biāo)本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標(biāo)記物的顯色（膠體金標(biāo)記物的顯色（ 20nm20nm的膠體金顆粒呈磚紅的膠體金顆粒呈磚紅色）達(dá)到檢測(cè)目的。色）達(dá)到檢測(cè)目的。 ?根據(jù)檢測(cè)裝置的不同，可分為膠體金斑點(diǎn)滲濾試根據(jù)檢測(cè)裝置的不同，可

15、分為膠體金斑點(diǎn)滲濾試驗(yàn)和膠體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)。驗(yàn)和膠體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)。 膠體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)?zāi)z體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn) ?將各種反應(yīng)試劑將各種反應(yīng)試劑( (抗體抗體) )附著在硝酸纖維素膜條上，檢測(cè)時(shí)附著在硝酸纖維素膜條上，檢測(cè)時(shí)將待檢標(biāo)本加在膜條的一端，使膜條上的膠體金標(biāo)記抗體將待檢標(biāo)本加在膜條的一端，使膜條上的膠體金標(biāo)記抗體溶解后，與標(biāo)本中的待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)形成溶解后，與標(biāo)本中的待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)形成 ICIC，并通過毛細(xì)管，并通過毛細(xì)管作用在膜條上滲濾、移行，再與膜上另一種抗體反應(yīng)，再作用在膜條上滲濾、移行，再與膜上另一種抗體反應(yīng)，再后被截留、聚集在膜條的一定區(qū)域，形成有顏色的反應(yīng)條后被截留、

16、聚集在膜條的一定區(qū)域，形成有顏色的反應(yīng)條帶。帶。 ?臨床上常用的有膠體金早孕診斷試劑條臨床上常用的有膠體金早孕診斷試劑條 用鼠抗用鼠抗-HCG-HCG單克隆抗體和兔抗鼠單克隆抗體和兔抗鼠1gG1gG多克隆抗體分多克隆抗體分別固相硝酸纖維膜和膠體金標(biāo)記的抗別固相硝酸纖維膜和膠體金標(biāo)記的抗-HCG-HCG單克隆抗體及單克隆抗體及其他試劑制成，應(yīng)用層析式雙抗體夾心法的原理檢測(cè)尿液其他試劑制成，應(yīng)用層析式雙抗體夾心法的原理檢測(cè)尿液中中HCGHCG，用于妊娠早期輔助診斷。，用于妊娠早期輔助診斷。 （二）材料（二）材料 待檢尿液、早早孕試驗(yàn)條待檢尿液、早早孕試驗(yàn)條 （三）方法（三）方法 將早早孕試驗(yàn)棒的吸

17、水區(qū)浸入待檢尿液中將早早孕試驗(yàn)棒的吸水區(qū)浸入待檢尿液中35秒，勿超過秒，勿超過“max” 線線 取出試驗(yàn)條放置于干燥、不吸水的平面上，取出試驗(yàn)條放置于干燥、不吸水的平面上，置置45秒后觀察結(jié)果秒后觀察結(jié)果 C區(qū)區(qū) 試試紙紙條條T區(qū)區(qū) 抗小鼠抗小鼠IgG抗體抗體(固定固定) 抗抗-HCG抗體抗體(固定固定) 吸水區(qū)吸水區(qū) 膠體金膠體金-抗抗 -HCG抗體抗體(小鼠小鼠IgG,游離游離) 下端浸入尿液下端浸入尿液 HCG C區(qū)區(qū) T區(qū)區(qū) 虹吸作用虹吸作用HCG上行與吸上行與吸水區(qū)的金標(biāo)抗體結(jié)合水區(qū)的金標(biāo)抗體結(jié)合,并并上行至上行至T區(qū)區(qū),HCG又與抗又與抗-HCG抗體結(jié)合抗體結(jié)合-雙抗雙抗體夾心法體夾心法 C區(qū)紅線區(qū)紅線 抗小鼠抗小鼠IgG + 膠體金膠體金-抗抗-HCG T區(qū)紅線區(qū)紅線 抗抗-HCG + HCG + 膠體金膠體金-抗抗-HCG （四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果(3種可能種可能) 陽性陽性 陰性陰性 無效無效 結(jié)論結(jié)論: HCG(+) HCG(-) （五）結(jié)果分析（五）結(jié)果分析 人絨毛膜促性腺激素（人絨毛膜促性