SPR生物傳感芯片研發(fā)技術(shù)背景

1、SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案第一部分 SPR生物傳感芯片研發(fā)技術(shù)背景1.1 SPR生物傳感芯片的制備技術(shù)傳感芯片是整個(gè)SPR系統(tǒng)的核心。SPR傳感芯片可以是金屬膜本身，但由 于這種傳感芯片沒有選擇性，只能在特定條件下采用，故常在金屬膜表面固定一 層具有分子識(shí)別功能的敏感膜。目前大多數(shù) SPR裝置使用的都是金膜，迄今為 止，有關(guān)金膜的修飾方法主要有如下幾類： 1.1.1物理吸附技術(shù)將物質(zhì)分子通過簡單的物理吸附的方法吸附在傳感芯片表面，分子與金膜之間通過疏水作用、靜電作用、范德華力等結(jié)合在一起，這是 SPR技術(shù)最初應(yīng)用 時(shí)采用的方法。該技術(shù)的特點(diǎn)是方法簡單，適用于許多種類的物質(zhì)分子。但是

2、這 個(gè)方法的缺點(diǎn)也是明顯的，即物質(zhì)分子在芯片表面吸附的不牢固，時(shí)間長會(huì)脫落； 難以形成穩(wěn)定的分子；固定量也難以控制；生物分子在金表面容易喪失活性， 尤 其是在溫度、酸堿度以及離子強(qiáng)度發(fā)生變化時(shí)更易失活；固定分子的取向也難以 控制。1.1.2 LB膜技術(shù)LB膜技術(shù)是20世紀(jì)20-30年代由美國科學(xué)家Langmuir及其學(xué)生Blodgett 建立的一種單分子膜堆積技術(shù)。它的基本原理是：將帶有親水頭基和疏水長鏈的 兩親性分子在亞相表面鋪展形成單層膜，然后將這種氣/液界面上的單層膜在包定壓力下轉(zhuǎn)移到基片上，形成LB膜。按改變膜轉(zhuǎn)移時(shí)基片表面相對(duì)于水面的不 同運(yùn)動(dòng)方向，可以把LB膜的制備分成X、Y和Z三

3、種方式。將基片表面垂直于 水面向下掛膜，使成膜分子的疏水端指向基片，稱 X法；將基片反向從水下提 出掛膜，使成膜分子的親水端指向基片，稱 Z法；將基片上下往返運(yùn)動(dòng)掛膜， 使各層分子的親水和疏水端依次交替指向基片，稱 Y法。LB膜與其他膜相比具有以下特點(diǎn)：(1)膜的厚度可以從零點(diǎn)幾納米至幾納米；(2)高度各向異性的層狀結(jié)構(gòu)；(3)理論上具有幾乎沒有缺陷的單分子層膜；LB膜法實(shí)質(zhì)上是一種人工控制的特殊吸附方法,可在分子水平上實(shí)現(xiàn)某些 組裝設(shè)計(jì)，完成一定空間次序的分子組合。通過該方法可以將液面上有序排列的 某些有機(jī)分子逐層轉(zhuǎn)移到固定基片上，實(shí)現(xiàn)基片上的特定分子的高度有序排列。SPR生物傳感芯片新工藝

4、研發(fā)的理論方案QQQQQQQQQQO0OOOOOOOOWIM 1PQQQQQQQPQ?否WWWWF?X型圖1.1 LB膜的制備原理但是，LB膜自身存在著一些難以克服的缺點(diǎn)，限制了它的實(shí)際應(yīng)用。LB膜中的分子與基片表面、層內(nèi)分子之間以及層與層之間多以作用較弱的范德華力相 結(jié)合。因此，LB膜是一種亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)，對(duì)熱、化學(xué)環(huán)境、時(shí)間以及外部壓力的 穩(wěn)定性較差；膜的性質(zhì)強(qiáng)烈依賴于轉(zhuǎn)移過程。LB膜的缺陷多、成膜分子一般要求為雙親分子、設(shè)備的高要求以及成膜過程與操作的復(fù)雜性等嚴(yán)重限制了LB膜在生物傳感器中的實(shí)際應(yīng)用。1.1.3 分子自組裝技術(shù)為了克服LB膜的穩(wěn)定性差和制備需要昂貴儀器等缺點(diǎn)，自組裝膜應(yīng)運(yùn)而

5、生。分子自組裝成膜的基本原理是通過固 -液界面間的化學(xué)吸附（表面化學(xué)反應(yīng)） 進(jìn)行的：在表面活性劑的有機(jī)溶液中，浸入某種表面物質(zhì)的基片，活性劑分子的 反應(yīng)基（頭基）與基片表面物質(zhì)自動(dòng)發(fā)生連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)，在基片表面形成由化學(xué) 鍵連接的取向、緊密排列的二維有序的單分子膜，同層內(nèi)分子間的作用力仍然為 范德華力。SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案筑基一SH和Au之間有較強(qiáng)的相互作用，帶有筑基的分子在金表面可以自 發(fā)地形成有序結(jié)構(gòu)，而且穩(wěn)定性非常高。 A u-S鍵極易自發(fā)形成并釋放熱量，硫 醇、硫醴或二硫醴衍生物中的S原子與Au表面的強(qiáng)烈相互作用遵循軟硬酸堿作 用原理。形成Au-S鍵使得硫化合物在金表

6、面形成的 SAMs具有良好的穩(wěn)定性、 致密性、有序性。由于許多藥物分子和生物提取物都含有一 SH基和一S S一基, 利用A u-S鍵，可直接將連接有琉基的生物分子組裝于金表面；也可先獲得尾端 帶有功能基團(tuán)的含硫化合物在金表面的 SAM ,利用尾端的功能基團(tuán)直接或在活 化劑（或偶聯(lián)劑）的作用下連接上生物功能分子，從而實(shí)現(xiàn)生物功能分子與基底 的穩(wěn)定結(jié)合。選擇不同的自組裝分子，可以將傳感芯片修飾成不同的表面： 疏水 或親水的，帶有正電或負(fù)電的，或者帶有其他活性基團(tuán)，在此基礎(chǔ)上再固定其他 分子。自組裝技術(shù)已經(jīng)廣泛被用來在金屬表面構(gòu)建致密有序的分子層結(jié)構(gòu)。圖1.2分子自組裝單分子膜的制備原理1.1.4

7、交替沉積技術(shù)基于化學(xué)吸附的分子自組裝多層膜是通過化學(xué)鍵連接在一起的，穩(wěn)定性較 好，有序度也較高，看起來是一種好的制備自組裝多層膜的技術(shù)。但是，在實(shí)際 操作中，快速、定量的化學(xué)吸附要求有高反應(yīng)活性的分子和特殊的基底作保障， 由于通常的化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)率很難達(dá)到100%,使得用這種自組裝技術(shù)制備結(jié)構(gòu)有序的多層膜并不容易。這就需要發(fā)展新的、更簡單有效的超薄膜制備技術(shù)。1991年，在Iler等人的工作基礎(chǔ)之上，Deche年人提出一種新的納米復(fù)合薄 膜制備技術(shù)，由于形成薄膜的驅(qū)動(dòng)力是帶相反電荷的組分之間的靜電引力，因此這種技術(shù)被稱為靜電自組裝薄膜技術(shù)（Electrostatic Self-assembly,

8、 ESA）。這種 技術(shù)制備超薄膜的過程十分簡單，以聚陽離子和聚陰離子在帶正電荷的基片上的 交替沉積為例，超薄膜的制備過程可描述如下（如圖 1-3所示）：（1）將帶正 電荷的基片先浸入聚陰離子溶液中，靜置一段時(shí)間后取出，由于靜電作用，基片上會(huì)吸附一層聚陰離子。此時(shí)，基片表面所帶的電荷由于聚陰離子的吸附而變?yōu)镾PR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案負(fù)；(2)用水沖洗基片表面，去掉過量吸附的聚陰離子，并將沉積有一層聚陰 離子的基片干燥；(3)將上述基片轉(zhuǎn)移至聚陽離子溶液中，基片表面便會(huì)吸附 一層聚陽離子，表面電荷恢復(fù)為正；(4)水洗，干燥。這樣便完成了聚陽離子 和聚陰離子組裝的一個(gè)循環(huán)。重復(fù)(1)至(

9、4)的操作便可得到多層的聚陽離子 /聚陰離子超薄膜。盡管這種組裝技術(shù)構(gòu)筑的超薄膜的有序度不如 LB膜高，但與 其它超薄膜的制備技術(shù)相比較，它仍具有許多的優(yōu)點(diǎn)：(1)超薄膜的制備方法簡單，只需將離子化的基底交替浸入帶相反電荷的 聚電解質(zhì)溶液中，靜置一段時(shí)間即可，整個(gè)過程不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備；(2)成膜物質(zhì)豐富，適用于靜電沉積技術(shù)來制備超薄膜的物質(zhì)不局限于聚 電解質(zhì)，帶電荷的有機(jī)小分子、有機(jī)/無機(jī)微粒、生物分子，如蛋白質(zhì)、DNA、 病毒、酶等帶有電荷的物質(zhì)都有可能通過靜電沉積技術(shù)來獲得超薄膜；(3)靜電沉積技術(shù)的成膜不受基底大小、形狀和種類的限制，且由于相鄰 層間靠靜電力維系，所獲得的超薄膜具有良

10、好的穩(wěn)定性；(4)單層膜的厚度在幾個(gè)埃至幾個(gè)納米范圍內(nèi)，是一種很好的制備納米級(jí) 超薄膜材料的方法。單層膜的厚度可以通過調(diào)節(jié)溶液參數(shù)，如溶液的離子強(qiáng)度、 濃度、PH值，以及膜的沉積時(shí)間而在納米尺度范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)控；(5)特別適合于制備復(fù)合超薄膜。將相關(guān)的構(gòu)筑基元按照一定順序進(jìn)行組 裝，可自由地控制復(fù)合超薄膜的結(jié)構(gòu)與功能。踞壞沉積聚電威A鼻法豪電展BM既圖1-3靜電自組裝多層膜的制備過程SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案1.1.5 共價(jià)固定技術(shù)共價(jià)固定法已成為SPR研究中應(yīng)用最廣泛的固定方法，就是將物質(zhì)分子通 過化學(xué)鍵共價(jià)交聯(lián)的方法固定在傳感芯片表面。采用這種固定方法首先要在傳感 表面通過吸附或

11、自組裝固定一層物質(zhì)，然后將要固定的配體固定其上。由于是通 過共價(jià)鍵連接，因此固定分子的穩(wěn)定性大大提高， 而且方法也比較簡單。根據(jù)周 定時(shí)反應(yīng)基團(tuán)的不同可以分為幾類：氨基交聯(lián)法、醛基偶聯(lián)法以及二硫鍵交換法 等。其中，氨基交聯(lián)法是應(yīng)用最多的方法，用EDC/NHS活化傳感片表面的竣基， 活化的竣基與配體上的氨基自發(fā)的反應(yīng)形成共價(jià)鍵，從而將生物分子交聯(lián)到傳感片的表面。根據(jù)具體要求，可選直接化學(xué)交聯(lián)或親和捕獲等方法。圖1.2化學(xué)鍵共價(jià)固定技術(shù)的制備原理1.1.6 分子印跡膜技術(shù)聚合物材料由于成本低、易加工、物理或化學(xué)性能修飾比較簡單等優(yōu)點(diǎn)，在 傳感器的發(fā)展中具有舉足輕重的地位，目前已成為信息傳感材料的主

12、體。將聚合 物材料以膜的形式通過適當(dāng)?shù)姆绞焦潭ㄔ?SPR傳感器的傳感芯片表面作為敏感 膜，不僅使SPR傳感器具有特異識(shí)別性和高效選擇性，而且還能夠使 SPR傳感 器獲得較小的干擾以及重復(fù)使用性能，有效地提高了SPR傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性。由于聚合物薄膜的優(yōu)良特性，目前已逐漸被人們用作SPR傳感器中傳感芯片的敏感膜材料。分子印跡技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種合成對(duì)某一特定分子（印跡分子）具有選擇性的聚合物的方法。該方法已成為高分子聚合物中儲(chǔ)藏分子信息的有效手段，可以使聚合物在分子水平（層次）上對(duì)特定物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。其中從應(yīng)用角SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案度，分子印跡聚合物又可分為不同的類型，

13、 分子印跡膜正是研制傳感器關(guān)鍵器件 的最佳選擇。分子印跡膜具有操作簡便，耗能少，反應(yīng)時(shí)間短，干凈無污染等特 點(diǎn)。同生物膜相比，又具有耐惡劣環(huán)境、穩(wěn)定性高、易于處理和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)?；?于分子印跡膜的SPR傳感芯片能選擇性地識(shí)別結(jié)合印跡分子，并由信號(hào)轉(zhuǎn)換器 根據(jù)結(jié)合過程中光學(xué)參數(shù)的變化輸出信號(hào)， 而信號(hào)的強(qiáng)弱決定于印跡分子物質(zhì)濃 度的高低。目PR chippolymerisation圖1.4分子印跡膜修飾 SPR傳感芯片的制備原理由于“分子印跡”是一個(gè)綜合性的概念，并易于操作，因此許多較寬范圍和 通用性的應(yīng)用戰(zhàn)略已被提出，并加以實(shí)施。雖說方法的基本概念已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，同時(shí) 一些高聚物也取得了實(shí)際應(yīng)用，但這

14、一技術(shù)仍處于發(fā)展之中，有很多問題急需要 解決。分子印跡高聚物?？珊吞烊豢贵w相比較。 然而，它們間仍存在相當(dāng)寬的空 隙和差異。存在差異之一是接受鍵合目標(biāo)分子的環(huán)境， 或溶劑有所不同。迄今報(bào) 告過的許多合成的印記高聚物，僅在有機(jī)溶劑中才能表現(xiàn)出它的功能。 而天然抗 體則是在水中工作的。近年來，化學(xué)家已將注意力指向非有機(jī)的即水基的體系， 然而有關(guān)在水相體系中的印跡高聚物報(bào)告仍很有限，主要困難是在水中時(shí)，溶劑會(huì)妨礙印跡的實(shí)現(xiàn)：(1)在大量的水中時(shí)，模板和功能單體預(yù)組織中最受偏愛的氫鍵，就會(huì)因 溶劑的競(jìng)爭而破壞；(2)用于水中的通用水溶性交聯(lián)劑(如 N, N'-亞甲基雙)不能充分地增強(qiáng) 高聚物，

15、因此所得的高聚物在用作敏感膜時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)剛性不足的問題。SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案1.1.7 基于某些分子間特異相互作用的 固定技術(shù)還有一些固定方法是基于某些分子間特異性的相互作用，如生物分子的特異 性識(shí)別。人們已經(jīng)發(fā)展了基于 生物素-親和素、糖-凝集素(或伴刀豆球 蛋白)、蛋白A-抗體Fc片段以及抗體-抗原、受體-配體和金屬螯合 作用等特異性相互作用而將分子捕獲在傳感芯片表面的固定方法，即首先固定 其中一種分子，再將另一種分子或標(biāo)記另一種分子的物質(zhì)通過相互作用而固定。 這種固定方法的優(yōu)點(diǎn)是：(1)分子間的相互作用一般比較牢固，傳感片可以重 復(fù)利用；(2)由于捕獲分子和配體的間具有

16、特異性的識(shí)別作用，因此在配體的 固定的同時(shí)還可以起到一定的純化作用，甚至可以從混合物中直接捕獲配體分子 而不需要純化；(3)由于是在特定位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)行識(shí)別固定，配體分子以比較一 致的取向而固定；(4)捕獲分子的存在，使固定的配體遠(yuǎn)離了傳感表面，減小 了表面對(duì)分析物與配體結(jié)合的空間障礙；1.2 金表面寡核甘酸探針分子的固定技術(shù)目前，在金表面固定寡核甘酸探針分子的技術(shù)可以分為兩種： 一是修飾DNA 的固定技術(shù)。在DNA的末端連接含硫化合物、生物素或氨基等，再通過這些基 團(tuán)將DNA探針固定在金表面；二是不修飾DNA的固定技術(shù)。由于在DNA的5' 端和3'端分別存在可以利用的磷酸基團(tuán)和羥

17、基基團(tuán)， 可以在金表面修飾能與這兩 種基團(tuán)反應(yīng)的功能性基團(tuán)，如竣基、氨基或羥基等，通過化學(xué)反應(yīng)將DNA共價(jià)固定在金膜表面。/修 飾金表面寡核甘酸探針分子的固定J<1A ADN探針的固定 不修飾DN探針的固定1 .含硫化合物修飾的 DNA ( HS-ssDNA或-SS-ssDNA)探針的固定(1) 探針直接處理金表面的固定技術(shù)(2) 通過膠體金的固定方法2 .生物素彳飾的 DNA (biotin-DNA )探針的固定(1)親和素在竣基修飾的金表面固定技術(shù)(2)親和素在生物素修飾的金表面固定技術(shù)(3)親和素在負(fù)電聚合物修飾的金表面固定技術(shù)1 3.氨基修飾的 DNA (H2N-ssDNA)探針

18、的固定 f1. DNA探針在羥基修飾的金表面固定技術(shù)2. DNA探針在竣基修飾的金表面固定技術(shù)3. DNA探針在氨基修飾的金表面固定技術(shù)4. DNA探針在醛基修飾的金表面固定技術(shù)5. DNA探針在硅烷化的金表面固定技術(shù)SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案1.2.1 修飾DNA的固定技術(shù) 含硫化合物修飾的 DNA (HS-ssDNA或-SS-ssDNA)探針的固定1.2.2 不修飾DNA的固定技術(shù)SPR生物傳感芯片新工藝研發(fā)的理論方案1.3 BIAcore系列SPR芯片產(chǎn)品1）傳感芯片CM5用途最廣的芯片傳感芯片CM5s面覆蓋了一層葡聚糖。帶有化學(xué)基團(tuán)如NH, -SH, CHQ OH COOH勺生物分子（Ligand）可通過化學(xué)反應(yīng)，以共價(jià)鍵耦聯(lián)的方式與 葡聚糖上的竣基耦聯(lián)。從而使生物分子耦聯(lián)到傳感片表面。2）傳感芯片SA-捕獲生物素標(biāo)記的肽片段、蛋白質(zhì)、 DNA傳感芯片SA表面覆蓋了一層鏈霉抗生物素（Streptavidin ）,能與被生物素 標(biāo)記的分子量大小各異的肽片段、蛋白質(zhì)、 DNAg合。是研究DNA DNA RNA DNA RNA蛋白質(zhì)間相互作用的理想芯片。3）傳感芯片NTA通過金屬螯合作用捕獲生物分子（Ligands ）傳感芯片NTA表面耦聯(lián)了氨三乙酸（NTA ,通過鍥組氨酸修飾離子螯合作用 將末端組氨酸修飾的生物分子（Ligands ）