完整版目的基因到工程菌的構(gòu)建

1、目的基因到工程菌的構(gòu)建1基因工程的誕生1972年，美國斯坦福大學(xué)的學(xué)者首先在體外進行了 DNA改造的研究， 他們把SV40 （一種猴病毒）的DNA分別切割，又將兩者連接在一起， 成功構(gòu)建了第一個體外重組的人工 DNA分子。1973年，Cohen等人首次 在體外將重組的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，成功地進行了無性繁殖，從 而完成了 DNA體外重組和擴增的全過程。在這個的基礎(chǔ)上，基因工程誕 生了。FIGURE 1 3 . A Hertxerf Boyer left) and Stanley Cokert. fUc*。=。等/ oFBayer 口cd Sianl&y CohenSV40病毒(0

2、/1)Ori grin of DMA r&plic<3tioru3 HODNA聚合酶 連接酶 外切酶ni VVAVSAAAA5, OP HO3 dT ,% (dTOP 5， n末端轉(zhuǎn)移酶dATP或何 以5r POwaaaa/'OH 3OP51或dTdT/vwva/OH 3'3，HO'Aaaaa/OP 5，n退火 dA 3OH PO5WWWVAAAAAAA/WV* 5f OP HO3y dTdA 3' OH PO5'-AAAAA/WWW第一個重組體的構(gòu)建1.1 基因工程技術(shù)的三大理論基礎(chǔ)一是20世紀(jì)40年代Avery等人通過肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實驗

3、證明了生物 的遺傳物質(zhì)是DNA,而且證明了通過 DNA可以把一個細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)移 給另一個細(xì)菌。二是20世紀(jì)50年代Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了 DNA分子的 雙螺旋結(jié)構(gòu)及DNA的半保留復(fù)制機理。三是20世紀(jì)60年代關(guān)于遺傳信 息中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按 DNA- RN牛蛋白質(zhì)的方向進行傳遞的1.2 基因工程技術(shù)的三大技術(shù)基礎(chǔ)三大基本技術(shù)問題：一是如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需的基因片段切割下來；二是如何將切割下來的DNA片段進行繁殖擴增； 三是如何將所獲得的基因片段重新連接。20世紀(jì)70年代，由Smith等人 發(fā)現(xiàn)的核酸限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和可以作為基因工程載體

4、的細(xì)菌 質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，解決了上述三大問題。1.2.1 限制性核酸內(nèi)切酶來源多數(shù)來自原核生效作用特點作用結(jié)果作用實質(zhì)形成黏性末端或平末端使特定部位的兩個核昔酸之間的磷酸二酯鍵斷開只能識別和切割DNA分子中一 小段特殊的核昔酸序列限制性內(nèi)切酶不切割自身DNA是因為原核生物中不存在酶的識別序列或 識別序列已經(jīng)被修飾1.2.2 DNA連接酶作用實質(zhì)：將具有末端堿基互補的 2個DNA片段連接在一起，形成 重組DNA分子，其起作用時不需要模板。1.2.3 基因工程的載體-質(zhì)粒基因載體的作用是運載目的基因進入宿主細(xì)胞，使之能得到復(fù)制和進行表達(dá)。也就是說，離開染色體的外源 DNA不能復(fù)制，而而插入復(fù)制子 DNA

5、的外源DNA可作為復(fù)制子的一部分在受體菌中進行復(fù)制，這種復(fù)制子 是外源基因的載體。止匕外，為滿足其使命，還必須具備如下一些特 性：能在宿主細(xì)胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的 DNA自我復(fù)制，在其DNA插 入外源基因后，仍然保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。易于從宿主細(xì)胞 中分離，并進行純化。載體 DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點， 并位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點上插入外源DNA,但不影響載體自身DNA的復(fù)制。某些病毒載體在外源 DNA插入后變成缺 損性病毒株，只能在有輔助存在時才能進行正常增殖。 具有能夠觀察的 表型特征（有報告基因），在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組 DNA選擇標(biāo)志

6、。1.3 基因工程的基本過程因：叫 的本堤體:流曰國1.4 基因工程的應(yīng)用bacteriumBadendl Plasmid chrDmosume©Plasmid isolatedRecombinarii DNA (plasmid)intetest® Gene inserted into plasmidCell containing genF ofDNA Fldsmid put intobacttjh5l ceHRecombinant bactiariumGene for pest resistance inserted into plant(ne uicd Lu alter

7、 bacteria for deafiin up toxic waste Ccll5 dorwd with也ntEin dissolves blood dots inheirta 墉& thempy2目的基因的獲取基因工程訂是通過人工方法分離、改造、擴增并表達(dá)生物的特定基因,從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價值的基因產(chǎn)物。 通常我們把插入供體細(xì)胞中NU甌制的許多DNJLfr段卜入運體產(chǎn)入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性伏目擒因到載體內(nèi)那個特定的片段基因稱為“外源基因”，而將那些已被或者準(zhǔn)備 要被分離、改造、擴增或表達(dá)的特定基因或 DNA片段稱為“目的基因”。來源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程藥物的基因是

8、不能直接進行分離的。真核細(xì)胞中單拷貝基因只是染色體DNA中很小的一部分，為其 10-5-I。-7,即使多拷貝基因也只有其10-5,因此從染色體中直接分離純化目的 基因極為困難。另外，真核基因內(nèi)一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為 表達(dá)系統(tǒng)，即便分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA也不能加工、拼接成為成熟的 mRNA, 因此不能直接克隆真核基因，必須采用特殊方法分離目的基因。目的基因的獲取大致可以分為三類：一是利用 PCR技術(shù)甚至化學(xué)合成 法體外直接合成目的基因，然后將之克隆、表達(dá)；二是構(gòu)建感興趣的生物 個體的基因組文庫或者cDNA文庫，即將某生物體的

9、全基因組分段克隆， 然后建立合適的篩選模型從文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；三是近年來發(fā)展的利用基因差異表達(dá)獲取目的基因 的技術(shù)。2.1 直接分離法（鳥槍法）直接從生物細(xì)胞基因組中獲取目的基因最常用的方法是“鳥槍法”，又稱“散彈槍法” 其是將供體生物的DNA用限制酶切割為許多 片段，再用運載體將這些片段都運載到受體 生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個細(xì)胞獲得 了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。優(yōu)點是速度快，簡單易行，成本較低，并能獲得與天然基因組DNA 一樣的有內(nèi)含子的真核基因DNA 片

10、段。2.2 逆轉(zhuǎn)錄法（cDNA 法）逆轉(zhuǎn)錄法合成DNA 是人工模擬自然界某些生物的反轉(zhuǎn)錄過程。主要用于分子量較大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA 為模板，以dNTP為底物，酶催化按5/-3/方向合成一條與RNA模板互補的 DNA 單鏈（ cDNA） ，它與 RNA 模板形成RNA 與 DNA 的雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下水解掉RNA 鏈， 再以 cDNA 為模板合成第二條DNA 鏈。至此，由RNA 指導(dǎo)的 DNA 合成過程完成。新弓I的長出mJ叁fit與力釣H *1.平卜3.工行*1白勺OMA Z R迸分嵇n。弓物也火奴村分戶并引物理伸訪訃2.3反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（P

11、CR法）該法是將mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄全成cDNA的第一鏈，不需再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物的協(xié)助下，用PCR法進行擴增，特異地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。常用于含其極微量mRNA的細(xì)胞皿加皿in職靖模板 DNAUMeT變性復(fù)引物結(jié)合到互樸DNA修帆從玉蝴超蛤互樸彼的合成延伸IE1-0汽沿反應(yīng)厚理示意882.3.1 cDNA 文庫cDNA文庫是將生物特定的組織器官或特定發(fā)育時期的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表 達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本。原理是將帶 poly (A)的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p 鏈DNA ,再與原核載體連接。cDNA文庫的構(gòu)建：逆

12、轉(zhuǎn)錄酶 核酸酶HDNA聚合酶與載體連接該生物導(dǎo)人受體菌群NA文庫mRNA雜交雙鏈單鏈D、A雙鏈1NA(CDNA) cDN琳一鏈的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDN斕一鏈 cDNA第二鏈的合成自身引導(dǎo)合成法：單鏈cDNA的3'端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引 物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第 二鏈.此法存在的缺點是在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo) 致對應(yīng)于mRNA 5'端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排.OM"IOk AC Min*匕AAA<AL;井井。|>制人t ehna®r>

13、 以*木鄭TUNACSATR dTTH dGTP ctCTP置換合成法：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA: mRNA雜交體作為切口平移 的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列 RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈.此 法的優(yōu)點是：合成cDNA的效率高；直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需 純化；避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA。幅結(jié)構(gòu)5,T叱Hl AAA(A)ndATP dTTP RNAflfiH dGTP 大JK桿菌口 NA聚合酶5,3poly(A >TdCTP；V < WW/WWWX/WWW/W/ T 12 IB 5，X/X

14、7; /X/X/V» /s»Iq,Hl殘存的eRna作為合成。DN A第二隹的引物5,3*-WWV> *X/X/WXz> /v/V>5'T 1?-ia3，5'3'T4際菌體ONA連接曲雙婕cDNA5 Tin-，日引物-銜接頭法Okayama-Berg法合成并克隆雙鏈cDNAPvullJI段IITTTT !J;用 I。 mldMAiH 火Hpa I岫牝Bind inT1"喋熱后整時(Hi ijco (df >Pvij IIHi nd IIIiPrat IrnkNAAlAAAA p1TTTTTT- clAlP dCIP

15、(K3TP dl IPHind IHPut I dBell P"t IICCCCCC、 i|IIIbrid III小煙也稱胸 I i|4O CdC)PvlfMAAAAAA -=TTTf 11Hi nd Bill一ccnnccQ3GGQG IHi nd IIILm grggggHind III聯(lián)冰燉化Hi nd IIIccccccPvull MAMA . TTTTTT 以堂QI iso與小口 t 5”11ynNA建火p再以大喊桿?！癗八江投岫進桁好牝代NMflfaHAF牌外 nhltNAWAflhtAHiH tVtlJNAil!k*> 4司君植N解潢假GG(i(JtiC.、

16、63;A AAA A A -JTTTTTT . 雙鏈cDNA分子的克隆同聚物加尾法：利用小牛胸腺末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈 cDNA和質(zhì)粒載體的3,端都加上一個互補的同聚片段， 通過退火使兩個片段連接成重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞RNAlami* 口 fd”的 川立 fj/AcDNAHAaaAAAA言成eOM第二錯ACGTCPat ICT DC AA A *A A* A11VVIWWWWWIWWV' T T T T T T T未J®格拓加dE殘舉r *班情博博EyGJHi整* wata ac<5 fc .A A A A A A AC CC C CCCCQGCC

17、 BWWWwVwWWWvi TTTTTTT科化"心中MA L時*LJ為京+崎W) I*.從而&，:如阿，/h11忖總接頭-銜接頭法mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，將dA殘基加到mRNA : cDNA雜交體上，然后與帶dT尾的克隆載體連接，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，在宿 主細(xì)胞內(nèi)，mRNA被降解并代之以 DNA.缺點：克隆的效率低（為雙鏈 cDNA克隆的1/10） cDNA文庫的篩選和鑒定核酸雜交1）同源探針；至少含有所需cDNA克隆的一部分確切序列.常用于以一 個部分克隆分離cDNA文庫中的全長克隆.2）部分同源探針：探針的序列與所要篩選

18、的 cDNA克隆的序列相關(guān)但 不相同.常用于克隆家族基因.3）總cDNA探針：通過反轉(zhuǎn)錄酶均勻摻入放射性核甘酸或通過總的或分級分離得到的poly(A)+ mRNA 進行末端標(biāo)記而獲得cDNA 探針 .4) cDNA 扣除探針 : 從第一種mRNA 制備 cDNA 探針 , 連續(xù)多次與20 倍過量的第二種mRNA 雜交 ; 回收未雜交的cDNA 探針 , 再與 100倍過量的第一種mRNA 雜交 , 使得原 mRNA 中的一些特異序列得到高度富集.特異性免疫學(xué)檢測:在 cDNA 表達(dá)文庫中，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能與特異性抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，通過酶學(xué)的方法加以檢測. cDNA 克隆的同胞檢測:將 c

19、DNA 文庫分成若干組含有10-100個克隆子的易于處理的cDNA 文庫，對每組cDNA 文庫進行檢測，當(dāng)鑒定出陽性庫后再不斷將其分成更細(xì)的庫進行檢測，直到獲得陽性單克隆. cDNA 克隆的確證:cDNA 克隆含有編碼某一特定蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列的開放讀框.1.1.2 基因組文庫基因組文庫或簡稱基因文庫，其是將某一生物基因組DNA 片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。通過構(gòu)建基因文庫可以貯存和擴增特定生物基因工程組的全部或部分片段，同時又能夠在需要時從基因文庫中調(diào)出其中的任何DNA 片段或目的基因。理想的基因組文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕從文庫中篩選目標(biāo)克隆的工

20、作量。克隆片段大于研究基因的平均片段，以便于從同一克隆中獲得完全的單一基因。含有相鄰 DNA片段的獨立克隆間，部分序列重疊的大小合理，一方面利于基因文庫各克隆建立疊連群，進行染色體步查；另一方面，又不重疊過多，使步查效率低下?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下且最好不帶有任何載體序列。重組克隆應(yīng)能穩(wěn)定保存、擴增及篩選。該生物基因組文庫基因組文庫的構(gòu)建：提取某生物全部DNA用適當(dāng) 許多與載體連接限制.切割| DNA,段導(dǎo)入受體菌群 細(xì)胞染色體大分子 DNA的提取和大片段的制備；載體DNA的制備；載體與外源大片段連接；體外包裝及基因組 DNA文庫的擴增；重組DNA的篩選和鑒定。?表型篩選法：表達(dá)性狀

21、易于鑒別，如互補篩選?抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲節(jié)二氨喀咤降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長?分子雜交法：利用分子探針對文庫進行篩選?免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進行原位雜交篩選? PCR篩選法：根據(jù)保守序列合成引物，擴增特異性片段1.1.3 cDNA文庫和基因組文庫的區(qū)別時效性：cDNA文庫代表某一時期特定細(xì)胞或組織中 mRAN ,是轉(zhuǎn)錄水 平，僅反映某一時期特定組織表達(dá)的功能基因， 不是全部基因；而基因組 文庫包含該生物所有基因。序列組成不：cDNA文庫無間隔序列和調(diào)控區(qū)等非編碼區(qū)；基因組文庫可真實顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息，由于制備DNA片段的切點是隨機的，所以每一克隆內(nèi)所含

22、的DNA片段既可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序。兩種文庫均有應(yīng)用，如何選擇：根據(jù)試驗?zāi)康?，在分離植物 RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分離植物特定發(fā)育階段或特特異表達(dá) 的基因時應(yīng)用cDNA文庫；在研究mRNA不存在的序列及基因組作圖時 必須構(gòu)建基因組文庫。2.4 化學(xué)合成法蛋白質(zhì)的氨 推 niRAX 推 基因dna的 合 目的 基酸順序測核甘酸序列測核甘酸序列成 基因該方法有個先決條件就是必須已知其核昔酸順序，或者已知其蛋白質(zhì)的氨基酸順序，DNA合成儀再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出 DNA的核甘酸序 列。用化學(xué)合成此基因DNA不同部位的兩

23、條 鏈的寡核甘酸短片段，再退火成為兩端形成 黏性末端的DNA雙鏈片段。然后將這些 DNA片段按正確的次序進行退 火連接起來形成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。常用 于較小分子蛋白質(zhì)或多肽的合成2.5 物理化學(xué)方法其原理是從幾個方面來利用核酸 DNA雙螺旋之間存在著堿基 G和C配對，T和A配對的這些特性，從而分離目的基因的目的。2.5.1 密謀梯度離心法液體在離心時，其密度隨轉(zhuǎn)軸距離而增加。堿基GC配對的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術(shù)可使切割適當(dāng)片段的不同 DNA按密度大小公布開來。進而通過與某種放射性標(biāo)志的 mRNA雜交來 檢驗，分離相應(yīng)的基因。2.5.2

24、單鏈酶法堿基GC配對之間有三個氫鍵，比 AT配對的穩(wěn)定性高，當(dāng)用加熱或 其他變性試劑處理DNA時，雙鏈上AT配對較多的部位先變成單鏈，應(yīng) 用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，殖民地經(jīng)氯化艷超速離心，獲得無單 鏈切口的DNA。2.5.3 分子雜交法單鏈DNA與其互補的序列總有“配對成雙”的傾向，這就是分子雜 交的原理。其既可以分離，也可以鑒別某一基因。3基因與載體的連接（以質(zhì)粒為例）3.1 質(zhì)粒的提取通過加入SDS （十二烷基硫酸鈉） 對宿主細(xì)胞進行裂解，使質(zhì)粒DNA順 利溢出并與染色體DNA和蛋白質(zhì)等 分離。其中，微量堿變性法提取質(zhì)粒 具有簡單快速、經(jīng)濟實惠優(yōu)點，是當(dāng) 前分子生物學(xué)及基因工程研究工

25、作中 最常用的一種純化質(zhì)粒DNA的方法。當(dāng)然，也可以采用試劑盒進行，目前，商品化產(chǎn)品很多，其基本原理大多 是基于堿裂解法結(jié)合硅膠模等微型離心純化柱。3.2 質(zhì)粒載體的構(gòu)建天然質(zhì)粒往往存在這樣或那樣的缺陷，不適合直接用作克隆載體，需要進行人工改造，這些改造主要有以下幾方面：（ 1）選擇合適的復(fù)制起始位點。為了使構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體能在受體細(xì)胞中進行有效復(fù)制，且獲得足夠數(shù)量的拷貝數(shù)，需要改變復(fù)制起始位點，一般選擇組裝松散型質(zhì)粒復(fù)制起始位點。（ 2）加入合適的選擇標(biāo)記基因。為了便于重組子篩選，需要在質(zhì)?？寺≥d體上加入合適的標(biāo)記基因，主要有l(wèi)acZ 和抗生素抗性基因，前者用于克隆子藍(lán)、白斑篩選；當(dāng)外源D

26、NA 片段插入到克隆位點后，可導(dǎo)致抗生素抗性基因失活。（ 3）增加或減少酶切位點。質(zhì)粒載體利用限制性內(nèi)切酶識別位點來作為外源 DNA 片段插入的克隆位點，這種位點必須是單一酶切位點，而且數(shù)量越多越便于多種類型末端的DNA 插入。 可通過刪除天然質(zhì)粒中的部分重復(fù)的限制性內(nèi)切酶識別位點使之成為單一的酶切位點，可通過增加新的單一限制性內(nèi)切酶位點在特定的部位組裝一個含有多種單一限制性內(nèi)切酶識別序列的多克隆位點（MCS） 。（ 4）縮短長度。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的效率同質(zhì)粒DNA 分子大小相關(guān)，小分子質(zhì)量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率較高?？赏ㄟ^切去質(zhì)粒上不必要的片段，提高轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的效率，提高其外源DNA 片段的裝載量。

27、3.3 目的基因與載體的連接用一定的限制性酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端；再用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量的 DNA連接酶，形成一個重組的DNA分子（重組質(zhì)粒）。4 重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建工程菌生物種類細(xì)胞植物細(xì)胞體細(xì)胞將目的基因插 入Ti質(zhì)粒的DNA動物細(xì)胞微生物細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程上f農(nóng)桿菌將含有目的基因的表達(dá)載體提純f取卵便導(dǎo)入植物細(xì)胞 f整合到受體 細(xì)胞的DNA上f表達(dá)精卵）f顯微注射一受精卵發(fā) 育f獲得具有 新性狀的動物氯化鈣處理 細(xì)菌細(xì)胞f 細(xì)菌細(xì)胞壁 的通透性增 加f重組質(zhì) 粒進入宿主 細(xì)胞

28、4.1 受體細(xì)胞的選擇常用的宿主細(xì)胞有如下幾種： DH5y 用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的P-半乳糖甘酶氨基端實現(xiàn)a互補。HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高。JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌。JM109:支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌。MZ-1:溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體PL啟動子質(zhì)粒載體的宿主菌。4.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞常用方法有轉(zhuǎn)化法；轉(zhuǎn)導(dǎo)法；轉(zhuǎn)染法。5篩選含有目的基因的受體細(xì)胞原理：質(zhì)粒上的抗生素的抗性基因方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選接種篩選所有受體細(xì)胞A四環(huán)素培養(yǎng)基生活的受體細(xì)胞導(dǎo)入

29、.培養(yǎng)重組DNA分子 _ 含重組DNA分子的受體細(xì)胞1.1 工程菌篩選方法1.1.1 載體表型選擇法載體表型選擇法是根據(jù)載體分子所提供的表性特征，直接選擇重組DNA分子的方法，主要包括： 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒是分子克隆中最常用的一種載體分子，編碼有 tetr ampr 使帶有該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞能在含有四環(huán)素或氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)基中生長。具體做法：將此轉(zhuǎn)化菌先涂布在含有氨節(jié)青霉素的平板上，并將存活的菌落原位影印到另一個含有四環(huán)素的夾板上，凡是在氨節(jié)青霉素平板上生 長，而在四環(huán)素夾板上不生長的菌落上就可能是已經(jīng)獲得了這種重組體質(zhì) 粒的轉(zhuǎn)化子克隆。8 -半乳糖甘酶顯色反應(yīng)選擇法除了抗生素抗性篩選之外，質(zhì)粒等載體上常用的另一種篩選標(biāo)志是（3-半乳糖甘酶顯色反應(yīng)。當(dāng)外源 DNA插入到載體lacZ上，導(dǎo)致B -半乳糖 甘酶基因失活，可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落再添加由 X-gal-IPTG培養(yǎng)基 中的著色變化直接觀察出來。1.1.2 根據(jù)插入基因的表型選擇法其基本原理是：轉(zhuǎn)化進來的外源 DNA編碼的蛋白，能夠?qū)Υ竽c桿菌 宿主菌株所具有突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補效應(yīng)， 從而使被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。這種篩選法受到一定的條件限制，他不但要求克隆的D