實驗二外植體的消毒接種與培養(yǎng)

1、實驗二 外植體的消毒、接種與培養(yǎng)一、目的要求通過在超凈工作臺上進行無菌操作訓(xùn)練，掌握外植體消毒和接種的無菌操作技術(shù)。二、原理滅菌是組織培養(yǎng)中重要的工作環(huán)節(jié)之一， 是指采用理化手段殺死物體表面及其孔隙內(nèi)的 一切微生物， 包括細菌的芽孢和真菌的孢子。 組織培養(yǎng)中要求無菌室、 超凈工作臺達到無菌 狀態(tài)，植物材料也要經(jīng)過消毒滅菌后再接種，接種人員的雙手同樣如此。無菌室和超凈工作臺可采用甲醛、高錳酸鉀混合薰蒸，結(jié)合紫外燈照射2030分鐘；外植體可采用 75%酒精和 0.1%的升汞殺菌；雙手可用 75%的酒精棉球擦拭；接種工具可采用 75%酒精棉球擦拭，再經(jīng)火焰灼燒滅菌。三、用品用具1、實驗材料：青蒿嫩葉

2、、菊花嫩莖、胡蘿卜塊根、枸杞葉、瓜葉菊葉、蘆薈莖尖、康乃 馨莖段、月季莖段、草莓莖段、馬鈴薯芽尖等。2、 實驗試劑： 75的酒精、 95的酒精、 01的升汞（ （氯化汞， HgCl2） ）、無菌水、 無菌濾紙等。3、實驗器具：超凈工作臺、盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶、接種器械（主要指解剖刀、剪刀、鑷 子等）、酒精燈。四、方法和步驟1用水和肥皂洗凈雙手，穿上滅菌過的專用實驗服、帽子與鞋子，進入接種室。2. 打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射203 0 min。3操作前 10 20min 使超凈工作臺處于工作狀態(tài)，讓過濾室空氣吹拂工作臺面和四周的臺壁。4. 照射 20min 后，關(guān)閉紫外燈。5. 用

3、70 75的酒精擦拭工作臺和雙手。6. 用蘸有 70酒精的紗布擦拭裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進工作臺。7. 把解剖刀、 剪刀、 鑷子等器械浸泡在 95酒精中， 在火焰上滅菌后， 放在器械架上。&材料預(yù)處理：剪取康乃馨植株的幼嫩莖段35cm,去掉葉片，用洗衣粉水清洗10分鐘，再用清水沖洗殘余的藥劑；9、 在超凈臺上，用70%酉精浸泡30S,用0.1%升汞浸泡5min左右，最后用無菌水清洗 3 5次，吸干水分后備用；10、 將材料置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，切取1cm左右?guī)в幸粋€腋芽的莖段，接種到培養(yǎng)基上。接種時動作盡量要快，應(yīng)使形態(tài)學(xué)上端向上，防止倒置。把培養(yǎng)材料放進70%的酒精中浸泡約30s，再在

4、0.1 %的升汞中浸泡510min，或在10%的漂白粉上清液中浸泡 1015min , 浸泡時可進行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好的接觸；然后用無菌水沖洗35次。11 用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各部分都燒到，打開瓶口。12.取下接種器械，在火焰上滅菌。13 .把培養(yǎng)材料放人培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口（每人接種5 10瓶）。操作期間應(yīng)經(jīng)常用 70%酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上滅菌。14 接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺。附錄：植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑消毒劑名稱使用濃度（%消毒難易火菌時間（min）消毒效果乙醇70 75易0.1 3好氯化汞0.1 0.2較難215最好漂白粉飽和溶液易530很好次氯酸鈣910易530很好次氯酸鈉2易530很好過氧化氫10 12最易515好如果培養(yǎng)材料大部分發(fā)生污染，說明消毒劑浸泡的時間短；若接種材料雖然沒有污染， 但材料已發(fā)黃，組織變軟，表明消毒時間過長，組織被破壞死亡；接種材料若沒有出現(xiàn)污染, 且生長正常，即可以認為消毒時間適宜。五、思考題1、接種1周后，觀察接種材料的污染情況，并分析污染原因。2、接種46周后，觀察并記錄愈傷組織或者叢生芽的誘導(dǎo)率。3、在接種過程中，通過哪些措施