04冷凍干燥保護劑

1、04冷凍干燥保護劑凍干保護劑一、凍干損傷機理 :蛋白質(zhì)冷凍干燥全過程分為預凍、第一階段升華干燥和第二階段再干燥。預凍 過程中水結(jié)冰時體積增大，致使活性物質(zhì)活性部位中一些由弱分子力鍵連接的鍵遭 到破壞，從而使活性損失 ; 另外，水結(jié)冰后引起溶質(zhì)濃度上升以及由于各種溶質(zhì)在 不同溫度條件下溶解度變化不一致而引起 pH 值的變化，導致活性物質(zhì)所處的環(huán)境 發(fā)生變化而造成失活或變性。二、凍干保護作用機理 :第一，“水替代假說” : 認為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵，結(jié)合水通過氫 鍵與蛋白質(zhì)分子聯(lián)結(jié)。當?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過程中失去水分后，蛋白的主相變溫度 會升高，發(fā)生變性。但某些糖類屬于親水性物質(zhì)，形成氫鍵能

2、力較強，能替代蛋白 表面的水的羥基，與蛋白質(zhì)中的極性基團形成氫鍵，使得蛋白的主相變溫度變化不 大，低于操作溫度，從而避免了生物活性物質(zhì)由于發(fā)生相變所造成的機械損傷。能 夠直接測量到凍干的蛋白質(zhì)與保護劑蔗糖間的氫鍵。第二，“玻璃態(tài)假說” : 認為在含糖溶液的干燥過程中，糖 -水混合物會玻璃 化，兼有固體和流體的行為，粘度極高，不容易形成結(jié)晶 ; 且分子擴散系數(shù)很低， 因而具有粘性的保護劑包圍在蛋白質(zhì)分子的周圍，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰 相似的碳水化合物玻璃體，使大分子物質(zhì)的鏈鍛運動受阻，阻止蛋白質(zhì)的伸展和沉 淀，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護作用。研究表明，單糖、雙糖、多羥基化合

3、物以及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、酶都能顯示玻璃行 為，只是玻璃化轉(zhuǎn)變溫度不同而已。由于某些糖的玻璃化溫度較高，在較高的保存 溫度下，仍能在蛋白質(zhì)分子附近形成玻璃態(tài)。 （ 大于玻璃化溫度就不形成玻璃態(tài)了 ）一般說來，如工作溫度低于保護劑的玻璃化溫度，高于被保護的活性物質(zhì)的主 相變溫度，那么該活性物質(zhì)就能有效地保持活性。但在目前，這兩種假說還不能完 全解釋現(xiàn)有的實驗現(xiàn)象。三、凍干保護劑的選擇 :凍干保護劑需要具備四個特性 : 玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高、吸水性差、結(jié)晶率低和不含還原基。 常用的保護劑有如下幾類物質(zhì) :1.糖類/多元醇: 蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等 ; 其中，葡 萄糖、乳糖具有還原性，而蔗

4、糖、海藻糖、葡聚糖沒有還原性。2. 聚合物:HES PVR PEG 葡聚糖、白蛋白等；3. 無水溶劑：乙烯乙二醇、甘油、DMSO DMF 等;4. 表面活性劑：Tween 80 等；5. 氨基酸 :L- 絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等 ;6. 鹽和胺 : 磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等 ;具體分類 :（ 一 ） 按相對分子量分1. 低分子化合物 低分子化合物可提高微生物存活率，形成均一懸液，起到水 分緩解作用。如 : 酸性物質(zhì) : 谷氨酸、天冬氨酸、乳酸 ;中性物質(zhì) : 葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇 D;堿性物質(zhì) : 精氨酸、組氨酸。2. 高分子化合物 高分子化合物對微生物有保護

5、作用，可促進其升華形成耐熱 骨架阻斷熱傳導和熱輻射。如 : 白蛋白、明膠、蛋白胨、脫脂奶粉。明膠 水解明膠可去掉雜質(zhì)蛋白、無抗原性、無過敏反應(yīng)、無熱源，并且分子 量小、均質(zhì)、易溶于水，可過濾除菌，共熔點為 ,12? 。對微生物的保護作用高出普 通明膠 10,以上。脫脂奶粉 可促進升華、加熱滅菌，易取得均質(zhì)產(chǎn)品，并擴大細胞相互間的距離。 （ 二） 按功能和性質(zhì)分1. 耐熱凍干保護劑 耐熱凍干保護劑在凍結(jié)和干燥過程中，可防止活性組分變性，如海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯酮（PVP）等。2. 填充劑 可防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，如 : 甘露醇、明膠等。 3. 抗氧化劑 產(chǎn)品的自身氧化可消耗凍干樣品

6、內(nèi)部和環(huán)境中的氧 ; 放入電子或氫離子， 可阻斷凍干樣品中氧化鏈式反應(yīng)，抑制氧化酶活性，防止樣品在冷凍干燥及儲藏過 程中氧化變質(zhì)。如，硫代硫酸鈉、維生素 E、維生素 C 等。4.酸堿調(diào)整劑在冷凍干燥、儲藏過程中，將生物制品 PH 值調(diào)整到活性物質(zhì)最 穩(wěn)定區(qū)域。常用的有 : 磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉。（ 三） 按物質(zhì)的種類分1. 糖/多元醇類 單糖（葡萄糖、半乳糖 ）: 糖與生物制品活性組分的分子形成氫 鍵而代替了原有水的位置，起保護作用 ;低聚糖（蔗糖、海藻糖 ）: 低聚糖能起到低溫保護功能和脫水保護作用 ;海藻糖則 具有相對較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。海藻糖蛋白質(zhì)水微冰晶的形成，有效防 止了水對玻璃化

7、態(tài)的增塑作用。并且其內(nèi)部氫鍵較少，有利于蛋白質(zhì)分子間形成氫 鍵。多元醇（甘露醇、山梨醇、丙三醇 ）: 多元醇具有和糖一樣的作用。甘露醇無菌 濾液穩(wěn)定，不易被氧化，可提供支持結(jié)構(gòu)，并且不與活性組分發(fā)生反應(yīng) ; 山梨醇是 甘露醇的同分異構(gòu)體，但其溶液度比甘露醇大，在常溫下呈粘稠的透明狀液體，有 旋光性，略有甜味，具有吸濕性，高溫下不穩(wěn)定，在冷凍干燥配方中，山梨醇常用 作填充劑。2. 表面活性劑類 表面活性劑是降低界面的張力，親水、親油基組成的化合 物。表面活性劑可分為離子型、非離子型。凡是溶于水能電離成離子的，稱為離子 型表面活性劑，否則稱為非離子型表面活性劑。表面活性劑在凍結(jié)和脫水過程中既 能降

8、低冰、水界面張力所引起的凍結(jié)和脫水變形，又能在復水過程中對活性組分起 到潤濕劑和重皺褶劑的作用。但在凍干生物制品測定和長期儲藏中，表面活性劑并 沒有保護作用。3. 氨基酸類 氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單位，其中最主要的是 a- 氨基酸。常 用的氨基酸類保護劑有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和組氨酸，試驗表明氨基酸是最好 的填充劑。低濃度甘氨酸可通過抑制 10 或 100mmol/L 磷酸緩沖鹽結(jié)晶，所致 PH 值的改變而阻止蛋白質(zhì)藥物變性，并且能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起 的蛋白質(zhì)藥物的破壞。4. 其它添加劑類 其它添加劑類保護劑包括抗氧化劑、緩沖 劑和凍干加速劑。 抗氧化劑 :一種是抗氧化劑

9、的自身氧化，消耗凍干樣品內(nèi)部和環(huán) 境中的氧，使凍干樣品物料不被氧化 ; 另一種是抗氧化劑給出電子或氫離子，阻斷 凍干樣品中的氧化鏈式反應(yīng) ; 還有一種方式是抗氧化劑通過抑制氧化鎂的活性而防 止凍干樣品的氧化變質(zhì)，如維生素 E、維生素 C 硫代硫酸鈉、硫脲。緩沖劑: 蛋白質(zhì)具有兩性電解質(zhì)，既能和酸作用又能和堿作用。在中性環(huán)境 中，大多數(shù)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，由于蛋白質(zhì)溶液在凍結(jié)過程中溶液的濃度是逐漸升高 的，所以在高濃度時可改變?nèi)芤旱?PH 值，PH 值變化 4 個單位導致蛋白質(zhì)變性，使 生物制品失活。因此在凍干保護劑配方中，需添加適量緩沖劑。如，磷酸二氫鉀、 磷酸二氫鈉。凍干加速劑 : 冷凍干燥過程耗時長、耗能多，迫切需要對凍干循環(huán)進行優(yōu)化， 降低生產(chǎn)