單味關(guān)木通和配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯腎毒性的比較研究-

1、單味關(guān)木通和配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯腎毒性的比較研究張娜,謝鳴北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)學(xué)科(北京,100029摘要:目的:觀察單味關(guān)木通、配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯給藥后,大鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)及腎臟白介素-1(IL-1、白介素-6(IL-6水平變化。方法:大鼠隨機(jī)分為單味關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯組、正常對照組三組,其中前兩組分別按6 gkg-1、17.5 gkg-1(其中含關(guān)木通6 gkg-1給以相應(yīng)方藥水提液灌胃,正常對照組給予等量飲用水,連續(xù)8周。測定大鼠測血、尿生化指標(biāo)及腎臟組織勻漿中IL-1、IL-6水平,觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果:兩種水提液連續(xù)給大鼠灌胃8周,均可見明顯的腎功能改變,腎臟組

2、織勻漿中IL-1、IL-6水平比正常對照組均明顯升高,組織切片顯示以炎癥細(xì)胞浸潤為主的腎小管間質(zhì)病變;龍膽瀉肝湯組的腎臟損傷較單味關(guān)木通組輕。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)劑量的關(guān)木通與配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯均可引起腎功能損傷,腎臟損傷以炎癥細(xì)胞浸潤為主的腎小管間質(zhì)病變和伴有高水平的IL-1與IL-6為特征。推測關(guān)木通及其龍膽瀉肝湯引起的腎毒性涉及免疫誘導(dǎo)的炎性損傷機(jī)制;復(fù)方龍膽瀉肝湯腎毒性較低,可能與其減輕單味關(guān)木通引起的免疫誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。關(guān)鍵詞:關(guān)木通 龍膽瀉肝湯 腎毒性炎癥因子目前研究表明一定劑量的單味關(guān)木通和配伍關(guān)木通的中藥復(fù)方可引起大鼠不同程度的腎損害14,龍膽瀉肝湯方中含有木通,在中國藥典(20

3、05年版頒布前,臨床或成藥生產(chǎn)配方曾涉及到關(guān)木通的使用。已知復(fù)方是按中醫(yī)輔反臣制原理由中藥配伍而成的,單味中藥與其所配伍的復(fù)方在毒效學(xué)方面存在著復(fù)雜的關(guān)系。目前,單味關(guān)木通與配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯的腎毒性差異及其腎損傷機(jī)制還不甚清楚。本文觀察了大鼠給予單味關(guān)木通和配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯8周后的腎功能、組織形態(tài)學(xué)及腎臟IL-1、IL-6水平的變化。但對關(guān)木通及其復(fù)方的腎毒性是否與細(xì)胞免疫因素有關(guān),尚未有報(bào)道,故本文觀察單味關(guān)木通與配伍關(guān)木通的龍膽瀉肝湯給藥后,大鼠腎功能、組織形態(tài)學(xué)及腎臟IL-1、IL-6水平的變化,考察關(guān)木通及龍膽瀉肝湯與細(xì)胞免疫機(jī)制可能的關(guān)系。1.材料1.1 藥物(1關(guān)木通水

4、提液:單味關(guān)木通;(2龍膽瀉肝湯:由關(guān)木通36 g、龍膽草6 g、黃芩9 g、梔子9 g、澤瀉12 g、車前子9 g、當(dāng)歸3 g、生地黃9 g、柴胡6 g、生甘草6 g十味藥所組成。全部中藥飲片購自北京市鶴延齡中藥飲片公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系劉- 1 -春生教授鑒定均為正品。藥液制備:分別用相當(dāng)于藥材量7倍體積的冷水浸泡藥材1h,加熱至沸,煎煮30 min,傾出藥液,殘?jiān)偌尤?倍體積的水,煎煮20 min;合并兩次藥液,過濾;水浴濃縮,制成200%濃度的煎液(含2g生藥/ml,4放置備用。1.2 動(dòng)物SD雄性大鼠30只,體重150±10g,SPF/VAF級,許可證號SC

5、XK(京2002-0003,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.3 試劑血肌苷(Scr、尿素氮(BUN測定試劑由北京利德曼試劑公司提供;尿蛋白定量試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。IL-1、IL-6放免試劑盒,由中國海軍總醫(yī)院提供。1.4主要實(shí)驗(yàn)儀器CX-4全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司;WFZ800-D2型紫外可見分光光度計(jì)(北京第二光學(xué)儀器廠;SN-695B型智能放免測量儀(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司2.方法2.1 分組及給藥大鼠隨機(jī)分為關(guān)木通組、龍膽瀉肝湯組與正常對照組,每組10只。關(guān)木通組與龍膽瀉肝湯組大鼠分別按6 gkg-1、17.5 gkg-1(其中含關(guān)木通6 gkg-

6、1劑量予以單味關(guān)木通水提液與龍膽瀉肝湯水提液,正常對照組予以等量飲用水,每日灌胃1次,連續(xù)8周。給藥期間大鼠自由攝食飲水。2.2 指標(biāo)檢測于灌胃第8周后,代謝籠內(nèi)留取24小時(shí)尿液;水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血;并快速取出300mg左右的腎臟組織以1:9重量比加入預(yù)冷生理鹽水于勻漿器中勻漿,將未抗凝血與組織勻漿分別以3000rpm/min離心15min,取血清及組織上清液。其他腎組織4%多聚甲醛溶液中固定,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后行HE染色,光鏡檢查。Scr、BUN采用全自動(dòng)生化分析儀法測定;24小時(shí)尿蛋白定量采用CBB法測定;IL-1、IL-6均采用放免法測定,嚴(yán)格按試劑盒說明書方法進(jìn)行。

7、2.3組織病理學(xué)檢查每組10個(gè)樣本,每樣本觀察2張切片,每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)皮質(zhì)區(qū)視野(×200,取平均值。腎小管間質(zhì)損傷(TI根據(jù)腎小管擴(kuò)張和(或萎縮,腎間質(zhì)纖維化,炎癥細(xì)胞浸潤累及小管及間質(zhì)的程度進(jìn)行評分5:腎小管無明顯改變.間質(zhì)中無或極少見炎癥細(xì)胞,無纖維化組織增生沒有腎皮質(zhì)損害,記0分;腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮,變性,壞死輕,呈灶性分布,間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織增生病變灶性,范圍<25%,記1分;腎小管上皮細(xì)胞輕中度萎縮,變性,壞死輕,炎癥細(xì)胞浸潤,纖維組織中度增生病變范圍 26% 50%,記2分;腎小管上皮細(xì)胞萎縮,變性,壞死重,片狀分布,大量彌散或聚集成灶的炎癥

8、細(xì)胞浸潤,纖維組織增生呈多灶或網(wǎng)狀成片,病變范圍>50%,記3分。- 2 -2.3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S表示,采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn),全部數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理。3.結(jié)果3.1 各組大鼠血清Scr、BUN與尿蛋白含量結(jié)果見表1。從表1可以看出,與正常對照組比較,關(guān)木通組大鼠血清Scr、BUN水平及尿蛋白水平明顯升高,有極顯著性差異(P<0.01;龍膽瀉肝湯組大鼠血清Scr水平及尿蛋白水平明顯升高,有顯著性差異(P<0.05,血清BUN水平無顯著差異(P<>0.05明顯變化。與關(guān)木通組比較,龍膽瀉

9、肝湯組大鼠血清Scr、BUN水平及尿蛋白水平降低,有顯著或極顯著性差異(P<0.05和P<0.01。x±S,n=10表1.各組大鼠血清Scr、BUN與尿蛋白水平比較(組別 Scr(mmol·L-1 BUN(mmol·L-1uPro(g·L-1正常對照組 38.79±6.85 6.06±0.44 4.43±1.26 關(guān)木通組 57.91±11.81* 7.58±2.61* 9.10±1.70* 龍膽瀉肝湯組48.68±12.03*& 6.07±0.55 &a

10、mp; 6.15±2.07 *&&*P<0.05,*P<0.01,與正常對照組比較; & P<0.05,&&P<0.01,與關(guān)木通組比較。3.2 各組大鼠腎臟勻漿中IL-1、IL-6水平結(jié)果見表2。從表2可以看出,與正常對照組比較,關(guān)木通組與龍膽瀉肝湯組大鼠腎臟勻漿中IL-1、IL-6水平都明顯升高,有顯著或極顯著性差異(P<0.05和P<0.01;與關(guān)木通組比較,龍膽瀉肝湯組大鼠腎臟組織IL-1和IL-6水平均降低,其中IL-1降低明顯,有顯著性差異(P<0.05。x±S,n=10表2.各組

11、大鼠腎臟勻漿中IL-1、IL-6水平比較(龍膽瀉肝湯組0.321±0.046*&24.706±8.424*P<0.05,*P<0.01,與正常對照組比較; & P<0.05,&&P<0.01,與關(guān)木通組比較。3.3各組大鼠腎組織病理學(xué)改變各組大鼠腎組織光鏡下變化可見:正常對照組大鼠腎臟組織鏡下腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常,偶見輕度細(xì)胞空泡變性;關(guān)木通組大鼠腎小管間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤,大鼠上皮細(xì)胞重度空泡變性,近曲小管廣泛變性壞死,并偶見有腎小球壞死的現(xiàn)象,腎間質(zhì)可觀察到纖維細(xì)胞增生現(xiàn)象;龍膽瀉肝湯組大鼠腎小管輕度擴(kuò)張,呈條帶

12、狀分布,腎小管間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。- 3 -各組大鼠腎組織病理損害(TI定量評分結(jié)果見表3。從表3中可以看出,與正常對照組比較,關(guān)木通組與龍膽瀉肝湯組大鼠腎小管間質(zhì)病理損害積分明顯減低,有極顯著性差異(P<0.01;與關(guān)木通組比較,龍膽瀉肝湯組大鼠腎小管間質(zhì)病理損害積分減低,有顯著性差異(P<0.01。x±S,n=10表3.各組大鼠腎小管間質(zhì)病理損害(TI定量分析(組別Lesion score正常對照組0.14±0.097關(guān)木通組 1.64±0.412*龍膽瀉肝湯組0.77±0.231*&&*P<0.05,*P<0.

13、01,與正常對照組比較; & P<0.05,&&P<0.01,與關(guān)木通組比較。4.討論我們曾用單味關(guān)木通(6gkg-1和含相同劑量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯(17.5 gkg-1連續(xù)給大鼠用藥12周,給藥第4周可觀察到腎臟損傷的現(xiàn)象,隨著用藥時(shí)間的延長,損傷加重。本實(shí)驗(yàn)在該腎毒劑量條件下,比較觀察了單味關(guān)木通和含等量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯連續(xù)給大鼠灌胃8周時(shí)的腎功能,腎臟組織形態(tài)學(xué)改變及腎臟勻漿中IL-1、IL-6水平。本實(shí)驗(yàn)觀察到單味關(guān)木通和含相同劑量關(guān)木通的龍膽瀉肝湯組大鼠血清BUN、Scr與尿蛋白均顯著升高,表明該實(shí)驗(yàn)劑量的關(guān)木通與龍膽瀉肝湯連續(xù)給藥8周的確可引起

14、腎功能的損害;二組給藥大鼠的腎組織有不同程度的腎間質(zhì)局灶性炎細(xì)胞浸潤及少量纖維組織增生也為關(guān)木通及其復(fù)方的腎損傷作用提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。曾有報(bào)道5 gkg-1的關(guān)木通連續(xù)給大鼠灌胃90天,血清BUN、Scr有所升高,腎間質(zhì)有灶性炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象6,臨床報(bào)道在部分服用關(guān)木通所致腎小管間質(zhì)腎病的病例中,有腎間質(zhì)纖維化同時(shí)存在局灶性單核炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象 7,和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,進(jìn)一步表明關(guān)木通及含關(guān)木通龍膽瀉肝湯引起的腎損傷以腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤及伴纖維增生為特點(diǎn);龍膽瀉肝湯引起的腎病理改變與單味關(guān)木通相近,提示該方的腎毒性與關(guān)木通有關(guān)。腎小管上皮細(xì)胞在某些致病因素刺激下產(chǎn)生IL-1,IL-1為強(qiáng)效的致炎

15、性細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞及炎癥細(xì)胞增殖,表達(dá)粘附分子受體以及釋放炎性介質(zhì),即可介導(dǎo)急性時(shí)相反應(yīng),又與炎癥后期纖維化的形成過程有關(guān)8。IL-6是淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞因子,可由腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成和分泌,腎小管間質(zhì)損傷,可能刺激自身固有細(xì)胞和炎癥細(xì)胞合成和釋放IL-6,使小管間質(zhì)局部形成高濃度IL-6 8,9。本次研究確也發(fā)現(xiàn),單味關(guān)木通和含關(guān)木通的龍膽瀉肝湯服用8周的大鼠腎臟中的IL-1與IL-6水平顯著升高,表明腎損傷與免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。進(jìn)一步推測關(guān)木通及龍膽瀉肝湯引起腎損傷的機(jī)制可能由腎毒性成分作用于小管間質(zhì),刺激小管間質(zhì)的固有細(xì)胞產(chǎn)生IL

16、-1與IL-6等炎性介質(zhì),造成炎性細(xì)胞的浸潤及激活生成大量炎性介質(zhì),進(jìn)一步加重腎臟損傷所致。本實(shí)驗(yàn)中還觀察到,單味關(guān)木通組大鼠的腎功能與腎臟病理損傷及腎IL-1與IL-6水- 4 -平異常升高均較龍膽瀉肝湯組嚴(yán)重,表明實(shí)驗(yàn)劑量的單味關(guān)木通的腎毒性作用比含等量關(guān)木通的復(fù)方龍膽瀉肝湯強(qiáng)。提示龍膽瀉肝湯中的多味藥配伍對單味關(guān)木通有一定減毒作用,其減毒作用可能與其減輕腎臟免疫誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān),有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn):2. 馬紅梅,張伯禮,當(dāng)歸四逆加吳茱萸生姜湯和關(guān)木通的短期腎毒性實(shí)驗(yàn)研究.中藥新藥與臨床藥理J.999, 10(3:651-6535 . Pham K, Smoyer WE, Arch

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19、Dan Xie Gan DecoctionZhang Na,Xie Ming(Department of formulaology ,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing, China .100029AbstractObjective:To observe the renal function, histology and the levels of interleukin-1(IL-1, interleukin-6(IL-6 in rats administered with Aristolochia Mansh

20、riensis Kom (AMK and Long Dan Xie Gan decoction(LDXGD containing AMK. Method:Divided SD rats into control, AMK and LDXGD groups (n = 10 per group at random and administrated orally for 8 weeks with distilled water, AMK (6g/kg/d and LDXGD(17.5g/kg/d, containing AMK 6g/kg/d, respectively. Measured renal functional parameters in serum, urine and IL-1, IL-6 in renal homogenate, and observe renal histologic lesions at the end of 8 weeks. Result: Two kinds of water abstract induced significantly renal injury in rats,IL-1,