感染性疾病相關(guān)個體化醫(yī)學(xué)分子檢測技術(shù)指引

1、感染性疾病相關(guān)個體化醫(yī)學(xué)分子檢測技術(shù)指南、尸、 亠前言感染性疾病是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病， 快速、準(zhǔn)確的診斷是 有效治療、 病情監(jiān)測和控制疾病蔓延的重要前提。 隨著分子檢測技術(shù)的不斷發(fā)展 和完善，分子檢測在病原微生物感染診斷及治療監(jiān)測上的臨床應(yīng)用日益廣泛， 已 成為一些重要的感染性疾病的診斷和療效評價中不可缺少的重要工具。為使我國的感染性疾病分子檢測臨床應(yīng)用健康有序發(fā)展， 更好的為醫(yī)患提供 高質(zhì)量的服務(wù)， 有必要制訂感染性疾病相關(guān)的分子檢測技術(shù)指南， 規(guī)范臨床實驗 室相關(guān)分子檢測操作程序， 指導(dǎo)從事感染性疾病分子診斷的醫(yī)務(wù)人員正確開展工 作。本指南以大量、 豐富的臨床實踐為基礎(chǔ)，

2、同時消化吸取了大量國內(nèi)外文獻(xiàn)的 精華，廣泛征求相關(guān)學(xué)科專家的意見，遵循科學(xué)性、實用性、可行性的原則，反 復(fù)修改而成。我們衷心希望 感染性疾病相關(guān)個體化醫(yī)學(xué)分子檢測技術(shù)指南 能夠?qū)V大 檢驗人員起到很好的幫助和指導(dǎo)作用， 從而為提高感染性疾病臨床診治水平發(fā)揮 積極的作用本指南起草單位： 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、 國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中 心本指南起草人：尚紅、李金明、郭曉臨、代娣、程仕彤目錄1. 本指南適用范圍 3.2. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語 3.3. 感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測概述 9.4. 感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測分析前質(zhì)量控制 124.1 標(biāo)本采集 1.3.4.2 標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn) 1.

3、6.4.3 標(biāo)本的接收 1.7.4.4 標(biāo)本的保存 1.8.4.5 檢驗項目的選擇 1.9.5. 感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測分析中質(zhì)量控制 205.1 實驗室的設(shè)計要求 2.05.2 常用的分子檢測方法 2.15.3 試劑和方法的選擇 2.95.4 設(shè)備維護(hù)和校準(zhǔn) 3.6.5.5 人員培訓(xùn) 3.6.5.6 試劑性能驗證 3.7.6. 感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測分析后質(zhì)量控制 406.1 結(jié)果報告 4.0.6.2 結(jié)果的解釋及醫(yī)患的溝通 4.16.3 檢測后標(biāo)本的保存及處理 4.27. 質(zhì)量保證 4.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)操作程序 4.2.7.2 質(zhì)控品 4.2.7.3 室內(nèi)質(zhì)量控制

4、4.3.7.4 室間質(zhì)量評價 4.7.8. 感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測應(yīng)用 4. 88.1 乙型肝炎病毒感染診療的個體化分子檢測 4. 88.2 丙型肝炎病毒感染診療的個體化分子檢測 5. 28.3 結(jié)核分枝桿菌感染診療的個體化分子檢測 5. 68.4 人獲得性免疫缺陷病毒感染診療的個體化分子檢測 5. 7附錄 6.5.參考文獻(xiàn) 6.6.1. 本指南適用范圍本指南由國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會編訂， 是國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)系列指南之一， 旨為臨床實驗室進(jìn)行感染性疾病相關(guān) 的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測提供參考和指導(dǎo)。本指南介紹了感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測應(yīng)注意的

5、相關(guān)問題、 技 術(shù)方法、結(jié)果報告與解釋、質(zhì)量保證及臨床應(yīng)用等內(nèi)容。 本指南主要適用于開展個體化醫(yī)學(xué)分子檢測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗實驗室，同時供從事感染性疾病診治的臨床醫(yī)師參考。2. 標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語2.1 感染性疾病( infectious diseas)e即由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱。2.2 病原微生物( pathogen)指侵犯人體，引起感染的微生物， 或稱病原體。 病原微生物包括病毒、 細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體。2.3 宿主( host)為病原體提供生存環(huán)境的生物，本指南中的 “宿主 ”僅指人體。2.4 窗口期( window period)宿主感染病原體，需要

6、一段時間之后才能產(chǎn)生抗體。從感染病原體到能檢測 到抗體的時間就叫做窗口期。2.5 擴(kuò)增子擴(kuò)增產(chǎn)物( amplicon/amplification product)由目標(biāo)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的相對低分子量的產(chǎn)物。2.6 質(zhì)控品( control)為質(zhì)量控制目的而制備的標(biāo)本稱為質(zhì)控品。質(zhì)控品不能用于校準(zhǔn)。質(zhì)控品的 性能指標(biāo)有 :穩(wěn)定性、瓶間差、定值和非定值、分析物水平、預(yù)處理的要求等。2.7 標(biāo)準(zhǔn)品( standard) 用于定標(biāo)，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。2.8 校準(zhǔn)品( calibrator) 指定用來校準(zhǔn)某檢測系統(tǒng)(儀器 +試劑 +方法程序)的，是在考慮到基質(zhì)效應(yīng) 的情況下，人為賦予校準(zhǔn)品的校準(zhǔn)值。因此，校

7、準(zhǔn)品必須專用于某一檢測系統(tǒng)。2.9 抑制作用( inhibition) 臨床標(biāo)本中的某些成分或者標(biāo)本采集和處理過程中引入的某些外源性物質(zhì) 可能對擴(kuò)增反應(yīng)或者識別過程產(chǎn)生的削弱作用。2.10 內(nèi)部質(zhì)控( internal control) 在同一個反應(yīng)管中存在的一段非目標(biāo)序列，將與目標(biāo)序列一同被擴(kuò)增，用于 識別由溫控故障、 不合格的試劑或聚合酶活性等造成的抑制作用， 以及識別相同 的基質(zhì)內(nèi)是否存在抑制性物質(zhì)。2.11 核酸酶( nuclease) 能夠水解核酸的多種酶中的任何一種，比如內(nèi)切酶和外切酶。2.12 核酸提取( nucleic acid extraction)將核酸( RNA ，DNA

8、 )從生物物質(zhì)中分離出來的過程，以備進(jìn)行核酸的擴(kuò)增 和分析。2.13 檢驗( examination) 以確定一個特性的值或特征為目的的一組操作。 實驗室檢驗也常稱為檢測或 試驗。確定一個特性的值的實驗室檢驗稱為定量檢驗， 確定一個特性的特征的實 驗室檢驗稱定性檢驗。2.14 原始樣品（primary sample）/ 標(biāo)本（specimen為檢驗、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認(rèn)為可代表整體的一獨立 部分的體液、呼出氣、毛發(fā)或組織等。2.15 樣品（ sample）取自原始樣品的一部分或多部分。2.16 寡核苷酸（ Oligonucleotide）一種短分子單鏈 DNA ，通常為 6-

9、100 個核苷酸，由化學(xué)方式合成。2.17 引物（ Primer）一個寡核苷酸，可以與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)鏈雜交。在DNA聚合酶和核苷酸的 參與下，啟動 DNA 的合成過程（從 3'-OH 端開始）。2.18 探針（ Probe）已定義的單鏈核酸片段， 用于識別特定的包含其互補(bǔ)序列的 DNA 或者 RNA 分子。探針通常都附帶一個標(biāo)記（放射性標(biāo)記或者化學(xué)性標(biāo)記），使探針在雜交 后能被檢測到。2.19 淬滅劑（ Quencher）能夠從熒光基團(tuán)接收能量并且通過近端淬滅或者 FRET 淬滅來消耗該能量的 分子。2.20 野生型（ wild type） 基因或生物體在自然界中常見的或非突變型的形

10、式。2.21 突變（ mutation）基因的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而導(dǎo)致細(xì)胞、病毒或微生物的基因型發(fā)生穩(wěn)定的、可遺傳的變化過程。2.22 點突變( point mutation) 基因內(nèi)單個核苷酸置換所造成的結(jié)構(gòu)改變。2.23 缺失突變( deletion mutation) 由于相鄰的多個核苷酸或片段丟失所造成的突變。2.24 雜合子( heterozygote)又稱“雜合體 ”。在二倍體生物中，一對同源染色體上特定的基因座上有兩個 不同的等位基因的個體或細(xì)胞。2.25 純合子( homozygote) 又稱“純合體”。在二倍體生物中，一對同源染色體上特定的基因座上有兩個 相同的等位基因的個體或細(xì)胞

11、。2.26 表型( phenotype) 一個生物體(或細(xì)胞)可以觀察到的性狀或特征，是特定的基因型和環(huán)境相 互作用的結(jié)果。2.27 基因型( genetype) 一個生物體或細(xì)胞的特定基因組成。2.28 單核苷酸多態(tài)性( Single nucleotide polymorphisms, SNP)s是指由單個核苷酸一A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成 包括人類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。2.29 隨機(jī)誤差( random error ) 在重復(fù)測量中按不可預(yù)見方式變化的測量誤差的分量。 通常隨機(jī)誤差的參考 量值是對同一被測量多次重復(fù)測量得到的均值。2.30 系統(tǒng)誤差(

12、systematic error)在重復(fù)測量中保持不變或按可預(yù)見方式變化的測量誤差的分量。 系統(tǒng)誤差的 參考量值是真值 ,或者是測量不確定度可忽略不計的測量標(biāo)準(zhǔn)測得的值 ,還可以約 定量值。2.31 驗證( verification) 通過提供客觀證據(jù)證實對規(guī)定要求已得到滿足的認(rèn)定。 驗證過程證實的檢驗 程序的性能指標(biāo) ,應(yīng)與檢驗結(jié)果的預(yù)期用途相關(guān)。2.32 確認(rèn)( validation) 通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認(rèn)定。 性能確 認(rèn)應(yīng)盡可能全面 ,并通過客觀的證據(jù) (以性能特征形式 ) 證實滿足檢驗預(yù)期用途的 特定要求。2.33 精密度( precision)在規(guī)

13、定條件下， 對同一或類似被測對象重復(fù)測量所得示值或測得值間的一致 程度。規(guī)定條件可以是重復(fù)性測量條件、 期間精密度測量條件或復(fù)現(xiàn)性測量條件。 精密度通常無法衡量，而以不精密度表達(dá)，常用標(biāo)準(zhǔn)差、方差或變異系數(shù)表示， 是對隨機(jī)誤差的衡量。2.34 正確度( trueness) 多次重復(fù)檢測所得量值的平均值與一個參考量值間的一致程度。通常用 “偏倚”表達(dá)，是對系統(tǒng)誤差的衡量。選擇一個合適的參考對正確度評價很重要，最 好采用參考方法。2.35 可報告范圍( reportable range) 指測量儀器的誤差在預(yù)期規(guī)定范圍內(nèi)的被測量值的集合。2.36 測量范圍（measurement range檢測方

14、法可直接對未經(jīng)稀釋、濃縮或其他非常規(guī)檢測流程預(yù)處理的標(biāo)本進(jìn)行 檢測，得到的分析物濃度范圍。2.37 臨床可報告范圍（clinically reportable range通過采用標(biāo)本的稀釋、濃縮或其他預(yù)期處理，用于延長直接的分析測量范圍 下的分析物值的范圍，其范圍一般較測量范圍寬，是考慮方法檢測限和預(yù)處理流 程后的測量范圍的延伸。2.38 參考區(qū)間（reference interval）又稱為參考范圍、正常范圍等，通常采用參考值分布的中間95%區(qū)間。2.39 檢測限（limit of detection, LoD指某一分析方法在給定的可靠程度內(nèi)可以從樣品中檢測待測物質(zhì)的最小濃 度或最小量。2.

15、40 干擾（interference）指被測物質(zhì)濃度因樣品特性或其他成分的影響而出現(xiàn)的臨床顯著性偏差，評價的是由樣品引起的特異性偏差。2.41 敏感性（sensitivity指金標(biāo)準(zhǔn)診斷有病的全部病例中，被評價方法結(jié)果為陽性的病例占全部有病 病例的比例，即敏感性=真陽性/（真陽性+假陰性）100%。2.42 特異性（specificity指金標(biāo)準(zhǔn)診斷全部無病病例中，被評價檢驗方法結(jié)果為陰性的病例所占全部 無病病例的比例，即特異性=真陰性/（假陽性+真陰性）00%。2.43 生物學(xué)變異（biological variation指在機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)下，排除已知可能影響因素(例如，疾病、用藥、禁食、 運(yùn)

16、動等)，除外已知節(jié)律性變化(例如，對于某些檢驗項目，晝夜或季節(jié)性變化 等)，依然存在的隨機(jī)變異。2.44 分析前變異( pre-analytical variation) 從患者準(zhǔn)備開始至樣品分析啟動前各環(huán)節(jié)造成的變異，包括抽血及有關(guān)條 件、運(yùn)輸、離心、保存等環(huán)節(jié)或因素造成的變異。2.45 檢驗前過程( pre-examination processe)s 分析前階段( preanalytical phase)按時間順序從醫(yī)生申請至分析檢驗啟動前的過程，包括檢驗申請、患者準(zhǔn)備 和識別、原始樣品采集、運(yùn)送和實驗室內(nèi)運(yùn)送等。2.46 檢驗后過程( post-examination processe

17、)s 分析后階段( postanalytical phase)包括結(jié)果復(fù)核、臨床材料保留和儲存、樣品和廢物處理，以及檢驗結(jié)果的格 式化、發(fā)布、報告和留存等。3. 感染性疾病相關(guān)的個體化醫(yī)學(xué)分子檢測概述感染性疾病是由病原微生物(細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等)引起的疾病的統(tǒng)稱。據(jù)統(tǒng)計感染性疾病死因占全部死因的 25%以上，是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅人類 健康的重大疾病。3.1 分子檢測與感染性疾病的個體化醫(yī)療個體化醫(yī)療(personalized medicine是以每個患者的信息為基礎(chǔ)來決定治療方案，從基因組成或表達(dá)變化的差異來把握治療效果或毒副作用等應(yīng)答特異性， 對每個患者進(jìn)行最適宜的治療。 個體化醫(yī)療目

18、前在個體化用藥、 疾病診斷、 治療監(jiān)測以及預(yù)后判斷中都發(fā)揮著重要作用長期以來感染性疾病的診斷和療效監(jiān)測一直依靠形態(tài)學(xué)、 免疫學(xué)以及病原體 分離培養(yǎng)和藥敏試驗等方法，但形態(tài)學(xué)檢驗受檢測人員經(jīng)驗影響較大，易誤診； 而免疫學(xué)、 藥敏試驗和病原體分離培養(yǎng)的窗口期或檢測實驗周期較長， 易錯過最 佳治療時機(jī)。分子檢測在病原體檢測中優(yōu)勢明顯，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn) 確。因此近年來發(fā)展較快， 已成為病原體診治中不可或缺的重要工具， 而且已經(jīng) 廣泛應(yīng)用于感染性疾病的個體化診斷和治療中。 例如利用分子檢測技術(shù)可以幫助 明確乙型肝炎患者體內(nèi) HBV DNA 的病毒載量、基因型和基因突變情況， 而這些 正是判斷患

19、者何時開始治療、 采用何種治療方案、 發(fā)生肝硬化等不良預(yù)后風(fēng)險的 決定性因素。3.2 個體化醫(yī)學(xué)分子檢測在感染性疾病中的應(yīng)用 本指南中涉及的感染性疾病個體化醫(yī)學(xué)分子檢測主要包括病原體核酸定量 檢測、分子分型檢測、耐藥基因檢測及與療效相關(guān)宿主基因型檢測。3.2.1 病原體核酸定量（載量）檢測 病原體核酸定量檢測有助于評估疾病階段及嚴(yán)重程度，指導(dǎo)臨床合理用藥， 觀察療效，監(jiān)測疾病進(jìn)程以及判斷疾病預(yù)后。例如 HCV RNA 檢測是判斷 HCV 有無現(xiàn)癥感染的證據(jù)； 其病毒載量的高低與患者的長期預(yù)后如肝硬化和肝癌的發(fā) 生相關(guān)，是進(jìn)行抗病毒治療的基礎(chǔ)， 同時還是應(yīng)用抗病毒治療過程中耐藥監(jiān)測的 最重要指標(biāo)

20、。 應(yīng)根據(jù)抗病毒治療的早期病毒學(xué)應(yīng)答情況來調(diào)整治療方案， 以提高 療效，降低耐藥發(fā)生率。病原體分子分型檢測由于不同型別病原體具有迥異的致病性和藥物敏感性， 因此病原體分子分型檢測有助于指導(dǎo)臨床合理治療以及判斷疾病預(yù)后。例如HCV分為6個基因型和80多種基因亞型，不同基因型患者的病毒學(xué)應(yīng)答率差距明顯，如2、3及6型患者較易獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，而1和4型應(yīng)答較差，屬于難治性丙型肝 炎，其利巴韋林的用藥劑量和用藥時間有顯著差別。因此在采用傳統(tǒng)方法治療前 須進(jìn)行HCVS因型檢測，以便決定治療方案。目前，丙肝的臨床治療已取得重大 進(jìn)展，一些小分子藥物對丙肝病毒無基因型要求，并且臨床治愈率很高。

21、宮頸癌早期癥狀不明顯，發(fā)展過程中存在較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期。從 一般的宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌大約需要10年時間。如能在癌前病變階段進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)，宮頸癌治愈率可達(dá)98%。多中心研究表明，我國宮頸癌及宮頸高危 病變以感染HPV16和18型為主，約85%左右的宮頸癌確診病例屬于這兩種類 型，且HPV16/18型的感染率和致癌率都明顯高于其他高危HPV型別。因此對高風(fēng)險人群進(jìn)行HPV16/18等高危型篩查有助于宮頸癌的防治。323病原體耐藥基因檢測所有產(chǎn)生耐藥的病原體，不論其產(chǎn)生的機(jī)制如何，均與病原體基因位點突變 有關(guān)，因此進(jìn)行病原體耐藥基因檢測有助于早期指導(dǎo)臨床合理用藥，控制耐藥病原體的流行。

22、例如結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥與ropB位點突變有關(guān)；腸球菌對糖肽類抗生素的耐藥基因由 Van A、Van B、Van C等介導(dǎo)，測定這些基因可以預(yù) 測對萬古霉素和壁霉素的耐藥性。因此，應(yīng)根據(jù)耐藥基因突變情況來調(diào)整治療方 案，以提高療效，避免耐藥發(fā)生。與療效相關(guān)的宿主基因型檢測宿主基因多態(tài)性可能對病原體的清除和治療產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，IL28B的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism, SNP)與抗HCV療效密切相關(guān)，IL28B 的基因型有助于臨床療效預(yù)測，確定慢性丙型肝炎患者的個體化治療方 案，使病人獲得最大的收益。3.3 分子檢測在感染性疾病個體化醫(yī)療應(yīng)

23、用中的局限性 綜上所述，個體化醫(yī)學(xué)分子檢測已日益廣泛地應(yīng)用于感染性疾病的診治過 程，并取得了顯著成效。然而，在目前的臨床實驗室應(yīng)用中，應(yīng)注意以下幾點： 影響分子檢測準(zhǔn)確性的因素很多， 如實驗室污染或是標(biāo)本間交叉污染可導(dǎo)致假 陽性結(jié)果， 擴(kuò)增抑制物或是標(biāo)本處理不充分可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)果等。 因此，必 須建立規(guī)范化實驗室質(zhì)量控制體系和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并嚴(yán)格按照要求進(jìn)行檢測。 盡管其具有敏感性高、 特異性好等優(yōu)點， 但其本身還有許多方面有待進(jìn)一步完 善。如單次的分子檢測不能判斷是否為活的病原體； 受多種因素影響， 基因型耐 藥和表型耐藥可能存在差異等。 因此當(dāng)我們選擇分子檢測方法時， 必須基于該種 檢

24、測結(jié)果的臨床價值， 需考慮結(jié)合其他檢測項目或檢測方法綜合判斷結(jié)果。 感 染性疾病的臨床診治常是極其錯綜復(fù)雜的，僅依靠一項或幾項實驗室檢查還不 夠，詳細(xì)的病史詢問，細(xì)致的體格檢查等綜合分析是極為重要的。4. 分析前質(zhì)量控制分子檢測分析前質(zhì)量控制包括填寫正確完整的檢驗申請單， 合理規(guī)范的標(biāo)本 采集，適當(dāng)?shù)臉?biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)周期和轉(zhuǎn)運(yùn)條件， 以及適宜的標(biāo)本預(yù)處理和分析前標(biāo)本保 存等。感染性疾病個體化分子檢測通常檢測的是病原體的核酸， 其濃度、 穩(wěn)定性 和完整性對檢驗結(jié)果有決定性影響， 因此為得到可靠和準(zhǔn)確的檢驗結(jié)果， 有必要 規(guī)范分析前質(zhì)量控制的各項程序。 病原微生物核酸檢測不同于其他分子檢測， 有 其自身的

25、特點， 在分析前階段主要包括： 病原微生物核酸不僅存在于血液、 腦 脊液等體液中， 還存在于尿液、 糞便等排泄物中， 因此影響核酸純化的干擾物質(zhì)（如血紅素、尿素、pH值等）較多。病原微生物核酸受病原微生物生命周期、 復(fù)制環(huán)境和患者用藥等情況的影響， 所以要根據(jù)檢驗?zāi)康恼_選擇檢驗項目、 標(biāo) 本采集時間和標(biāo)本采集類型等。 標(biāo)本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)容器、 標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存條件以 及標(biāo)本處理方法等都會直接影響病原微生物核酸檢測。 標(biāo)本采集、 轉(zhuǎn)運(yùn)及儲存 需按照血源性病原體職業(yè)接觸防護(hù)導(dǎo)則 、病原微生物實驗室管理條例 和實 驗室生物安全通用要求 等相關(guān)生物安全要求進(jìn)行操作。 鑒于病原微生物分子檢 測的特殊性，有如

26、下建議：4.1 正確、規(guī)范的標(biāo)本采集感染性疾病是臨床的常見病， 重癥感染有較高的病死率。 正確的標(biāo)本采集對 感染的早期診斷和有效治療等有重要的臨床意義。標(biāo)本采集原則詳見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南 ，但在感染性疾病個體化醫(yī)學(xué)檢測中 尤其需注意以下幾點： 采集標(biāo)本時應(yīng)使用嚴(yán)格的無菌技術(shù)， 將污染的可能性降 至最低； 標(biāo)本采集時間由檢測目的決定， 如在感染的急性期， 應(yīng)在使用抗生素 或傷口局部治療前采集標(biāo)本進(jìn)行基線檢測， 再根據(jù)治療時間和循環(huán)病原微生物半 衰期等確定再次采樣時間； 在患者使用抗感染治療前， 應(yīng)在發(fā)熱初期或高峰期或 發(fā)熱前半小時采集標(biāo)本， 對已使用抗感染治療而又不能停藥的患者， 應(yīng)重復(fù)

27、采集 標(biāo)本數(shù)次以提高檢出率； 采取適當(dāng)?shù)慕馄饰恢煤图夹g(shù)， 防止標(biāo)本溶血等影響檢 測結(jié)果的準(zhǔn)確性； 正確選擇采集 /儲存容器， 例如檢測的病原微生物為 RNA 病 毒（如 HCV、 HIV 等），由于 RNA 易受 RNA 酶的降解 , 須使用經(jīng)高壓滅菌或經(jīng) RNase酶清除處理過的無 RNase酶的一次性耗材。確定正確的標(biāo)本量為避免因病原體核酸濃度過低造成假陰性結(jié)果， 應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康暮蜋z驗方法 的要求采集足夠量的標(biāo)本。 例如利用支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌核酸檢 測時，至少要留取 1ml 支氣管肺泡灌洗液。常用標(biāo)本類型 常用標(biāo)本包括血漿、血清、全血、支氣管肺泡灌洗液、骨髓、腦脊液、培養(yǎng) 的

28、細(xì)胞、培養(yǎng)的菌株、尿液、痰液、拭子、尿液、乳汁等。為避免標(biāo)本中核酸的 降解，保證核酸的完整性和檢測的準(zhǔn)確性， 對每種標(biāo)本的采集有以下建議， 但具 體要求由臨床需求和檢測目的決定：血液標(biāo)本肝素是 Taq 酶的強(qiáng)抑制劑，全血和血漿標(biāo)本宜選擇乙二胺四乙酸 （EDTA ） 或枸櫞酸（ ACD ）鹽作為抗凝劑。鑒于注射器采血易導(dǎo)致溶血，建議采用真空 負(fù)壓采血管采集血液標(biāo)本；采用帶有促凝劑的真空負(fù)壓采血管采集血清標(biāo)本。 呼吸系統(tǒng)標(biāo)本痰液標(biāo)本應(yīng)以清晨第一口痰為宜， 患者晨起用清水漱口數(shù)次， 用力咳出深部 痰液，混有血液為不合格樣品。 留取至少 1ml 于無菌可密封標(biāo)本盒中。 痰量少者 可采用加溫45C左右的

29、10%氯化鈉溶液霧化吸入，使痰液容易排出。咽拭子應(yīng) 用棉拭子采集患者咽后壁或懸雍垂的后側(cè)， 反復(fù)涂抹數(shù)次。 鼻咽拭子應(yīng)經(jīng)鼻腔進(jìn) 入鼻咽部采集標(biāo)本， 置于運(yùn)送培養(yǎng)基中送檢； 鼻咽管應(yīng)用細(xì)鼻飼管從鼻腔進(jìn)入到 鼻咽部，用負(fù)壓吸引器吸取鼻咽部分泌物并放入無菌容器內(nèi)送檢。 支氣管肺泡灌 洗液應(yīng)留取至少 1ml 于無菌可密封試管中。泌尿生殖系統(tǒng)標(biāo)本尿液標(biāo)本：建議采集濃縮晨尿，至少 10ml 于無菌可密封試管中。應(yīng)考慮尿量、距上次排尿的時間、 感染等因素對結(jié)果的影響。 在應(yīng)用抗感染治療前或停藥 1-2 天后采集標(biāo)本，最好采集清晨第一次尿液或者采集在膀胱內(nèi)貯留6-8 小時的尿液。可采用中段尿液采集法、 導(dǎo)尿采

30、集法、 膀胱穿刺法。 宮頸和尿道拭子標(biāo)本： 男性尿道標(biāo)本采用滌綸拭子， 女性宮頸和陰道標(biāo)本采用人造纖維或滌綸拭子， 并 放入適當(dāng)?shù)幕|(zhì)液中。用于支原體分子檢測 , 取材時一定要取到上皮細(xì)胞（沙眼 衣原體在活細(xì)胞內(nèi)才能增殖復(fù)制） ，而只取分泌物會降低檢出率。 宿主細(xì)胞 DNA 比例、其他微生物、分泌物的量等可能會直接影響分子檢測結(jié)果。其他體液標(biāo)本胸腹水標(biāo)本： 首次穿刺抽到積液后， 應(yīng)棄掉第一管標(biāo)本及所用注射器， 然后 更換新的一次性注射器抽取。 穿刺采集后留取中段液體于帶蓋的無菌試管內(nèi)， 因 積液易凝集，應(yīng)采用 EDTA 抗凝，同時注意防止外傷性血液的進(jìn)入。乳汁標(biāo)本： 留取至少10ml。糞便標(biāo)本

31、：留取有粘液或其他特征性糞便標(biāo)本于無菌可密封標(biāo) 本盒中，不能混有尿液。腦脊液標(biāo)本：建議在留取化學(xué)和免疫學(xué)、細(xì)菌學(xué)、以及 一般性狀等檢查標(biāo)本后，留取至少1ml腦脊液于無菌可密封試管中，以避免皮膚 病菌污染和混入血液致溶血而影響檢測結(jié)果。 組織標(biāo)本： 淺表、開放性膿庖和創(chuàng) 口應(yīng)清創(chuàng)后 ,使用拭子涂抹創(chuàng)口；蜂窩織炎和丹毒應(yīng)使用穿刺針抽吸組織取樣； 復(fù)雜性皮膚軟組織感染使用組織活檢、 穿刺針抽吸、 外科手術(shù)等方法取深層組織 進(jìn)行檢測。培養(yǎng)的細(xì)胞或菌株 /毒株在提取前最好放在37C或其適宜生長的溫度或環(huán)境中；并嚴(yán)格按照相關(guān)生 物安全要求進(jìn)行操作。4.2 標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)原則詳見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指

32、南 ，但在感染性疾病個體化醫(yī)學(xué)檢測中 尤其需注意以下幾點： 按照國家 病原微生物實驗室生物安全管理條例 進(jìn)行 相應(yīng)病原微生物標(biāo)本的運(yùn)輸，如已知為 HIV 陽性標(biāo)本需由經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)并具有 相應(yīng)資質(zhì)的人員使用 WHO 三級包裝系統(tǒng)的容器運(yùn)輸。 如條件允許， 建議盡快 將標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)至實驗室進(jìn)行預(yù)處理或保存。 根據(jù)檢驗的靶基因和處理前時間決定 轉(zhuǎn)運(yùn)條件，如腦脊液標(biāo)本用于DNA檢測時應(yīng)2-8C轉(zhuǎn)運(yùn)，用于RNA檢測時應(yīng)立 即冰上轉(zhuǎn)運(yùn)。 采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)方式和容器， 以避免標(biāo)本污染， 如采血管可采用 氣動傳送轉(zhuǎn)運(yùn)， 但糞便標(biāo)本建議采用人工轉(zhuǎn)運(yùn)。 實驗室應(yīng)評估標(biāo)本容器， 確保 其不會對所進(jìn)行的分析造成任何干擾。常

33、見類型標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)要求4.2.2.1 血液標(biāo)本全血標(biāo)本：如轉(zhuǎn)運(yùn)時間在 24小時內(nèi)可室溫轉(zhuǎn)運(yùn)，在 2472小時內(nèi)則28C 轉(zhuǎn)運(yùn)；凍存樣本需用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)。血漿、血清標(biāo)本：建議 2-8 C轉(zhuǎn)運(yùn)；凍存樣本需 用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)。4.2.2.2 腦脊液、胸腹水、支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本用于DNA檢測的樣本，應(yīng)2-8C轉(zhuǎn)運(yùn)；用于RNA檢測的樣本，應(yīng)立即冰上 轉(zhuǎn)運(yùn)；凍存樣本需用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)。4.2.2.3 尿液、乳汁、糞便、宮頸和尿道拭子標(biāo)本應(yīng)盡快轉(zhuǎn)運(yùn)，如環(huán)境溫度 > 2C，建議2-8C轉(zhuǎn)運(yùn)。4.2.2.4 痰液標(biāo)本用于DNA檢測的標(biāo)本，如在30分鐘內(nèi)不能轉(zhuǎn)運(yùn)至實驗室，建議2-8C轉(zhuǎn)運(yùn)。培養(yǎng)的細(xì)胞或菌株 /毒株最好放在37

34、°C或其適宜生長的溫度或環(huán)境中轉(zhuǎn)運(yùn)；注意按照相關(guān)生物安全要求進(jìn)行操作。4.3 標(biāo)本的接收不合格標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn)通用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本信息不正確、 不完整（必要時應(yīng)包括詳盡的臨床信息和采集部位， 以便 于準(zhǔn)確地進(jìn)行臨床解釋） 、標(biāo)本類型或標(biāo)本容器與檢驗?zāi)康牟环?、?biāo)本量過少 / 過多、無采集時間、標(biāo)本有明顯的污染跡象（如已溢灑） 、標(biāo)本采集后超過預(yù)處 理時間送檢等。不合格標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn) 血液標(biāo)本溶血、乳糜、嚴(yán)重黃疸等；體液標(biāo)本混有血液；痰標(biāo)本為褐色血痰 或含有少量新鮮血液的血痰、唾液標(biāo)本（透明或半透明水樣、粘度較低、有時伴 有氣泡）；固體培養(yǎng)物培養(yǎng)在非適當(dāng)?shù)墓腆w培養(yǎng)基、菌苔較少；液體培養(yǎng)物菌液 濃度小于

35、 1 個麥?zhǔn)蠞岫鹊?。讓步檢驗標(biāo)本的接收標(biāo)準(zhǔn)對于樣本量較少， 能滿足檢驗用量但不足樣本保存量的， 且患者重新采樣存 在困難的，與臨床科室溝通后予以接收。對于樣本有輕微乳糜或溶血， 患者重新采樣存在困難或由于藥物等影響再次 采樣仍會存在乳糜或溶血的， 經(jīng)與臨床科室溝通堅持檢驗的， 予以接收， 記錄至 當(dāng)日的工作日志，并在發(fā)送的檢驗報告的備注中注明樣本情況。當(dāng)標(biāo)本標(biāo)識不清或不全， 但標(biāo)本再獲取困難或原始標(biāo)本中需檢測的核酸不穩(wěn)定，可先接收標(biāo)本， 待項目申請醫(yī)師或標(biāo)本采集人員識別了標(biāo)本信息， 提供適當(dāng) 的信息并確定標(biāo)本所對應(yīng)的患者后再發(fā)送檢驗結(jié)果報告。4.4 標(biāo)本的保存標(biāo)本保存的原則詳見個體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)

36、量保證指南 ，但在感染性疾病個體化醫(yī)學(xué)檢測中 尤其需注意以下幾點：為保證核酸的完整性和穩(wěn)定性，選擇適宜的溫度保存。 不能使用無霜冰箱保存標(biāo)本， 要記錄冰箱溫度， 如有條件可安裝冷鏈系統(tǒng)監(jiān)測 冰箱溫度。 使用適宜的容器保存標(biāo)本和預(yù)處理后的樣本， 如血漿在有分離膠的 采血管中凍存后會使 HIV-1 病毒載量檢測值假性升高，因此需離心分離出血漿 后，轉(zhuǎn)移至無RNase酶的可密封容器中保存。反復(fù)凍融會降解核酸，因此避 免反復(fù)凍融。如果有條件，在用于 RNA檢測的標(biāo)本采樣器中加入 RNA穩(wěn)定 劑凍存。DNA在TE (Tris-EDTA)中會更穩(wěn)定，室溫可保存 26周，2-8CA1 年，-20CW7年，W

37、70CA7年。保存病原微生物標(biāo)本的冰箱需雙人雙鎖，取用 具有高致病性病原微生物標(biāo)本需申報，經(jīng)審批后按相應(yīng)生物安全要求操作。常見類型標(biāo)本保存條件4.4.2.1 血液標(biāo)本全血標(biāo)本：室溫可保存24小時，保存2-8 T時應(yīng)在72小時內(nèi)提取DNA ;建 議在去除紅細(xì)胞后，-20T或V70C長期保存。血漿、血清標(biāo)本：如果 4小時內(nèi) 不能提取RNA，應(yīng)£70C保存血漿。建議-20T或V70C長期保存。4.4.2.2 呼吸系統(tǒng)標(biāo)本痰液標(biāo)本：如不能立即檢測應(yīng)在£70°C保存。用于分枝桿菌分子檢測需液化 后保存。支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本：如果 24小時內(nèi)不能檢測，2-8 C可保存72小

38、時，如近期不能檢測應(yīng)在70 C保存。如進(jìn)行分枝桿困檢測，應(yīng)在液化后保存。4.4.2.3 其他體液標(biāo)本腦脊液、胸腹水標(biāo)本：用于DNA檢測的樣本，如不能立即檢測應(yīng)在-20C或 70C保存。用于RNA檢測的樣本，應(yīng)在1-4小時內(nèi)提??；如近期不能檢測， 應(yīng)在去除紅細(xì)胞后立即凍存。 宮頸和尿道拭子標(biāo)本： 用于 DNA 檢測的樣本 2-8C 保存10天。尿液、乳汁、糞便標(biāo)本：建議采集后保存在 2-8 C，并盡快提取核 酸。4.4.2.4 培養(yǎng)的細(xì)胞或菌株 /毒株在檢測前最好放在37 C或其適宜生長的溫度或環(huán)境中，注意按照相關(guān)生物 安全要求進(jìn)行操作。4.5 正確選擇檢驗項目根據(jù)檢驗?zāi)康暮侠磉x擇， 包括根據(jù)患

39、者的診治情況正確選擇各檢驗項目的檢 測時機(jī)和頻次， 根據(jù)臨床意義選擇正確的標(biāo)本類型， 根據(jù)不同標(biāo)本情況正確選擇 檢測方法、判斷檢測結(jié)果等。正確選擇檢測時機(jī)和頻次一般情況下， 病原體核酸定量檢測應(yīng)根據(jù)病原體感染的自然史， 在進(jìn)行用藥 指導(dǎo)、治療或者療效預(yù)測時進(jìn)行檢測。 例如 HBV DNA 定量檢測應(yīng)在抗病毒治療 前進(jìn)行基線檢測， 再根據(jù)治療效果的不同， 每3個月或 6個月進(jìn)行隨訪檢測。 病 原體基因型和耐藥基因檢測， 通常在進(jìn)行用藥指導(dǎo)、 治療或者病原體核酸數(shù)量反 彈時進(jìn)行檢測， 一般檢測一次即可， 但如果存在再次感染或更換治療方案時， 可 能需要再次進(jìn)行檢測。 與療效相關(guān)的宿主基因型檢測，

40、通常在進(jìn)行用藥指導(dǎo)或治 療時進(jìn)行，檢測一次即可4.5.2 根據(jù)臨床意義選擇正確的標(biāo)本類型不同標(biāo)本類型中的病原體可能是處在不同生命周期中的病原體， 其分子檢測 的臨床意義可能不同。 例如外周血單個核細(xì)胞 （PBMC ）可用于檢測 HIV 整合入 宿主基因組的前病毒DNA （即潛伏病毒），而血漿用于檢測HIV的病毒RNA （即 游離病毒），在對 HIV 感染產(chǎn)婦所生的未滿 18 個月的嬰幼兒進(jìn)行早期診斷時， 應(yīng)選擇 HIV DNA 檢測，以免受到母親以及嬰幼兒預(yù)防性抗病毒治療的干擾而影 響診斷。4.5.3 根據(jù)標(biāo)本類型正確判斷檢測結(jié)果不同的標(biāo)本類型可能導(dǎo)致檢測結(jié)果有顯著差異， 這些差異將影響臨床決

41、策， 因此要依據(jù)臨床需要選擇正確的標(biāo)本類型，如 EBV 在全血中的病毒載量比血漿 高 1 個 log 。5. 感染性疾病相關(guān)個體化醫(yī)學(xué)分子檢測的分析中質(zhì)量控制5.1 實驗室設(shè)計要求參見醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實驗室管理辦法 等相關(guān)要求， 同時需根 據(jù)病原微生物實驗室生物安全管理條例和人間傳染的病原微生物名錄對 所檢測的病原微生物進(jìn)行風(fēng)險評估， 然后在相應(yīng)生物安全級別的實驗室按照 實 驗室生物安全通用要求 和血源性病原體職業(yè)接觸防護(hù)導(dǎo)則 等衛(wèi)生法律法規(guī) 和各項生物安全管理規(guī)范開展檢測工作。 例如結(jié)核分枝桿菌分子檢測， 如僅涉及 少量活菌可在 BSL-2 級實驗 室開展，但如果需要先進(jìn)行培養(yǎng)，則需

42、要在 BSL-3 級實驗室開展。5.2 常用的分子檢測方法聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR）基本原理PCR 技術(shù)的基本原理類似于 DNA 的天然復(fù)制過程， 其特異性依賴于與靶序 列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR 由變性退火延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95C左右一定時間后，模板 DNA雙 鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離成為單鏈，它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作 準(zhǔn)備。模板DNA與引物的退火：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 最佳退火溫度，引物與模板 DNA 單鏈以互補(bǔ)序列配對結(jié)合。 引物的延伸： DNA 模板引物結(jié)合物在72C條件下、利用DNA聚合酶(如TaqD

43、NA聚合酶)的作 用，以 dNTP 為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理， 合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性退火延伸 三過程就可獲得更多的 “半保留復(fù)制鏈 ”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模 板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能 將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾 百萬倍。主要類型及臨床應(yīng)用定性檢測 定性檢測包括病原體分子分型、耐藥基因突變及宿主基因型檢測。 等位基因特異性 PCR (allele specific-PCR, ASO-PCR) ：又稱作 ARMS(amplification refractory mutation system)

44、或 PASA (PCR amplification)?；驹恚焊鶕?jù)基因變異位點設(shè)計特異引物，其中一條鏈(特異鏈)的3'末端與突變位點的堿基互補(bǔ)，另一條鏈(通用鏈)按常規(guī)方法設(shè)計。因為特異引 物在變異基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物， 在野生型中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物， 用凝膠電泳能夠很容 易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，從而確定有無突變基因型。常用的結(jié)果分析方法：a）瓊脂糖凝膠電泳。b）聚丙烯酰胺凝膠電泳。主要特點：對實驗條件要求較低，操作簡單易行，成本低，重復(fù)性好，所 需DNA的量較少且對DNA質(zhì)量要求較低；但對引物設(shè)計要求較高，且僅能進(jìn)行 已知突變檢測。 多重 PCR（multiplex PCR）基本原理：多

45、重PCR在同一 PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時擴(kuò)增 出多個核酸片段的 PCR。常用的結(jié)果分析方法：毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis, CE又稱 高效毛細(xì)管電泳（high performanee capillary electrophoresis, HPCE:是利用離子 的電泳遷移率不同， 在電場中移動的速度不同， 從而將不同的離子分離。 高效 液相色譜層析（high performanee liquid chromatography, HPLCC :溶于流動相的各 組分在經(jīng)過固定相時， 與固定相發(fā)生作用 （吸附、分配、離子吸引、排阻、親和） 的大小、強(qiáng)弱

46、不同，導(dǎo)致在固定相中滯留的時間不同，由此判斷待測物。單鏈 構(gòu)型多態(tài)性分析 （ single-strand conformational polymorphism, SSCP ：是利用不同 空間構(gòu)型的DNA分子，在凝膠電泳中的泳動速率不同，從而區(qū)分變異的DNA分子。主要特點：多重PCR經(jīng)濟(jì)簡便，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時檢出，將 大大地節(jié)省時間， 且節(jié)約開支； 但特異性會有所降低， 且僅能進(jìn)行已知突變檢測。 長距離反向 PCR（ long distance inverse PCR, LD-IPCR）基本原理：根據(jù)已知的核心DNA去末端序列設(shè)計兩條引物，使兩引物 3'端 相互反向。擴(kuò)增前

47、先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成 一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段，從而獲得引 物外側(cè)的DNA片段。常用的結(jié)果分析方法：脈沖場凝膠電泳(PFGE):利用定時改變電場方 向的交變電源以分離大分子DNA。標(biāo)記寡核苷酸探針：針對待測基因設(shè)計相 應(yīng)的特異性標(biāo)記寡核苷酸探針， 使其在固相或液相中與擴(kuò)增產(chǎn)物反應(yīng)， 檢測相應(yīng) 的熒光信號即可判斷待測樣本的基因型。主要特點：LD-IPCR適用于較長序列的分析，且不需預(yù)知待分析序列的具 體結(jié)構(gòu)；但方法較為復(fù)雜，需要特殊儀器。 實時熒光定量 PCR( qPCR或real-time PCR)基本原理：實時熒光定量

48、PCR是指在PCR反應(yīng)中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)， 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加?；跈z 測PCR擴(kuò)增周期每個時間點上擴(kuò)增產(chǎn)物的量， 通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量，從 而實現(xiàn)對起始模板定性或定量檢測。根據(jù)使用的熒光標(biāo)記類型可分為探針類和非探針兩大類。非探針類是利用 非特異性的插入雙鏈DNA的熒光結(jié)合染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴(kuò)增的增 加。探針類則是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。 前者簡便 易行，而后者由于增加了探針的互補(bǔ)識別步驟，特異性更高。常用的特異性熒光探針及其特點： TaqMan探針：是目前臨床應(yīng)用最廣泛 的探針之一。 TaqMan 是一

49、類寡核苷酸探針，依據(jù)目標(biāo) DNA 序列的上游引物和 下游引物之間的序列配對來設(shè)計。探針的5'-端用報告熒光染料( reporterfluoresce nee dye, R)標(biāo)記，3'-端則標(biāo)記淬滅染料(que ncher dye, Q)。當(dāng)完整 的探針與目標(biāo)序列配對時， 5'-端報告熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3'-端的淬滅劑接近而被淬滅。但隨著 PCR 延伸， DNA 聚合酶的 5'-端外切酶活性將探針切開， 使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，報告基團(tuán)的熒光得以釋放而被檢測。TaqManMGB探針：是在TaqMan探針基礎(chǔ)上改進(jìn)而來的，其 3'端不是淬滅基

50、團(tuán)而是一 種非熒光淬滅劑，另外3'端還增加了一個小溝結(jié)合分子 MGB，該分子能夠結(jié)合 在雙鏈 DNA 小溝部位，從而使探針與模板緊密結(jié)合。 MGB 的存在提高了探針 的Tm值，一般12-17bp的探針在MGB的作用下Tm值可升高15-30C,從而使 它能夠分辨單個堿基的差別； 而且連在 MGB 分子后的是非熒光物質(zhì)的淬滅基團(tuán)， 因此這種探針具備更好的淬滅效果， 且具有無背景熒光、 熒光標(biāo)記靈活、 提高熒 光信號的信噪比等優(yōu)點。分子信標(biāo)(molecular beacor):是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙 標(biāo)記寡核苷酸探針， 位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)靠近。 不 存在模板時，探針呈莖

51、環(huán)結(jié)構(gòu)；存在模板時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開與模板配對，構(gòu)象改 變使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開， 釋放熒光。 分子信標(biāo)也有缺點， 即探針匹配的 是基因內(nèi)部序列，不一定在每個基因上都能找到長短適中且?guī)в心┒嘶匚慕Y(jié)構(gòu)的 序列，所以分子信標(biāo)的探針設(shè)計要求較高。該方法檢測的特異性高于TaqMan等線性探針，較適用于基因點突變的鑒定。蝎形探針：是一種雙分子實時熒光檢測體系，具有反應(yīng)迅速、熒光強(qiáng)度高、特異性好等優(yōu)點。該方法中引物與探針的 功能被綜合到同一段寡核苷酸序列上。 雙雜交探針： 該方法的特點是淬滅效率 高，特異性強(qiáng)，但由于兩個探針結(jié)合于模板上，故影響了擴(kuò)增效率。此外，探針 合成成本也相對較高。常用的非探針類熒光

52、標(biāo)記及其特點雙鏈 DNA 交聯(lián)熒光染料， 通常指 SYBRGreenl或LC Green TM I染料，SYBR Green I能結(jié)合到DNA雙螺旋到小溝。 在加入過量到 SYBR 熒光染料到 PCR 體系中， SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺氲疆a(chǎn)物的 DNA 雙鏈，發(fā)射熒光信號，而未摻入 DNA 鏈中的染料分子不會發(fā)射任 何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。由于它與 所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，不必因為模板不同而特別定制，因此設(shè)計的程序通用 性好，且價格相對較低。但是，內(nèi)嵌染料沒有序列特異性，可以結(jié)合到包括非特 異產(chǎn)物、引物二聚體、 單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物

53、上， 造成假陽性而影響 定量的精確性。高分辨熔解曲線分析 （high resolution melting, HRM ）及其特點是根據(jù) DNA 序列的長度、 GC 含量以及堿基互補(bǔ)性差異，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對樣品進(jìn) 行分析。高分辨熔解對 DNA 序列的識別能力主要由三個因素所決定：檢測儀器 的分辨率、雙鏈 DNA 嵌入型染料的種類和 PCR 產(chǎn)物的純度。其優(yōu)點是高通量、 快速、高靈敏度、閉管檢測以防止污染造成的假陽性， 但此方法對儀器要求較高。 PCR- 限制性片段長度多態(tài)性分析（ PCR-RFLP）基本原理：根據(jù) DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小， 判斷待測樣品

54、的基因特征。主要特點：簡便易行，但僅能識別位于酶切位置內(nèi)的突變，而且凝膠電泳 的結(jié)果僅能判斷產(chǎn)物的大概長度， 是非特異性的方法。 目前對同一病原體檢測時 應(yīng)用哪一種限制內(nèi)切酶仍沒有一致意見，因此質(zhì)量控制比較難實現(xiàn)。 PCR- 核酸序列分析技術(shù)San ger測序技術(shù)（雙脫氧鏈終止法）：是廣泛應(yīng)用的第一代DNA測序技術(shù) 的典型代表。通常情況下，要測序的 DNA 先進(jìn)行核酸擴(kuò)增， 之后進(jìn)行測序反應(yīng)。 測序反應(yīng)中除了加入4種正常的脫氧核苷三磷酸（dNTP）外，還加入一種少量 的2' ,3雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時，由于它沒有 3'-OH ，不能再與其它

55、的脫氧核苷酸形成 3' ,5-磷'酸二酯鍵， DNA 合成便在此 處終止，如果此處摻入的是一個ddATP,則新生鏈的末端就是A，依次類推可以 通過摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，則新生鏈的末端為 T、C或G。Sanger 測序技術(shù)可以獲得未知待分析序列的具體結(jié)構(gòu)，是確定基因序列的 金標(biāo)準(zhǔn)，但它的準(zhǔn)確率仍然無法達(dá)到100%,大約2%的堿基無法被San ger法測 序所識別。因為通量的緣故，它在大基因和多基因的檢測方面效率很低。焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencin ：是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的 酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。當(dāng)引物與模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶

56、 (DNA polymerase) ATP 硫酸化酶(ATP sulfurytase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸 腺苷雙磷酸酶(Apyrase) 4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與 一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來， 通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度， 達(dá)到實時測定 DNA 序列的目的。焦磷酸測序技術(shù)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，其重復(fù)性和精確性可與 San ger測序相媲美，而測序速度則大大提高，非常適合對已知的短序列進(jìn)行測序 分析；但對未知序列分析上，該方法的測序長度明顯短于San ger法。高通量測序技術(shù)：又稱 “下一代 ”測序技術(shù)( "Next-genera

57、tion" sequencing techno logy, NGS)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。 不同廠家的產(chǎn)品測序原理不同， 主要分為邊合成邊測序(Sequencing by synthesi§SBS)、基于 “DNA簇”和 可逆性末端終結(jié)(Reversible Terminator)大規(guī)模平行測序、4色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)測序和半 導(dǎo)體芯片測序。與San ger測序技術(shù)相比，新一代測序平臺最大的變化是無需克隆這一繁瑣的過程，而是使用接頭進(jìn)行高通量的并行 PCR、測序反應(yīng)，并結(jié)合微流體技術(shù),利用高性能的計算機(jī)對大規(guī)模的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和分析。 接頭的運(yùn)用， 使得高 通量測序技術(shù)不再局限于單純的基因組測序， 而是作為一個平臺， 可以開展全基 因表達(dá)圖譜分析、SNP、小RNA、ChIP、DNA甲基化等諸多研究。目前尚未在 臨床廣泛應(yīng)用。PCR-基因芯片技術(shù)基本原理：又稱微列陣技術(shù)， 是一種大規(guī)模集成的固相雜交 （反向點雜交）， 即依據(jù) DNA 雙鏈堿基互補(bǔ)配對、變性和復(fù)性的原理，以大量已知序列的寡核苷 酸、 cDNA 或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，分析得出待 測樣品的基