第九章核酸(無圖)

1、Chapter IX 核 酸 (Nucleic Acid) 主要介紹堿基、核苷、核苷酸和核酸的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能，核酸的分離、提純、鑒定等。核酸英文名nucleic acid（NA） 1868年瑞士F. Miescher（米歇爾）發(fā)現(xiàn)了核酸。一、核酸的發(fā)現(xiàn) 核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物。 核蛋白 磷酸 核苷 堿基 戊糖 蛋白質(zhì) 核酸核苷酸 （一）類別 nucleic acid ribonucleic acid, RNA deoxyribonucleic acid, DNA （二）生物學(xué)作用 二、核酸的類別和生物學(xué)作用一堿基（base）：又稱含氮堿 1.

2、嘧啶堿（pyrimidine, Py） 第一節(jié) 核酸的組成2.嘌呤堿（purine, Pu） 其它嘌呤（核酸的代謝產(chǎn)物）：黃嘌呤、次黃嘌呤、尿酸等 3.修飾堿基（修飾堿基（modified base）：）： 也稱稀有堿基（也稱稀有堿基（minor base） OHOH2CHOHHOHOHHHOHOH2CHOHHHOHHHOHOH2CHOHHOCH3OHHH-D-核糖-D-2-脫氧核糖-D-2-O-甲基核糖二戊糖（pentose）（一）核苷（nucleoside） 1核苷的結(jié)構(gòu) 核苷：含N苷，-苷 OHOH2CHHHbaseHOHOH三、核苷、核苷酸核苷中戊糖與堿基的連接方式：核苷中戊糖與堿基的

3、連接方式： OHOH2CHHHHOHOHNNNNNH291 腺嘌呤核苷 （adenosine）胞嘧啶脫氧核苷 （deoxycytidne）OHOH2CHHHHOHHN1NONH21核苷核苷 核糖核苷（核苷）：核糖核苷（核苷）：A、G、C、U 脫氧核糖核苷（脫氧核苷）：脫氧核糖核苷（脫氧核苷）：dA、dG、dC、dT 命名，簡寫符號命名，簡寫符號 天然核苷：一般為反式構(gòu)象天然核苷：一般為反式構(gòu)象 2修飾核苷（modified nucleoside）： 也稱稀有核苷（minor nucleoside） 修飾核苷包括三種情況: （1）由修飾堿基和糖組成的核苷 （2）由非修飾堿基和2-O-甲基核糖組成

4、的核苷 （3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷 NNNNNHCH3dRN6-Methyl-dA（1）HNNHO5,6-dihydrouridineORHHH(D or hU)（2）OCH2HHOHHOCH3HHO2-O-甲基腺苷Ade(Am)NNCH3NH25-Methyl-dCOdR（3）OCH2HHOHHOHHHO (pseudouridine)HNNHOO51假尿嘧啶核苷()修飾核苷的簡寫符號 少數(shù)修飾核苷用單字符號如D、I；但大多數(shù)修飾核苷是將堿基取代基、取代位置和取代數(shù)目寫在核苷單字符號的左邊，用小寫英文字母代表取代基。 m N22取代位置核苷取代基的數(shù)目取代基注意：注意：例例: 2-O

5、-甲基腺苷甲基腺苷 Am 含修飾核糖的核苷即含修飾核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，在甲基核苷的表示方法，在核苷符號的右下方注上一個小寫核苷符號的右下方注上一個小寫m。（二）核苷酸（nucleotide, Nt） 核苷酸的結(jié)構(gòu) （1）（核糖）核苷酸（ribonucleotide）： 2，3，5一核糖核苷酸一核糖核苷酸(2 -AMP)(3 -AMP)(5 -AMP)3，5一脫氧核糖核苷酸一脫氧核糖核苷酸Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP)Deoxyadenosine 5- monphosphate (5- dAMP)（2）脫氧（核糖）核苷酸（）脫

6、氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）：）：一、DNA的一級結(jié)構(gòu) 1DNA分子中核苷酸的連接方式分子中核苷酸的連接方式 第二節(jié)第二節(jié) 脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）53簡寫方法：線條式、文字式簡寫方法：線條式、文字式 英國Sanger 1975年加減法，1977年末端終止法 美國Maxam和Gilbert 1977年化學(xué)斷裂法 二DNA分子中核苷酸的排列順序酶法（雙脫氧法、末端終止法）酶法（雙脫氧法、末端終止法）1提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù) （1）x-光衍射分析 20世紀(jì)40年代Astbury 1952年M.Wilki

7、ns 三、DNA的二級結(jié)構(gòu) （2）DNA堿基組成的定量分析堿基組成的定量分析 20世紀(jì)世紀(jì)40年代年代chargaff規(guī)則規(guī)則 DNA堿基組成有種的特異性，但沒有組織、器官特異性。堿基組成有種的特異性，但沒有組織、器官特異性。 A=T；G=C；A+G=T+C 2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double-helical structure） 1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。雙螺旋結(jié)構(gòu)。 （3）堿基、糖、磷酸的位置。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)要點： （1）兩條反向平行的多核苷 酸鏈，右手雙螺旋。 （4）雙螺旋的直徑，螺距。 （2）大溝（深溝） 小溝（淺溝） （

8、5）堿基配對 （6）堿基的序列 穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵 （1）互補堿基對之間的氫鍵 （2）堿基堆積力（base-stacking forces） （3）磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子之間形成的離子鍵 3DNA雙螺旋的種類 Watson Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（B型DNA） 當(dāng)DNA鈉鹽纖維相對濕度和鹽的種類改變時， DNA的構(gòu)象發(fā)生改變。 不同DNA纖維的空間結(jié)構(gòu) 類型結(jié)晶狀態(tài)ANa鹽，相對濕度75%時結(jié)晶BNa鹽，相對濕度92%時結(jié)晶C鋰鹽，相對濕度66%時結(jié)晶A-DNA： 與B-DNA相同處：與B-DNA不同點 :（1）螺體寬而短，直徑2.55nm；11個核苷酸一圈，螺距2.

9、46nm。 （2）堿基的傾角大一些：傾角19。 A-DNA：RNA分子中的雙螺旋區(qū)；DNA-RNA雜交分子。 A-DNA和B-DNA之間可以相互轉(zhuǎn)換，推測在轉(zhuǎn)錄時，DNA分子發(fā)生BA的轉(zhuǎn)變。 反向的兩條多核苷酸鏈，右手螺旋。4DNA雙螺旋的研究進(jìn)展 （1）Z-DNA 1979年美國ARich等人發(fā)現(xiàn)了左旋DNA（左手DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)）晶體X-光衍射分析 d(Cp Gp Cp Gp Cp -Gp)Z-DNA的特點的特點 Z-DNA的生物功能：Zig-zag之字與基因表達(dá)、基因調(diào)控有關(guān)。 （2）三螺旋）三螺旋DNA DNA 雙鏈線狀 雙鏈環(huán)狀 單鏈線狀：動物病毒MVM 單鏈環(huán)狀：噬菌體X174 真

10、核細(xì)胞染色體DNA 噬菌體T2，T5，T7，P22 E-Coli染色體DNA 線粒體DNA 葉綠體DNA 多瘤病毒DNA，病毒SV40DNA 噬菌體和X174的復(fù)制型 噬菌體T2DNA長約50m E-coli DNA 長約1mm 人生殖細(xì)胞DNA長約1m 四、DNA的三級結(jié)構(gòu)雙鏈環(huán)狀DNA（double stranded cyclic DNA, DSCDNA） 雙鏈環(huán)狀DNA在自然界是廣泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌體DNA、細(xì)菌質(zhì)粒DNA、線粒體和葉綠體DNA等。 1共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）的超螺旋結(jié)構(gòu)（supe

11、rhelical structure） 形成超螺旋的基礎(chǔ): DNA雙螺旋的扭曲形成超螺旋（superhelix） 負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋 正超螺旋正超螺旋超螺旋超螺旋DNA的性質(zhì)的性質(zhì) 結(jié)構(gòu)緊密，粘度較低，浮力密度大，沉降速度快。結(jié)構(gòu)緊密，粘度較低，浮力密度大，沉降速度快。變變性性2開環(huán)開環(huán)DNA（open circular DNA, ocDNA）也稱松環(huán)也稱松環(huán)DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）3連環(huán)連環(huán)DNA（Catenanes DNA） 單體單體二聚體二聚體一、RNA的類別 1核糖體RNA（ribosomal RNA, rRNA） 2轉(zhuǎn)移RNA（transfer

12、RNA, tRNA） 3信使RNA（messenger RNA, mRNA） 第三節(jié) 核糖核酸（RNA）4其它類別的RNA （1）病毒RNA（Viral RNA, rRNA） （2）核內(nèi)RNA（nuclear RNA, nRNA） 不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA,HnRNA） 小分子核RNA（small nuclear RNA, sn RNA） 小分子核仁RNA（small nucleolar RNA, sno RNA） 染色體RNA（chromosomal RNA, ch RNA） （3）線粒體RNA（mitochondrial RNA, mit RNA）

13、 （4）葉綠體RNA（chloroplast RNA, chlRNA或ctRNA） 1RNA分子中核苷酸之間的連接方式3,5-磷酸二酯鍵 二、RNA的一級結(jié)構(gòu)2RNA分子中核苷酸的排列順序 酵母tRNAAla小片段重疊法 直接閱讀法（直讀法） 1965年3幾類RNA的一級結(jié)構(gòu) （1） tRNA的一級結(jié)構(gòu) tRNA一級結(jié)構(gòu)的共同點: Mr較?。∕r25000），沉降常數(shù)4S。 各種tRNA的鏈長很接近，一般在7393個核苷酸之間。 tRNA分子中約20多個位置上的核苷酸是保守的（不變和半不變的） 各種tRNA的3一端為CCA；5一端大多數(shù)為pG，少數(shù)為pC。 tRNA分子中含有較多的修飾成分。

14、（2）rRNA的一級結(jié)構(gòu) 原核生物核糖體 70S50S30S5S rRNA， 23S rRNA34種蛋白質(zhì)16S rRNA21種蛋白質(zhì)真核生物核糖體 80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49種蛋白質(zhì)18SrRNA33種蛋白質(zhì)（3）mRNA的一級結(jié)構(gòu) 真核生物mRNA的一級結(jié)構(gòu)可用下式表示 :5-帽子 5-非密碼區(qū) 密碼區(qū)3-非密碼區(qū) polyA 5-cap：m7G(5)pppNmp 5-cap cap0: m7G(5)pppNp cap1: m7G(5)pppNmpNp cap2: m7G(5)pppNmpNmpNp 5-cap的功能 (1) 防止mRNA被核酸酶降

15、解。(2) 為mRNA翻譯活性所必需。(3) 與蛋白質(zhì)合成的正確起始有關(guān)。3-polyA : polyA的殘基數(shù)20200個，或更多。polyA的功能 (1) 保護(hù)mRNA，免受核酸外切酶的作用。(2) 與翻譯有關(guān)，沒有polyA翻譯活性降低。(3) 與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。RNA前體 成熟RNA（有功能的RNA） 斷裂、修剪、修飾 大多數(shù)天然RNA是一條單鏈，通過自身回折形成部分螺旋區(qū)，部分非螺旋區(qū)。 少數(shù)病毒RNA如水稻矮縮病毒、呼腸孤病毒、傷瘤病毒等RNA是雙鏈螺旋，類似于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。 三、RNA的二級結(jié)構(gòu) RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素主要是堿基堆積力，其次是氫鍵。

16、1tRNA的二級結(jié)構(gòu) （1）aa接受臂（amino acid arm） （2）二氫尿嘧啶環(huán) （dihydrouridine loop, DHU loop） （3）反密碼環(huán)（anticodon loop） （4）額外環(huán)（extra loop） （5）TC環(huán)（TC loop） 1980年牛心線粒體tRNAser只有63個核苷酸，沉降常數(shù)3S，缺少D環(huán)和D臂，呈二葉草型。 近年來發(fā)現(xiàn)2種線蟲線粒體tRNA也不是標(biāo)準(zhǔn)的三葉草結(jié)構(gòu)。 2rRNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) 3mRNA的二級結(jié)構(gòu) The secondary structure of HEC-SODs mRNA. the free energy o

17、f result is 587.9J. tRNA的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu) 四、四、RNA的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu) 一、一般性質(zhì)：分子大小、性狀、溶解度。 分子大?。篋NA Mr 1061010或更大性狀： DNA為白色纖維狀固體，而RNA為白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有機溶劑，微溶于水， 但它們的鈉鹽在水中溶解度較大。 RNA Mr 104106或更大 第四節(jié) 核酸的性質(zhì)和最常用的研究方法二、粘度 三、酸堿性質(zhì) 四、紫外吸收 由于核酸中堿基的共軛雙鍵，所以對紫外有強烈吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用這一特性可進(jìn)行核酸的定量測定。 1紫外分光光度法 首先根據(jù)A260/A280的

18、比值判斷核酸樣品的純度純DNA：A260/A280=1.8 純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50g/ml雙螺旋DNA或相當(dāng)于40g/ml單鏈DNA或RNA或相當(dāng)于20g/ml寡核苷酸。2摩爾磷消光系數(shù)（molar absorptivity）法 A：樣品的光吸收值 C：每升溶液中磷的摩爾數(shù) L：光徑 L CA)p(8)磷的原子量(30.9每升中磷的重量C( (g g) )W W LLLWA98.3098.30WACA)p( 在pH7.0時；DNA的 為6

19、600, RNA的 為77007800。 )p( )p( ：摩爾磷消光系數(shù)，也稱摩爾磷吸光系數(shù) )p( 知道了磷的含量就可知核酸的含量3增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 增色效應(yīng)（hyperchromic effect） 減色效應(yīng)（hypochromic effect） ：RNA環(huán)狀DNA線狀DNA蛋白質(zhì) DNA 沉降沉降五、核酸的構(gòu)象和分離 1變性（denaturation） 核酸變性的概念 引起核酸變性的因素 六、核酸的變性、復(fù)性和雜交（1）熱變性 結(jié)構(gòu)：螺旋線團(tuán) 理化性質(zhì)：紫外吸收 粘度比旋光度 生物活性：生物活性或喪失 （2）熔點（Tm） Tm: 熔點，熔解溫度， 變性溫度，解鏈溫度 （3）影響Tm

20、值的因素 DNA的均一性 DNA中G-C對的含量 經(jīng)驗式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 鹽離子強度 2復(fù)性（renaturation） （1）復(fù)性 理化性質(zhì): 比旋光度 粘度)p( （annealing）生物活性得到部分恢復(fù) （2）影響復(fù)性的因素 樣品的性質(zhì) DNA的濃度 DNA片段的大小 溫度 離子強度 21CC0 Cot : 21時的時的Cot值，即指復(fù)性完成一半時的值，即指復(fù)性完成一半時的Cot值。值。 3雜交（hybridization） 核酸的雜交：是指不同來源的單鏈核酸之間可通過 堿基互補形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 單鏈DNA與單鏈DNA雜交（DNA-DNA）利用核酸雜交可檢測

21、特定的核苷酸片段或研究同源性等。單鏈DNA與單鏈RNA雜交（DNA-RNA）單鏈RNA與單鏈RNA雜交（RNA-RNA）用硝酸纖維素膜作為支持物進(jìn)行雜交 1975年英國E. M. Southern首創(chuàng)的Southern blotting（Southern印跡）原理方法探針：作為檢測用的已知DNA序列或RNA序列的片段 1977年G.K.Stark首創(chuàng)Northern blotting （Northern印跡） Western blotting（Western 印跡） 核酸研究中最常用的方法 優(yōu)點：簡單、快速、靈敏、成本低。 通過凝膠電泳 （1）可進(jìn)行核酸分離，知道核酸的純度。 （2）測定分子大

22、小。 （3）估計核酸的構(gòu)象。 七、凝膠電泳凝膠電泳兼有分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng) 1瓊脂糖凝膠電泳（agarose gel electrophoresis） 瓊脂糖凝膠電泳的遷移率主要與分子大小、膠濃度、核酸構(gòu)象、電流等有關(guān)。 2聚丙烯酰胺凝膠電泳 （polyacrylamide gel electrophoresis） 用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段 適用于大分子核酸，一般用于DNA分析。 （一）DNA的生物功能 1DNA與遺傳 （1）DNA是主要的遺傳物質(zhì)間接證據(jù)直接證據(jù)八、核酸的生物功能 細(xì)菌轉(zhuǎn)化作用 （transformation ）肺炎球菌（pneumococcus） 1

23、928年細(xì)菌學(xué)家Griffith 細(xì)菌毒性實驗 1944年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗 轉(zhuǎn)化作用：轉(zhuǎn)化作用的物質(zhì)稱轉(zhuǎn)化因子 從一種細(xì)菌中得到DNA通過一定途徑進(jìn)入另一種細(xì)菌，從而引起后者遺傳特性的改變。 噬菌體感染實驗 1952年美國Hershey 噬菌體感染實驗 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction） 人工合成基因的表達(dá) （二）RNA的生物功能 1RNA與蛋白質(zhì)的生物合成 （1）mRNA與遺傳密碼 遺傳密碼（genetic code） 密碼子（codon） mRNA的主要功能 （2）tRNA的作用 tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、攜帶氨基酸，把氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體上，然后按照mRNA上的密碼順序裝配成多肽或蛋白質(zhì)。 tRNA必須識別相應(yīng)的氨基酸和識別mRNA上相應(yīng)的密碼子。 tRNA怎樣識別相應(yīng)的氨基酸: 主要靠高度專一的氨 酰-tRNA合成酶。tRNA怎樣識別mRNA上相應(yīng)的密碼子 （3）rRNA的作用的作用 詳見網(wǎng)上參考材料（一）核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點 :1保持低溫（04）。 2防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。 3防止核酸酶的作用。 九、核酸的分離、純化抑制DN