SDS-PAGE電泳實驗步驟

1、SDS-PAGE電泳實驗步驟垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)一、實驗目的學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測定蛋白質(zhì)的分子量的原理和基本操作 技術。二、實驗原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下解離而帶電荷。當溶液的pH大于蛋白質(zhì)的 等電點(pl)時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場中將向正極移動；當溶液的pH小于蛋白質(zhì)的 等電點時，蛋白質(zhì)帶正電，在電場中將向負極移動：蛋白質(zhì)在特定電場中移動的速度取決 于其本身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分子形狀、電場強度等。聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結構。本 實驗采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙丙烯

2、酰胺用量的多少，可制成不同孔徑的兩層凝膠：這 樣，當含有不同分子量的蛋白質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同 的遷移率。由于一上層膠的孔徑較大，不同大小的蛋白質(zhì)分子在通過大孔膠時，受到的阻滯 基本相同，因此以相同的速率移動：當進入小孔膠時，分子量大的蛋白質(zhì)移動速度減慢， 因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的區(qū)帶。這就是常說的濃縮效應和分子篩效 應。同時，在制備上層膠(濃縮膠)和下層膠(分離膠)時，采用兩種緩沖體系；上層膠 pH=6.7-6.8,下層膠pH=8.9： Tris-HCI緩沖液中的Tris用于維持溶液的電中性及pH, 是緩沖配對離子：CI-是前導離子。在pH6.

3、8時，緩沖液中的Gly-為尾隨離子，而在pH= 8. 9時，Gly的解離度增加；這樣濃縮膠和分離膠之間pH的不連續(xù)性，控制了慢離子的解 離度，進而達到控制其有效遷移率之目的。不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，在進入分離膠 后，各種蛋白質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳 中存在的濃縮效應，分子篩效應及電荷效應，使不同的蛋白質(zhì)在同一電場中達到有效的分 離如果在聚內(nèi)烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS),由于SDS帶有大量 的負電荷，旦這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強還原劑如藻基乙醇存在 下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與

4、SDS充分結合，形成 帶負電性的蛋白質(zhì)一SDS復合物；此時，蛋白質(zhì)分子上所帶的負電荷量遠遠超過蛋白質(zhì)分 子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場中 移動得愈快：反之，愈慢。蛋白質(zhì)的分子量與電泳遷移率之間的關系是：Mr=K(10-b , m) logMr=LogK-b , Rm,式中Mr蛋白質(zhì)的分子量；logK截距；b斜率：Rm相對遷移率。實驗證明，蛋白質(zhì)分子量在15, 000 200, 000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分子量的對數(shù)之間呈線性關系。蛋白質(zhì)的相對遷移率麗=蛋白質(zhì)樣品的遷移距離/染料(浪 酚藍)遷移距離。這樣，在同一電場中進行電泳，把標準蛋白質(zhì)的相對遷

5、移率與相應的蛋 白質(zhì)分子量對數(shù)作圖，由未知蛋白的相對遷移率可從標準曲線上求出它的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測定蛋白質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重復 性好的優(yōu)點，是目前一般實驗室常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。三、試劑及主要器材1.主要試劑1)標準蛋白混合液內(nèi)含：兔磷酸化酶B(Mw 97,400),牛血清蛋白免w 66,200),兔肌動蛋白(Mw 43, 000), 牛磷酸酢疇(Mw 31, 000)和雞蛋清溶菌酶(Mw 14, 400)2)30%凝膠貯備液：丙烯酰胺(Acr) 29.2g,亞甲基雙丙烯酰胺(Bis) 0. 8g,加雙 蒸水至100mL。外包錫紙，4冰箱

6、保存，30天內(nèi)使用。3)分離膠緩沖液(L5mol/L): Tris 18. 17g,加雙蒸水溶解,6mol/L HC1調(diào)pH8. 8,定 容100mL。4冰箱保存4)濃縮膠緩沖液(0. 5mol /L): Tris 6. 06g,加水溶解，6mol/L HC1調(diào)pH6. 8,并定容 到100mL。4冰箱保存5)電極緩沖液(pH8.3)： SDS lg, Tris 3g, Gly 14.4g,加雙蒸水溶解并定容到1000mLe 4冰箱保存。6)10%SDS,室溫保存7)質(zhì)量濃度10%過硫酸鉉(新鮮配制)8)上樣緩沖液：0. 5mol / L Tris-HCl pH6. 8 1. 25mL,甘油

7、2mL, 10%SDS 2mL, 部基乙醇1mL, 0. 1%澳酚藍0. 5mL,加蒸馀水定溶至10mL。9)0. 25%考馬斯亮藍R-250染色液：0. 25g考馬斯亮藍R250,加入911nl50%甲醇,9ml 冰醋酸10)脫色液:50ml甲醇，751nl冰醋酸與875ml雙蒸水混合11)未知分子量的蛋白質(zhì)樣 品(Img / mL )2.實驗器材1) 2) 3) 4) 5)四、實驗操作1.裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立起來使 底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適中程度，即可灌 膠。DYCZ-24D垂直板電泳槽（北京市六一

8、儀器廠）電泳儀長滴管及微量加樣器燒杯（250mL、500ml）、量筒（500mL、250ml）、培養(yǎng)皿（15cm?15cm）注射器等2 .凝膠的聚合分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置10%的分離膠和4. 8%的 濃縮膠。試劑名稱Acr/Bis 30%/ml分離膠緩沖液（pH8.9） /ml濃縮膠緩沖液（pH6.8） 10%SDS/ml 10%過硫酸餓/ul雙蒸水/ml TEMED/ul按上表各液加入混勻后配制成分離膠 后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)面緩緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加 到距短玻璃板上沿2cm處為止,約5mL0然后用細滴管或注射器仔細注入少量水，約0

9、. 5- 1mL。室溫放置聚合30-40min。待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表面的水分，按上表制備濃縮膠。用長滴 管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子（梳子）：待濃縮膠聚合后，小心拔出樣品模子。3 .蛋白質(zhì)樣品的處理若標準蛋白質(zhì)或欲分離的蛋白質(zhì)樣品是固體，稱取Img的樣品溶解F 1mL 0. 5mol / L pH6.8Tris-鹽酸緩沖液或蒸鏘水中：若樣品是液體，要測定蛋白質(zhì)濃度，按L01.5mg/ mL溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實驗所用樣品為1520?g的標 準蛋白樣品溶液，放置在0.5mL的離心管中，加入15 20?1的樣品處理液。在100C水浴 中處理2

10、min,冷卻至室溫后備用。吸取未知分子量的蛋白質(zhì)樣品20?1,按照標準蛋白的處理方法進行處理。4.加樣SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板,上提斜插板使其松開,然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠框,注 意在上述過程中手始終給玻璃膠室一個夾緊力,再將玻璃膠室凹面朝里置入電泳槽,插入斜 板,將緩沖液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上，外槽緩沖液加到距平板玻璃上沿3mm處即可,注意避 免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準確定位加樣位置，或用微量注射器 依次在各樣品槽內(nèi)加樣,各加1015?1（含蛋白質(zhì)1015?g）,稀溶液可加2030?1 （還 要根據(jù)膠的厚度靈活

11、掌握）。5.電泳加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關后，樣品進膠前電流控制在15 20mA,大約1520min：樣品中的澳酚藍指示劑到達分離膠之后，電流升到3045mA,電 泳過程保持電流穩(wěn)定。當澳酚藍指示劑遷移到距前沿12cm處即停止電泳，約廠2小時。 如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電冰溫度。6.染色、脫色電泳結束后，關掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕10研勺分離膠 3.3 3. 75 0 0. 1 50 4.05 5 5%的濃縮膠 0. 8 0 1.25 0. 1 25 2. 92 5 輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插

12、入銅絲作 為標志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25%的考馬斯亮藍染液，染色24h,必要時可過 夜。棄去染色液，用蒸餌水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經(jīng)常換脫 色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。7.結果處理1)測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質(zhì)樣品移動距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的 距離)，測量指示染料遷移的距離。2)按以下公式計算蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率(Rm)相對遷移率=樣品遷移距離(cm) /染料遷移距離(cm)3)標準曲線的制作：以各標準蛋白質(zhì)相對遷移率為橫坐標，蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)為 縱坐標在半對數(shù)坐標紙上做圖，得到一條標準曲線。4)測定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標準曲線上查得 該蛋白質(zhì)的分子量。五、思考題1.聚丙烯酰胺盤狀凝膠電泳的幾個不連續(xù)性是什么？ 2.電泳時的三個物理效應 是什么？是怎樣造成的？ 3.電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？ 4.上 樣緩沖液中加入甘油的作用是什么？ 5.貯液配制及貯存應注意什么？6 .過硫酸鉞、7%乙酸和考馬斯亮藍在實驗中有什么作用？附：不同分離膠的配制方法分離膠的濃度雙蒸水/ml 1. 5mol/L Tris-Hcl(pH8. 8)/ml 10%SDS/ml 凝膠儲備液(Acr/Bis) /ml 10