mirRNA引物設(shè)計2

1、miRNA常用實驗方法；一、miRNA的檢測方法；miRNA的realtime-PCR檢測方法；1、realtime-PCR引物設(shè)計；miRNArealtime-PCR引物設(shè)計方法：；1）stem-loopRT引物設(shè)計：基于通用的莖；GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG；2）realtime上游引物設(shè)計：miRNA序列；3）下游引物是通用的，序列miRNA常用實驗方法一、 miRNA的檢測方法miRNA的realtime-PCR檢測方法1、 realtime-PCR引物設(shè)計miRNA realtime-PCR引物設(shè)計方法：1）stem-loop RT引物設(shè)計：基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，只

2、需要按照不同的miRNA序列修改最末端6個堿基即可。通用莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC 例如設(shè)計miR-1（UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU）的RT引物，只需在通用莖環(huán)序列后架上miRNA3末端的6個堿基的反向互補序列，即GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACAT2）realtime 上游引物設(shè)計：miRNA序列除去3端6個堿基的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為(注意把U改為T)：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm值（一般參

3、考DNAMAN），如果Tm值較低，則在5端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設(shè)計為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。3）下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT。4）引物設(shè)計好后，需要通過預(yù)試驗檢測引物的特異性。一般需要做溶解曲線來檢測引物的特異性；同時最好將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測產(chǎn)物是否單一（因產(chǎn)物長度很小，需要3%以上的瓊脂糖膠）。2、 miRNA反轉(zhuǎn)錄miRNA的反轉(zhuǎn)錄與一般基因的反轉(zhuǎn)錄過程基本相同。因為其產(chǎn)物很短，用最普通的逆轉(zhuǎn)錄酶即可。我們一般使用的是TIANGEN的MLV，逆轉(zhuǎn)錄體系為：RNA 500ng2ug5xbuffer

4、 2uldNTP 0.25ulDDT 0.25ulRRI 0.25ulMLV 0.25ulRT primer 0.5ulH2O(RNase free) 補至10ul程序為（PCR儀中通常命名為CTFRT）16度，30min；42度，60min；85度，5min；4度，hold。 ！做miRNA的反轉(zhuǎn)錄時，注意不要忘記內(nèi)參的RT，即一個樣品至少要做目的miRNA和內(nèi)參兩管反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。3、 realtime-PCR實驗miRNA逆轉(zhuǎn)錄完成后得到的cDNA即可進行下一步PCR。在確認引物的特異性后，我們可以進行正式實驗。一般每個樣品至少需要3個平行孔。Realtime PCR體系為（ABI定量PCR

5、儀 需要加ROX dye II， Biorad 定量PCR儀不需要加ROX）：2X SYBR 10 ulROX II 0.4ul （Biorad 不加）Primer 1ulTemplate 1ulH2O 7.6ul （Biorad 8ul）需要注意的幾點：1）在配制PCR體系時，請一定配制總體系，逐步分裝。每步分裝前充分混勻。這一點是PCR平行性的保證。2）配制體系盡量在冰上進行。3）請選用比較準確的槍進行體系配制，并注意體系的冗余。一般來說，配制一整個96孔板的PCR體系，我會配制100個反應(yīng)的總量，保證分裝到最后稍有剩余。PCR 程序：95度，1min；95度，5s；60度，34s（此步在

6、讀取熒光值）。40到45個循環(huán)。4、realtime PCR結(jié)果分析realtime PCR反應(yīng)結(jié)束后返回Ct值，可以利用定量PCR儀軟件自帶的程序進行分析，也可以利用EXCEL表格進行相對定量計算。具體的計算方法：將三個平行孔的數(shù)值拷入到EXCEL表格的相應(yīng)位置，即可自動計算出相對值。注意，第一組樣品的值將被默認為歸一為1。其他的樣品與之相比得出相對值。EXCEL表格公式見附件。二、 miRNA靶基因的預(yù)測miRNA靶基因預(yù)測軟件簡介1、 TargetScan：/首先選擇預(yù)測的物種，如果要預(yù)測小鼠的miRNA和靶基因，則點擊右上角的“Go to

7、TargetScanMouse”。第二個選項可輸入基因名（有時不識別別名），點擊submit即可，此操作可預(yù)測可能靶向該靶基因的miRNA；或者輸入miRNA的名字，點擊submit，此操作可以預(yù)測該miRNA的靶基因。2、 Pictar：/輸入網(wǎng)址后進入pictar主頁，下面有幾個可選用的數(shù)據(jù)庫，一般選用最后兩個數(shù)據(jù)庫即可。點擊進入預(yù)測界面。選擇物種，選擇要預(yù)測的miRNA(注意：如果你感興趣的miRNA在下拉菜單中未列出，則不可預(yù)測，可考慮換用其他軟件)并點擊search for targets of a miRNA或輸入gene ID（注意

8、：與targetscan不同，pictar一般不識別基因名，最好輸入gene號：NM_*）點擊search for all miRNAs predicted to target a gene.進行預(yù)測。3、 Mirbase：http:/www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/search.pl 分別輸入miRNA名或基因名即可進行預(yù)測。其他選項不用更改。預(yù)測結(jié)果的處理和分析我們通常會將三種不同軟件的分析結(jié)果做比較，選取兩種以上軟件預(yù)測的交集部分作為我們候選的靶基因。如果這樣的結(jié)果仍然過多，可以選取三種軟件預(yù)測的交集進行下一步

9、篩選。如果三種軟件預(yù)測的結(jié)果沒有交集部分，可以取并集，然后從中按功能提示進行挑選。三、 miRNA的過表達和敲低1、 過表達過表達miRNA一般可采用兩種方法：a 構(gòu)建過表達載體；b 人工合成成熟miRNA。 a 構(gòu)建過表達載體1）獲取miRNA基因的序列及旁側(cè)序列 進入Ensembl(/index.html)主頁。輸入miRNA名，點擊進入。在export data頁面上選擇輸入5flanking sequence和3flanking sequence 分別為200bp(見下圖)，然后點擊next即可得到包括前體和左右側(cè)翼200bp的序列。2）基于這

10、段序列，我們可以設(shè)計該miRNA的表達序列。引物設(shè)計原則：擴增產(chǎn)物包括前體，并左右各有至少70bp的側(cè)翼序列，長度一般在200bp-500bp。其他同一般引物設(shè)計。載體可以選用任意使用RNA polII識別的啟動子的載體，包括T7，CMV等。常用的是pcDNA3.1，不要帶標簽的。注意：如果miRNA位于cluster中，則擴增長度要控制，避免同時包括兩個或兩個以上的miRNA。完成表達載體的克隆并測序確認后，轉(zhuǎn)入到細胞中進行表達檢測。如果目的miRNA的表達明確，則載體構(gòu)建完成。b合成成熟的miRNA序列查出miRNA的準確序；2、敲低；目前做內(nèi)源性miRNA的敲低一般使用人工合成的m；報告

11、基因?qū)嶒灧椒?；一、miRNA靶基因篩選；熒光素酶報告基因?qū)嶒灒?、熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建；載體質(zhì)粒為經(jīng)過改造的pcDNA3.1，其圖譜見下；NotI.；XhoI；XbaI；靶基因3UTR的獲得；2、熒光素酶實驗；構(gòu)建好熒光素酶報告基因?qū)嶒灪骲 合成成熟的miRNA序列 查出miRNA的準確序列，請公司合成成熟的序列。常用的公司有：上海吉凱；invitrogen等。2、 敲低目前做內(nèi)源性miRNA的敲低一般使用人工合成的miRNA的反義鏈，即成熟miRNA的序列的反義互補序列。如mir-x 序列為 UCACACAACCCACCACCAUUG，則其inhibitor 序列為CAAUGGUGGU

12、GGGUUGUGUGA. 將該序列送交公司合成即可。報告基因?qū)嶒灧椒ㄒ弧?miRNA靶基因篩選熒光素酶報告基因?qū)嶒?、熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建載體質(zhì)粒為經(jīng)過改造的pcDNA3.1，其圖譜見下圖?？捎玫拿盖形稽c為NotI，XhoI及XbaI. 推薦優(yōu)先使用XhoI和XbaI兩個酶切位點。如過不能用，可用NotI.XhoIXbaI靶基因3UTR的獲得。3UTR序列是指從Mrnaz終止密碼子后的第一個堿基開始到mRNA最后一個堿基（通常是polyA結(jié)尾）。模板可采用相應(yīng)物種的cDNA或基因組。在選擇模板時要注意：一般來講，cDNA適于所有的3UTR擴增，但有時3端AT過多導(dǎo)致引物設(shè)計困難時，可以考

13、慮用基因組做模板。但是基因組做模板的前提是靶基因3UTR由一個外顯子組成。相關(guān)信息可以從ensembl中查閱外顯子信息可以知道。一般盡可能全面的擴增3UTR，但如果3UTR過長或引物設(shè)計困難，可以選取包括miRNA結(jié)合位點的一段3UTR。引物設(shè)計的原則同一般引物設(shè)計。2、熒光素酶實驗構(gòu)建好熒光素酶報告基因?qū)嶒灪?，準備開始做報告基因?qū)嶒炃?，你還需要準備以下材料：1）TK質(zhì)粒，作為共轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。2）miRNA的過表達質(zhì)?；蚝铣傻膍iRNA。質(zhì)粒的濃度盡量在500ng/ul以上，合成的miRNA稀釋到20uM。3）狀態(tài)良好的細胞。1） 分細胞。我們常用24孔板進行報告基因?qū)嶒?。分細胞時保證細胞鋪板均

14、勻（搖勻細胞的方法見細胞培養(yǎng)的方法），每孔細胞數(shù)目相當(dāng)。以293ET細胞為例，我們轉(zhuǎn)染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯轉(zhuǎn)染試劑，細胞密度可以稍高些，因為轉(zhuǎn)染后細胞死亡較多。2） 轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時必須配總體系再依次分成小體系。這一步?jīng)Q定著每個孔的平行性和實驗的可重復(fù)性。轉(zhuǎn)染核酸用量為每孔：luc-3UTR 200ng；TK 50ng；miRNA-pcDNA3.1 1ug或合成的miRNA 2.5ul（終濃度100nM）。Vig每孔用量為1ul，lip2000為2ul。轉(zhuǎn)染后4-6h換液。如果用vig轉(zhuǎn)染必須及時換液，否則細胞會尸橫遍野。注意設(shè)立合理的對照，通常用pcDNA3.1（或miR

15、NA NC）代替miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做miRNA的對照。3） 收細胞。轉(zhuǎn)染24-48h可以收取細胞。用生理鹽水或PBS清洗細胞兩次，因293細胞極易脫落，建議操作溫柔，如果對自己的操作沒有自信，可以增大生理鹽水量只洗一次。之后吸干生理鹽水。每孔加入80ul 1Xpassive buffer（裂解液的量可視細胞數(shù)目稍作調(diào)整），室溫搖20min，如果細胞裂解充分會看到白色粘稠狀細胞碎片。如果不馬上測，可連同24孔板凍于-80度，測時再取出解凍。-20度可保存一周。4度可保存一天。4） 測定熒光素酶活性。使用中心實驗室108室turner儀器進行雙熒光素酶的測量。具體儀器操作方

16、法可學(xué)習(xí)相關(guān)教程或請教師兄師姐。我們使用的試劑盒為promega的雙熒光素酶報告系統(tǒng)：bufferII為螢火蟲熒光素酶的底物，測量數(shù)值為我們的報告基因的活性；S&G buffer 作用是淬滅螢火蟲熒光素酶的活性并提供海腎熒光素酶反應(yīng)的緩沖環(huán)境，測定的數(shù)值為內(nèi)參的活性。測定時，取細胞裂解液8ul到96孔板中（專用的96孔板）上機測量。每種底物每孔加30ul。3、結(jié)果分析測定熒光素酶后會返回三個值：螢火蟲熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性及兩者的比值。比值將作為最后的分析數(shù)據(jù)，反映了該孔報告基因的相對活性。通常將對照歸一為1，實驗組與其相比取相對值。此相對值用于最后作圖和統(tǒng)計分析。歸一方法和作

17、圖請自學(xué)EXCEL或請教其他同學(xué)。GFP報告基因?qū)嶒?、 GFP報告基因質(zhì)粒構(gòu)建：與熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建方法同。僅僅是用GFP取代luciferase。2、 實驗方法及結(jié)果分析1） 轉(zhuǎn)染。一般使用12孔板進行實驗，每孔轉(zhuǎn)染量：GFP-3UTR，200ng-500ng；miRNA，1ug 質(zhì)粒或100nM 合成的miRNA。2） 轉(zhuǎn)染48h后，用熒光顯微鏡照相，觀察綠色熒光的強度；收取細胞，用GFP抗體檢測GFP表達水平。建議做三個平行孔，結(jié)果需要進行統(tǒng)計學(xué)分析以判斷差異是否顯著。二、 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控分析1、 啟動子的預(yù)測、確認啟動子是指RNA聚合酶識別并結(jié)合的DNA序列，并包括促進這一過程的

18、調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點。啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點附近，而真核基因的轉(zhuǎn)錄起始位點通常需要實驗進行確定。5RACE是確定基因轉(zhuǎn)錄起始位點的經(jīng)典方法。在不知道轉(zhuǎn)錄起始位點時，我們也可以對啟動子進行預(yù)測。預(yù)測基因啟動子的軟件有：NCBI promoter scan (/molbio/proscan/)等。2、 轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測通常我們比較關(guān)心哪些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控我們感興趣的基因，這就涉及到該基因的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測和鑒定。轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測軟件有：SignalScan /molbio/signal/TF search http:/www.cbrc.jp/research/db/TFSEAR