p16和Rb在宮頸上皮內(nèi)瘤樣變及癌中的表達(dá)

1、p16和Rb在宮頸上皮內(nèi)瘤樣變及癌中的表達(dá) 作者：王冰徐長福王曉麗莫立平李明眾 【關(guān)鍵詞】 宮頸癌 關(guān)鍵詞: p16基因;Rb基因;宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變;宮頸癌;免疫組化 摘 要:目的 探討p16和Rb基因產(chǎn)物在宮頸癌中的表達(dá)，及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系. 方法 應(yīng)用免疫組化技術(shù)（SP法），檢測(cè)p16，Rb基因在10例正常宮頸組織、10例宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）及59例宮頸鱗癌中的表達(dá). 結(jié)果 20%CIN（2/10）和29%宮頸鱗癌（17/59）中，p16免疫反應(yīng)陰性.p16蛋白表達(dá)缺失在不同年齡間有顯著差異，而在腫瘤生長類型、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)各組間比較無顯著差異.宮頸癌中Rb表達(dá)陽性率為

2、88%（52/59），隨組織學(xué)分級(jí)增高，Rb蛋白表達(dá)率升高，各組間比較有顯著差異.66%的宮頸癌兩種蛋白共表達(dá)陽性. 結(jié)論 p16失活參與部分宮頸癌的發(fā)生.Rb可能主要通過功能性失活參與宮頸癌的發(fā)生. Keywords:p16gene;Rb gene;cervical intraepithelial neo-plasias; cervical carcimoma; immunohis-tochemistry Abstract:AIM To study the expression of p16and Rb in cervical carcinoma and its relationship w

3、ith clinicopathologic features.METHODS Using SP immunohistochemical tech-nique，we examined the expression of p16and Rb in10nor-mal cervical tissues，10cervical intraepithelial neoplasias and59invasive squamous cell carcinomas.RESULTS 20%CIN（2/10）and29%cervical carcinomas（17/59）showed nega-tive p16sta

4、ining.Abnormal p16expression was related to age of patients.There were no statistically significant differ-ences in the p16status with respect to gross type，histologic differentiation and stage of the disease.Rb was expressed in52of59（88%）cases of cervical carcinomas.Rb expression was significantly

5、correlated with histologic differentiation（P<0.005）.66%of specimens was immunoreactive for both Rb and p16.CONCLUSION Inactivation of p16may play an important role in the genesis of human cervical carcinoma.Rb may be functionally inactivated in cervical cancer. 0 引言 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控與細(xì)胞癌變密切相關(guān)1 .在細(xì)胞周期進(jìn)

6、程中關(guān)鍵限速點(diǎn)G1 -S期的過度依賴于Rb蛋白的磷酸化，cyclin D1與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cdk4）結(jié)合并激活后者，使Rb蛋白磷酸化失活，促進(jìn)細(xì)胞完成G1 -S期過渡從而進(jìn)入增殖狀態(tài)1 .這一過程可通過p16蛋白與cdk4競爭性結(jié)合而受到抑制.此細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路中p16，cdk4，cyclin D1和Rb基因產(chǎn)物的異常表達(dá)在許多人類腫瘤中存在.我們著重探討p16，Rb蛋白在宮頸癌中異常表達(dá)的頻率及與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性. 1 材料和方法 1.1 材料 我院1997/1999手術(shù)切除和門診活檢宮頸組織材料79例，取材后常規(guī)甲醛液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張，1張行HE染色復(fù)診.其中正

7、常宮頸組織10例，上皮內(nèi)瘤樣變10例，宮頸鱗癌59例.年齡2970（平均51）歲.FIGO臨床分期:B期8例，A期1例，B期43例.病理分級(jí)按WHO方法:級(jí)7例，級(jí)24例，級(jí)28例.臨床大體分型:菜花型30例，結(jié)節(jié)型18例，潰瘍型3例，混合型1例（7例缺少年齡、臨床分期、大體分型原始資料）. 1.2 方法 采用SP免疫組織化學(xué)方法，p16，Rb兔抗人多克隆抗體為Santa cruz公司產(chǎn)品，SP試劑盒為Zymed公司產(chǎn)品、一抗稀釋度為130.實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行.將已知陽性的食管癌切片作為陽性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照.凡染色強(qiáng)度明顯高于背景者為陽性表達(dá)，將陽性細(xì)胞按其數(shù)量

8、及染色強(qiáng)度分為3級(jí):表達(dá)弱陽性（+），即陽性細(xì)胞數(shù)小于10%，染色強(qiáng)度為弱陽性或僅個(gè)別細(xì)胞呈中至強(qiáng)陽性;表達(dá)強(qiáng)陽性（），即陽性細(xì)胞數(shù)為60%以上，染色強(qiáng)度為中至強(qiáng)陽性，少數(shù)細(xì)胞可為弱陽性表達(dá);中度陽性（），即陽性細(xì)胞數(shù)介于表達(dá)弱陽性與表達(dá)強(qiáng)陽性兩級(jí)之間;染色強(qiáng)度與背景無明顯差別者為陰性. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:2 檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)及Fishers精確概率法檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取（P<0.05）為顯著性差異. 2 結(jié)果 2.1 p16及Rb的表達(dá) p16定位于胞核和胞質(zhì)內(nèi)，為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒（Fig1）.正常宮頸上皮中陽性細(xì)胞主要分布在基底層和棘細(xì)胞層，浸潤癌中p16陽性細(xì)胞呈彌漫或散

9、在分布.10例CIN中2例p16蛋白表達(dá)缺失，59例宮頸浸潤性鱗癌中，17例p16蛋白表達(dá)陰性，占29%，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）.Rb的免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于胞核內(nèi)（Fig1）.59例浸潤癌中，7例Rb蛋白陰性表達(dá)，占12%，17例弱陽性（+），35例陽性（）. 圖1 略 表1 宮頸癌中p16蛋白陰性表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系略 2.2 p16及Rb表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 50歲以下年齡組p16陰性表達(dá)占42%（10/24），而50歲以上組為14%（4/28），兩組之間有明顯差異（P<0.05）. p16蛋白表達(dá)在腫瘤生長類型、臨床分期及組織學(xué)分級(jí)各組間

10、無明顯差異（P>0.05，Tab1）.Rb蛋白表達(dá)在組織學(xué)分級(jí)各組間差異顯著（P<0.05），組織學(xué)級(jí)中Rb強(qiáng)陽性11例，占總強(qiáng)陽性表達(dá)的61%.在其他病理參數(shù)各組間比較無明顯差異（P>0.05，Tab2）. 表2 Rb蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系略 2.3 p16與Rb基因表達(dá)關(guān)系 宮頸鱗癌中p16與Rb基因表達(dá)之間無負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=0.143，P=0.176）.59例宮頸鱗癌中39例兩種蛋白共表達(dá)陽性（66%），4例存在兩種基因同時(shí)表達(dá)缺失（7%）. 3 討論 p16是抑制腫瘤生長的關(guān)鍵成分2，3 .在p16基因存在純合缺失、甲基化時(shí)，免疫組化p16

11、染色為陰性4 .實(shí)驗(yàn)中p16蛋白定位于胞核和胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)p16蛋白可能是以不同于核內(nèi)p16蛋白的功能狀態(tài)而存在.我們看出在宮頸上皮癌變的過程中，隨著病變進(jìn)展，p16蛋白以胞質(zhì)表達(dá)為主，發(fā)展為質(zhì)核共同表達(dá)或以胞核表達(dá)為主，據(jù)此我們推測(cè)胞質(zhì)內(nèi)p16蛋白可能作為腫瘤抑制基因的靜止?fàn)顟B(tài)而存在.當(dāng)需要時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用. p16基因及其產(chǎn)物在人類很多原發(fā)腫瘤和細(xì)胞系中發(fā)生改變5 ，但在某些腫瘤及細(xì)胞系中，p16基因改變卻非常少見，包括宮頸癌及其細(xì)胞系中.本實(shí)驗(yàn)20%CIN，29%的浸潤癌中沒有檢測(cè)到p16蛋白，這可能反映部分宮頸癌及其癌前病變中存在p16基因的丟失，提示p16的失活參與了宮頸癌的發(fā)

12、生，并可能發(fā)生在宮頸癌的早期階段，與文獻(xiàn)報(bào)道一致6 .在對(duì)不同年齡組分析發(fā)現(xiàn)，p16蛋白表達(dá)缺失在低年齡段患者明顯高于高年齡組群，這與臨床上觀察到的現(xiàn)象相符，年輕患者對(duì)治療抵抗，預(yù)后不佳.Rb基因缺失或突變，將導(dǎo)致細(xì)胞喪失抑制E2F的能力，而進(jìn)入非正常增殖狀態(tài)，進(jìn)而產(chǎn)生腫瘤7 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100%CIN和88%浸潤癌中Rb蛋白陽性表達(dá)，提示Rb基因突變?cè)趯m頸癌發(fā)生中出現(xiàn)較晚，僅對(duì)于小部分宮頸癌形成起一定作用，在多數(shù)宮頸癌發(fā)生中，Rb蛋白主要通過HPV感染或cyclin D1過表達(dá)引起的功能性失活而參與.宮頸癌中Rb蛋白表達(dá)在組織學(xué)分級(jí)組間有顯著性差異（P<0.05），與王英等8

13、，9 報(bào)道不一致，這種Rb蛋白在分化差、惡性度高的腫瘤中過表達(dá)與其作為抑癌基因的自然屬性看起來是自相矛盾的，它產(chǎn)生的原因尚不清楚，有可能是在分化程度差的腫瘤細(xì)胞中形成大量較為穩(wěn)定的Rb蛋白. 參考文獻(xiàn): 1Gong Z，F(xiàn)u J.Cyclin-dependent kinase4inhibitor a and tumor J.Zhonghua Yixueyichuanxue Zazhi（Chin J Med Genetics），2001;18（3）:219-221. 2Sharpless NE，Depinho RA.The INK4A/ARF locus and its two gene pro

14、ducts J.Curr Opin Genet Dev，1999;9（1）:22-30. 3Ambrosch P，Schlott T，Hilmes D，Ruschenburg I.p16alter-ations and retinoblastoma protein expression in squamous cell carcinoma and neighboring dysplasia from the upper aerodiges-tive tract J.Virchows Arch，2001;438（4）:343-349. 4Bortolotto S，Chiado-Piat L，Ca

15、valla P，Bosone I，Chio A，Mauro A，Schiffer D.CDKN2A/p16inactivation in the progno-sis of oligodendrogliomas J.IntJ Cancer，2000;88（4）:554-557. 5He SY，Xin XY，Wang J，Guo HL.Expression of p16and cy-clinD1in uterine endometrial carcinomas and its significance J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Uni

16、v），2000;21（3）:347-349. 6Wang J，Xin XY，Chen BL，Wang DT，Mu RH，Liu SJ，Zheng WG.Expression of cyclin D1and p16in the carcinogenesis of common epithelial ovarian tumors and their correlation J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:350-353. 7Masciullo V，Khalili K，Giordano A.The Rb fam

17、ily of cell cycle regulatory factors:Clinical implications J.IntJ Oncol，2000;17（5）:897-902. 8Wang Y，Li KZ，Li YS，Wang JB.Expression and significance of p15and Rb gene in human hepatocellular carcinoma tissue J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（11）:1333-1335. 9Yang LJ，Shao GX，Liu RF，Wang H，Chen BQ.Expression and correlation of p21CTP1/WAF1，Rb in human prostate can-cer J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J