間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的環(huán)境

1、間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的環(huán)境內(nèi)容提要氧氣濃度二氧化碳濃度培養(yǎng)基一.氧氣濃度 為TCA循環(huán)提供電子最終受體 空氣中的氧含量約為20.94%組織或器官名稱組織或器官名稱氧濃度氧濃度肺4%14%血液循環(huán)4%14%肝臟4%14%腎臟4%14%心臟4%14%大腦0.5%8%眼睛1%5%骨髓1%-6%脂肪組織2%8% 人體組織器官中氧濃度MSCs的生活環(huán)境 MSCs的培養(yǎng)環(huán)境VS一.氧氣濃度 HIF-1普遍存在于人和哺乳動物細胞內(nèi)， HIF-1由和兩個亞基組成異二聚體蛋白，亞基是結(jié)構(gòu)性亞基，在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達；亞基是功能性亞基，其表達受細胞內(nèi)氧濃度的高度調(diào)控。 HIF-1在常氧下（21%O2）也有表達，只要O25

2、%，即很快被細胞內(nèi)氧依賴性泛素蛋白酶降解途徑所降解，導(dǎo)致無法結(jié)合HIF-1而發(fā)揮調(diào)控功能 低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)：維持組織、細胞在低氧條件下內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，以適應(yīng)低氧。同時HIF-1及其誘導(dǎo)表達的基因還在生理性缺氧如干細胞微環(huán)境、胚胎發(fā)育過程中組織細胞分化，以及多種病理情況如腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用一.氧氣濃度 低氧條件是細胞生長和代謝的理想環(huán)境，這也促成了三氣培養(yǎng)箱的發(fā)明 三氣培養(yǎng)箱能夠精確控制氧氣、氮氣以及二氧化碳的濃度，從而模擬不同的生理環(huán)境 對于間充質(zhì)干細胞，低氧條件還能夠刺激其分泌更大量的細胞因子，從而發(fā)揮更好的療效。

3、 通常培養(yǎng)基中會加入NaHCO3作為緩沖體系，保持穩(wěn)定的pH范圍；二.二氧化碳濃度 大多數(shù)細胞的適宜pH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。多數(shù)細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境較偏堿性環(huán)境中更利于細胞生長；但有一些細胞也喜歡在偏堿環(huán)境中生長，如成纖維細胞，其最適合pH是7.4-7.6。每種細胞都有其最適pH值。和酸反應(yīng)：和堿反應(yīng)：二.二氧化碳濃度 培養(yǎng)箱中不斷補充CO2并維持在一定的濃度，能夠有效抑制平衡反應(yīng)的正向進行，從而控制培養(yǎng)體系的pHQuestion：為什么培養(yǎng)基酸度會增加？三.培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動物細胞生長和維持用的人工配制的養(yǎng)

4、料 培養(yǎng)基的種類和組份根據(jù)細胞的類型多種多樣，但都會含有氨基酸，維生素，無機鹽、糖分等三.培養(yǎng)基 經(jīng)典培養(yǎng)基：MEM：minimum essential medium，低限基本培養(yǎng)基，主要是貼壁細胞的培養(yǎng)，修改配方后也可用于其他類型細胞培養(yǎng)。DMEM：改良型的MEM，氨基酸含量加倍，維生素含量4倍，添加了丙酮酸和鐵離子。DMEM又分為高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。廣泛用于各種貼壁類細胞的培養(yǎng)。DMEM/F12：DMEM與F12培養(yǎng)基1:1混合而成，使用環(huán)境要求更為苛刻的細胞。RPMI-1640：專為淋巴細胞培養(yǎng)而設(shè)計的，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于懸浮細胞的培養(yǎng)。三.培養(yǎng)

5、基 必需氨基酸：蘇氨酸、甲硫氨酸等 非必須氨基酸：苯丙氨酸、絲氨酸等氨基酸 葡萄糖糖分 煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺等維生素 鐵鹽、鈣鹽、鉀鹽、鈉鹽等無機鹽 激素、生長因子、粘附分子、脂類等血清緩沖體系酚紅培養(yǎng)基通用組份三.培養(yǎng)基 培養(yǎng)基各組分的作用：氨基酸、葡萄糖、維生素、無機鹽：細胞生命活動所必須的元素；緩沖體系：維持培養(yǎng)基恒定范圍內(nèi)的pH；血清：1.提供維持細胞生長的激素；2.是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源；3.蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害；4.提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等三.培養(yǎng)基 培養(yǎng)基各組分的作用：酚紅：作為PH值

6、的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色Tips：一些特殊的培養(yǎng)基中不可添加酚紅，因其能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，對細胞的生長和分化產(chǎn)生影響。三.培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基：（Serum-free Medium）不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基，但為了彌補血清特有的功能，需要添加以下組分：促貼壁物質(zhì)：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等；促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素；酶抑制劑：結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白、以及微量元素如硒等缺點根據(jù)細胞類型設(shè)計配方高純度添加劑細胞生長較為緩慢 無血清培養(yǎng)基的優(yōu)缺點優(yōu)點已知血清成分復(fù)雜，含有多種因子和激素等均一不同批次的血清成分不同，影響培養(yǎng)基的均一性可控由于每個成分可知，便可選擇性調(diào)配以適合不同細胞安全避免了血清攜帶病毒等的危險性以及常用牛血清的異源性量產(chǎn)