菌齡對(duì)核盤(pán)菌致病性的影響及植物抗核盤(pán)菌分子機(jī)制

1、菌齡對(duì)核盤(pán)菌致病性的影響及植物抗核盤(pán)菌分子機(jī)制核盤(pán)國(guó)（sclerotinia sclerotioru）行）是一一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的死體營(yíng)養(yǎng)型病原真菌。核盤(pán)菌引起的菌核病是油料和蔬菜作物的重要病害。草酸和細(xì)胞壁降解酶是核盤(pán)菌重要致病因子。核盤(pán)菌生長(zhǎng)過(guò)程中當(dāng)遇到不利 條件時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣生菌絲并形成菌核，核盤(pán)菌菌絲形態(tài)的分化使其致病力發(fā)生很大 變化。但具體機(jī)制尚不清楚。目前對(duì)植物抗核盤(pán)菌機(jī)制的理解仍很膚淺，抗核盤(pán)菌調(diào)控新基因的鑒定急需開(kāi)展，作為核盤(pán)菌的非寄主植物的水稻與核盤(pán)菌的互作或 許會(huì)為核盤(pán)菌抗性研究提供新的發(fā)現(xiàn)。本研究圍繞植物與核盤(pán)菌的互作機(jī)理，解析菌齡影響核盤(pán)菌致病力的分子機(jī) 制、闡明植物

2、鈣離子信號(hào)通路在抗核盤(pán)菌中的作用、采用本氏煙cDNAC庫(kù)-VIGS篩選技術(shù)，獲取抗核盤(pán)菌調(diào)控新基因，并初步揭示水稻與核盤(pán)菌的非寄主互作分 子機(jī)制，獲得了如下結(jié)果：（1）明確了核盤(pán)菌菌絲形態(tài)分化與致病力的關(guān)系，解釋 了富含氣生菌絲的老熟菌絲致病力下降的原因。核盤(pán)菌平板培養(yǎng)時(shí)老熟菌絲上會(huì) 有大量氣生菌絲產(chǎn)生，顯微觀察發(fā)現(xiàn)氣生菌絲直徑明顯比幼嫩菌絲小，只有幼嫩 菌絲的1/5左右。與新生菌絲（菌齡為0d的幼嫩菌絲）相比,1d-3d菌齡的老熟菌絲致病力明顯 下降。進(jìn)一步分析顯示，老熟菌絲中草酸合成關(guān)鍵基因OAH勺表達(dá)明顯低于幼嫩 菌絲，而且老熟菌絲產(chǎn)草酸的能力顯著下降。外源施加草酸（10mM,pH7.0

3、）部分恢復(fù)老熟菌絲的致病力。這些結(jié)果證明草酸 分泌的降低導(dǎo)致了老熟菌絲致病力的下降。此外,1d-3d老熟菌絲中超氧陰離子和過(guò)氧化氫含量低于0d菌齡的菌絲，這與活性氧代謝相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。另外，RNAi分析結(jié)果表明，微管相關(guān) 蛋白EB1基因的沉默減弱生長(zhǎng)發(fā)育和菌核形成，致病力也明顯下降。顯示EB1基因在核盤(pán)菌生長(zhǎng)發(fā)育、菌核形成和致病性中的重要作用。(2)揭示了鈣離子信號(hào)途徑和 AtWRKYI基因在植物抗核盤(pán)菌中的作用。采用芯片表達(dá)譜技術(shù)比較分析了接種核盤(pán)菌前后油菜葉片的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有1072個(gè)差異表達(dá)在2倍以上的基因，其中接種后上調(diào)表達(dá)基因531個(gè)，下調(diào) 表達(dá)基因541個(gè)。差異表達(dá)基

4、因中有15個(gè)與鈣離子信號(hào)通路相關(guān)。藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，鈣離子通道抑制劑氯化錮(LaCl3,1mmol/L)和鈣泵抑 制劑偏鈾酸鈉(NaVO3,50 mol/L)處理降低了本氏煙對(duì)核盤(pán)菌的抗性，而 CaCl2(10mmol/L)處理則增強(qiáng)該抗性。這些調(diào)節(jié)劑的處理顯著誘導(dǎo)包括 AtWRKY11 在內(nèi)的一組鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)基因的表達(dá)。擬南芥wrkyll突變體對(duì)核盤(pán)菌抗性顯著下降。這些結(jié)果證明了鈣離子信號(hào) 通路對(duì)植物抗核盤(pán)菌起重要調(diào)控作用。(3)在基因組水平鑒定了番茄鈣離子依賴(lài)的蛋白激酶(Calcium-dependentprotein kinase,CDPK) 和 CDPK-related prote

5、in kinase (CRK) 基因家族，并采 用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)分析明確了SlCDPKffi SlCRK基因?qū)吮P(pán)菌抗性的重要調(diào)控作用。采用生物信息學(xué)方法鑒定 了 29個(gè)番茄CDPKS因和6個(gè)CRKSI3。所有SlCDPKS白都包含一個(gè)STKc_CAMK絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和 兩個(gè)EF-hand類(lèi)鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所有SlCRK僅僅在N端包含一個(gè)STKc_CAMK 類(lèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，而C端不含有保守的Ca2+吉合位點(diǎn)。系統(tǒng) 進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)番茄CDPKC族分為4個(gè)組。其中第IV組SlCDPKs比

6、較特珠，它們是堿性蛋白并有11個(gè)內(nèi)含子。VIGS分 析顯示,SlCRK6同時(shí)參與了對(duì)核盤(pán)菌和 Psedomonas syringae pv. tomato DC3000(Pst DC3000方勺抗性調(diào)控；而SlCDPK1解口 SlCDPK1原因?qū)吮P(pán)菌抗性沒(méi) 有顯著調(diào)控作用，但分別正調(diào)控對(duì) Pst DC300g Xanthomonasoryzae pv. oryzae (Xoo)的抗性。這些結(jié)果說(shuō)明，SlCDPK和SlCRK廣泛參與對(duì)各種病害抗性的調(diào)控，且不同抗 性有不同的基因參與。另外，酵母雙雜交分析結(jié)果表明，SlCDPK12與S1CaMl£白 互作。(4)采用本氏煙cDNAC庫(kù)V

7、IGSW選方法，篩選鑒定了一批草酸耐性和核盤(pán)菌 抗性調(diào)控基因。從構(gòu)建的文庫(kù)中挑取了 511個(gè)基因進(jìn)行VIGS分析，一共篩選獲取 了 71個(gè)草酸耐性調(diào)控基因和63個(gè)核盤(pán)菌抗性調(diào)控基因，其中,Upstream activation factor subunit UAF30( 編號(hào) 437)和 Translationally-controlled tumor protein ( 編號(hào)502)等基因的沉默植株對(duì)草酸耐受力減弱，對(duì)核盤(pán)菌的抗 性也減弱，而Aspartic proteinase oryzasin-1( 編號(hào)135)等基因的沉默植株對(duì) 草酸的耐受力增強(qiáng)，對(duì)核盤(pán)菌抗性也增強(qiáng)。說(shuō)明這些基因?qū)Σ菟?/p>

8、介導(dǎo)的植物與核盤(pán)菌互作起重要調(diào)控作用。有些基因只涉及對(duì)草酸耐性或核盤(pán)菌抗性的調(diào)控，說(shuō)明植物對(duì)核盤(pán)菌的抗性除了草酸外還有 別的途徑。(5)建立了水稻與核盤(pán)菌的非寄主抗性互作體系，初步明確了該非寄主互作 的調(diào)控機(jī)制。核盤(pán)菌野生型1980菌株接種24h后水稻葉片產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的類(lèi)似 HR反應(yīng)的褐色壞死小斑點(diǎn)。褐色斑點(diǎn)內(nèi)有大量活性氧積累，核盤(pán)菌被限制在壞死區(qū)域無(wú)法擴(kuò)展。而不致病的PB菌株接種后水稻葉片沒(méi)有產(chǎn)生類(lèi)似反應(yīng)利用TMTB記方法對(duì)接種核盤(pán)菌的水稻葉片蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。對(duì)接種野生型1980菌株與不致病的PB菌株之間、以及PB菌株接種與不接種之間的水稻葉片差異表達(dá)蛋白分析結(jié)果表明，以下蛋白可能參與對(duì)核盤(pán)菌抗性的調(diào)控：P-protein; Proline-rich-like protein; ribonuclease T2family protein;Eukaryotic translation initiation factor3; RALFL4(Rapid ALkalinizationFactor RALFfamily protein); lrgB-like family protein 和 CHIT14(Chitinasefamily protein)以及一組氧化還