四種南方根結(jié)線蟲生防菌菌株的篩選研究 第三稿

1、四種南方根結(jié)線蟲生防菌菌株篩選研究四種南方根結(jié)線蟲生防菌菌株篩選研究摘 要線蟲的生物防治是近幾年植保領(lǐng)域的熱點之一，本文從采自洛陽市李樓蔬菜基地的根際土壤樣本中分離、篩選出了4株對南方根結(jié)線蟲具有明顯拮抗效果的生防細(xì)菌菌株，并對這4株生防菌進(jìn)行了一系列的生理生化指標(biāo)檢測。初步檢測結(jié)果如下：假單胞菌屬（18-4）、巨大芽胞桿菌屬（15-5）、蠟樣芽胞桿菌屬（20-7）、枯草芽孢桿菌屬（2-1）。該結(jié)果為下一步開發(fā)防治南方根結(jié)線蟲的生物制劑提供了理論依據(jù)，利于減少傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥過度使用而導(dǎo)致的“3R”問題。關(guān)鍵詞：根結(jié)線蟲；生物防治；根際生防細(xì)菌；篩選； 1 引言通過有關(guān)植物線蟲病害知識的問卷調(diào)查發(fā)

2、現(xiàn)，現(xiàn)在農(nóng)戶中對于植物寄生線蟲所導(dǎo)致的病害中了解程度不夠，對于線蟲病的危害沒有一個清晰的認(rèn)識，而相反植物寄生線蟲已經(jīng)是導(dǎo)致植物病害的第二大殺手，不僅能引起植物線蟲病，同時他也能為植物病原細(xì)菌和真菌提供侵染途徑，也是很多植物病毒的傳播介體。傳統(tǒng)的防治線蟲病害的方法一般都是采用傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)方法防治植物寄生線蟲具有防治好，見效快的特點，但是不可避免的污染了自然環(huán)境，因此生物防治越來越引起廣泛的關(guān)注。利用對植物寄生線蟲具有明顯拮抗效果的生防細(xì)菌對植物寄生線蟲進(jìn)行防治是當(dāng)今新的研究熱點。種類繁多的細(xì)菌從寄主植物、線蟲體、線蟲的卵、土壤中上被分離，不同的作用方式被報道。自然界中存在有許多對植物有益的

3、細(xì)菌群落，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，充分利用這些細(xì)菌的生物學(xué)潛力來控制植物寄生線蟲的種群數(shù)量將有助于減少化肥和農(nóng)藥投入、促進(jìn)植物生長、減輕對環(huán)境的污染，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)高效的發(fā)展。本研究首先從蔬菜的根際土壤中分離細(xì)菌，通過室內(nèi)離體實驗的方法驗證其防效，同時對線蟲有拮抗作用的細(xì)菌進(jìn)一步鑒定。本次研究的結(jié)果能在一定程度上為開發(fā)新型防治線蟲的生物制劑提供理論依據(jù)。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 土壤樣本與供試線蟲來源及處理土壤樣本采自洛陽市李樓蔬菜基地的蔬菜大棚中，樣本土壤均為蔬菜大棚的根際土壤。在蔬菜收獲后，采用十點取樣法從515 cm的土層中采集作物根際土壤，共采集30份土樣，土樣自然風(fēng)干后過200

4、目篩，然后封裝于密封袋中并編號，置于4 冰箱保存?zhèn)溆?。從樣本土壤中分離得到細(xì)菌菌株50種，其中對植物寄生線蟲具有拮抗效果的菌株有4種，編號分別為2-1、15-5、18-4、20-7。將其接種于LB固體培養(yǎng)基上，置于4冰箱冷藏室保存?zhèn)溆?。供試線蟲為南方根結(jié)線蟲，保存于本實驗室中。2.1.2 供試培養(yǎng)基培養(yǎng)基具體配方如下表（表1）所示：表1 供試培養(yǎng)基種類及成分培養(yǎng)基名稱成 分LB液體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g、酵母膏 5g、NaCl 5 g、蒸餾水1000 mLLB固體培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g、蒸餾水1000 mL、酵母提取物5 g、NaCl 5 g、瓊脂粉18 g休和利夫森二氏培養(yǎng)基蛋白胨2 g、N

5、aCl 5 g、K2HPO4 0.2 g、葡萄糖 10 g、瓊脂20 g、溴百里酚藍(lán)1% 水溶液3 mL、蒸餾水1000 mL葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，K2HPO4 5.0 g，蒸餾水1000 mL淀粉培養(yǎng)基在 LB 固體培養(yǎng)基中加入2 g 可溶性淀粉檸檬酸鹽培養(yǎng)基NH4H2PO4 1 g，K2HPO4 1 g，NaCl 5 g，MgSO4 0.2 g，檸檬酸鈉2 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL。2.2 試驗方法2.2.1 根際細(xì)菌的分離根際土壤細(xì)菌的分離一般采用稀釋涂平板法，具體實驗方法步驟如下：（1）稀釋液的制備：稱取土樣5 g，并將土壤磨成粉末狀，

6、放入50 mL去離子水中，搖床上振蕩30 min，靜置使澄清，用無菌槍頭吸取上清液100 µL并加入900 µL無菌水中，用無菌水稀釋為10-1 10-2 10-3 10-410-5 五個濃度梯度并保存。（2）培養(yǎng)：吸取各濃度稀釋液200uL涂布于LB固體培養(yǎng)基制成平板，拿封口膜封口后倒置于恒溫箱內(nèi)，37培養(yǎng)24h。（3）挑菌落：挑取單細(xì)菌菌落于新的LB培養(yǎng)基中，37恒溫培養(yǎng)24h。（4）菌株的純化：盡量挑取形態(tài)不同的單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，37、200r/min搖床振蕩培養(yǎng)，然后用平板劃線分離法進(jìn)行純化，直到獲得純培養(yǎng)。2.2.2 寄生線蟲拮抗細(xì)菌的篩選取純化的細(xì)菌接種

7、于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，37 、200r/min搖床中培養(yǎng)24h，然后于無菌超凈工作臺上用移液槍取600 µL培養(yǎng)液于Landy培養(yǎng)基（加100 µL KH2PO4、1000 µL 40%葡萄糖）中，37 搖床中震蕩培養(yǎng)48 h，取出后靜置，取上清液于離心管中，10000 r離心10 min，用移液槍取上清液于凹面皿、備用10。挑取2040條線蟲于凹面皿上清液中，置于26 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，處理12 h、24 h和48 h后分別觀察和計數(shù)。由于供試線蟲中存在假死現(xiàn)象，我們必須在解剖鏡下用自制挑針刺激線蟲，如果線蟲個體僵直不動，則可以記做死亡，若呈彎曲狀則為假死狀

8、態(tài)。生測結(jié)果計算參照陳立杰等人的方法11。線蟲死亡率 (%) = 死亡線蟲數(shù)供試線蟲數(shù)×100%2.2.3 細(xì)菌各項生理生化指標(biāo)的鑒定共選取甲基紅（VP）、乙酰甲基甲醇（VP）、吲哚的產(chǎn)生（細(xì)菌對色氨酸的利用）、淀粉水解、葡萄糖的氧化發(fā)酵、產(chǎn)氨實驗、檸檬酸鹽的利用這七項指標(biāo)檢測，參照微生物學(xué)實驗指導(dǎo)中提到的實驗方法，對待測菌株進(jìn)行該七項指標(biāo)的鑒定試驗12。3 結(jié)果分析3.1 土壤細(xì)菌的分離和純化采用稀釋平板法對30份土壤進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化，純化細(xì)菌劃線培養(yǎng)保存。由下圖（圖1）顯微鏡觀察可以看出所挑選出的4個植物寄生線蟲的拮抗細(xì)菌的單菌落形態(tài)各不相同，顏色也都不一致，每一種細(xì)菌都具有

9、各自獨特的形態(tài)特征：2-1細(xì)菌單菌落呈微橢圓形，菌落整體顏色較為一致，為淺黃色，邊緣整齊，表面無褶皺，菌落較為濕潤，稍渾濁，呈半透明狀；15-5細(xì)菌單菌落呈圓形，菌落整體顏色一致，為從中心到邊緣皆為灰黑色，邊緣有突起，表面無褶皺，菌落較為濕潤，不透明；18-4細(xì)菌單菌落呈圓形，菌落中心為灰黑色或黑色，由中心向邊緣顏色逐漸變淺，邊緣呈淺黃色，菌落邊緣呈不規(guī)則形狀，有突起，表面有褶皺，菌落中心不透明，邊緣為半透明狀，菌落中心較邊緣部分略厚；20-7細(xì)菌菌落不規(guī)則，菌株呈發(fā)散性生長，無明顯的菌落中心，菌落淺黃色。菌落邊緣向四周發(fā)散生長，菌落透明。 圖1主要拮抗細(xì)菌單菌落3.2 拮抗細(xì)菌的篩選將分離得

10、到的50個菌株分別進(jìn)行實驗室內(nèi)寄生線蟲離體抗性篩選： 用37 200 r/min恒溫?fù)u床條件下培養(yǎng)48h得到細(xì)菌發(fā)酵上清液，將線蟲置于該發(fā)酵上清液中放在26恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h、24 h、48 h后分別觀察結(jié)果，結(jié)果表明，不同細(xì)菌發(fā)酵液對線蟲的抑制效果不同，其中2-1、15-5、18-4、20-7這4個菌株的發(fā)酵液對線蟲的抑制效果最為明顯，四種細(xì)菌在48h內(nèi)作用效果如下表（表2）：表2 拮抗細(xì)菌菌株上清液對植物寄生線蟲的活性處理線蟲死亡率Nematode mortality(）Treatment12 h24 h48 h2-194.44±0.94100.00±0100.

11、00±015-580.56±1.1396.44±2.36100.00±018-460.78±1.3595.00±2.15100.00±020-750.78±1.4591.66±1.95100.00±0CK0.00±00.00±00.00±0注：（1）CK：無菌水對照；（2）LANDY培養(yǎng)基上重復(fù)實驗5次4種細(xì)菌的發(fā)酵上清液在48h內(nèi)對線蟲的致死率均達(dá)到了100%。編號15-5、18-4、20-7在12 h 的時候相對防治效果分別為：80.56%、60.78%、50.

12、78%，而編號為2-1的菌株的上清發(fā)酵液在12 h 內(nèi)對植物南方根結(jié)線蟲的致死率高達(dá)94.44%。得到的4株對植物寄生線蟲具有拮抗作用的細(xì)菌中編號為2-1的細(xì)菌拮抗效果最為明顯。防治效果同時表明這4個拮抗細(xì)菌菌株在接種后024h內(nèi)對植物寄生線蟲的防治效果呈上升趨勢，由此表明這些拮抗細(xì)菌菌株對植物寄生線蟲的防控具有較長的持效期。3.3 主要拮抗細(xì)菌革蘭氏染色革蘭氏染色法：對各主要拮抗細(xì)菌樣品的染色玻片在顯微鏡的油鏡下觀察結(jié)果如圖（圖2）。圖2拮抗細(xì)菌革蘭氏染色后油鏡觀察圖表3 拮抗細(xì)菌革蘭氏染色編號革蘭氏染色顏色鑒別結(jié)果（+/-）15-5紫色+2-1紫色+18-4紅色-20-7紫色+注：“”代表

13、陽性；“”代表陰性根據(jù)表2的結(jié)果說明：植物寄生線蟲拮抗細(xì)菌既有革蘭氏陽性細(xì)菌，又有革蘭氏陰性細(xì)菌,其中15-5、20-7、2-1為革蘭氏陽性， 18-4為革蘭氏陰性。革蘭氏陽性細(xì)菌占75%，革蘭氏陰性細(xì)菌占25%。初步判斷自然界中對植物寄生線蟲有拮抗作用的細(xì)菌大多為革蘭氏陽性菌。3.4 細(xì)菌的生理生化特征鑒定共有待測菌株4種，編號分別為2-1、15-5、18-4、20-7分別測定其甲基紅（VP）、乙酰甲基甲醇（VP）、吲哚的產(chǎn)生（細(xì)菌對色氨酸的利用）、淀粉水解、葡萄糖的氧化發(fā)酵、產(chǎn)氨實驗、檸檬酸鹽的利用這7項生理生化特征，得到結(jié)果如下表（表3）所示由下表可知：在已經(jīng)測定的4株對植物寄生線蟲具有

14、明顯拮抗效果的細(xì)菌菌株中，甲基紅實驗除了18-4外都呈現(xiàn)陰性結(jié)果；乙酰甲基甲醇的實驗結(jié)果均為陰性；吲哚的產(chǎn)生實驗除了2-1為陽性外，其余樣本均為陰性；葡萄糖的氧化發(fā)酵實驗4種菌均為氧化型；2-1和15-5在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上呈陽性反應(yīng)，18-4和20-7在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上不能正常生長，不能利用檸檬酸鹽。對照以上7項生理生化特征的鑒定結(jié)果，查閱伯杰明細(xì)菌鑒定手冊，該4個菌株的鑒定結(jié)果為：單胞菌屬（18-4）、巨大芽胞桿菌屬（15-5）、蠟樣芽胞桿菌屬（20-7）、枯草芽孢桿菌屬（2-1）.表4 待測細(xì)菌菌株生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果生理生化特征菌株編號甲基紅乙酰甲基甲醇吲哚淀粉水解葡萄糖的氧化發(fā)酵產(chǎn)氨實

15、驗檸檬酸鹽的利用2-1-+O+15-5-+O+18-4+-O+-20-7-+O+-符號：+，90%菌株陽性；-，90%菌株陰性；d，1189%菌株陽性；+w，陽性弱反應(yīng)；O，氧化型；F，發(fā)酵型。部分指標(biāo)實驗結(jié)果如下圖（圖3）所示：圖3 甲基紅（VP）實驗結(jié)果4 結(jié)論與討論本研究采用稀釋平板法13對所采取的土樣進(jìn)行細(xì)菌菌株分離與純培養(yǎng)，最終得到50株形態(tài)或顏色各不相同的單菌落，說明植物的根際土壤中存在著種類繁多的微生物品種。通過試驗篩選出4株對植物寄生線蟲具有明顯拮抗作用的細(xì)菌編號為2-1、15-5、18-4、20-7，這4個菌株的發(fā)酵液對線蟲的抑制效果最為明顯，這4種細(xì)菌的發(fā)酵液在48h內(nèi)對線

16、蟲的致死率均達(dá)到100%。其中編號為2-1的菌株的發(fā)酵上清液在12h內(nèi)對植南方根結(jié)線蟲的致死率高達(dá)94.44%，具有較好的防治效果和防治潛力。革蘭氏染色結(jié)果：除了18-4為革蘭氏陰性外，其余3種細(xì)菌均為革蘭氏陽性細(xì)菌，由此可以初步的判斷自然界中存在的拮抗植物寄生線蟲的細(xì)菌大多為革蘭氏陽性菌。通過接下來對其生理生化指標(biāo)的測定，對該四個菌株的鑒定結(jié)果為假單胞菌屬（18-4）、巨大芽胞桿菌屬（15-5）、蠟樣芽胞桿菌屬（20-7）、枯草芽孢桿菌屬（2-1）。前人研究證實，植物寄生線蟲拮抗細(xì)菌有芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌等。本實驗的拮抗能力測定實驗結(jié)果表明，菌株2-1能有效的控制植物寄生根結(jié)線蟲的種群數(shù)

17、量，同時控制時效較長。不過盡管如此，但是該菌株是否能開發(fā)為相應(yīng)的生物制劑進(jìn)行商品化生產(chǎn)，還需經(jīng)過進(jìn)一步的研究去探究；而且該拮抗菌株對線蟲的作用方式和作用機理也有待進(jìn)一步的探究。因為盡管在實驗室條件下該菌株對植物寄生線蟲具有良好的生物防治作用16,17，當(dāng)時實際應(yīng)用效果應(yīng)該結(jié)合大田中土壤微生物數(shù)量，土壤理化性質(zhì)，以及環(huán)境條件等各方面的條件來綜合考慮18。只有綜合考慮各方面條件，制定合理的使用方法與使用數(shù)量，才能獲得最佳的防治效果。因此，本實驗雖然篩選出了具有明顯拮抗作用的細(xì)菌，但是也有不足之處。由于室內(nèi)試驗測定沒有考慮大田環(huán)境中的土壤理化性質(zhì)，作物因素以及其他植物的影響等條件，若進(jìn)一步深入的研究

18、其作用機理及方式，則對土壤跟及線蟲的生物防治工作會產(chǎn)生很大的啟示。為了更有效的防治植物寄生線蟲病害，我們必須運用有害生物綜合防治策略（IPM），綜合考慮環(huán)境，作物，病原物三者間的關(guān)系，制定有效的綜合防治策略，綜合合理的總用各種防治手段，達(dá)到最大的經(jīng)濟，環(huán)境收益，也響應(yīng)了我國21世紀(jì)植物保護(hù)工作的綜合方針；響應(yīng)了當(dāng)今潮流，采用高效、持久的生物防治手段對植物線蟲病害進(jìn)行防治。參考文獻(xiàn)1 安川,永春柑橘根部15種線蟲記述及線蟲分離新技術(shù)的研究D.廈門.廈門大學(xué)2009.2 許志剛.普通植物病理學(xué)M.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009:219-220. 3 鐘爽,曾會才,等.香蕉植物線蟲病的防治技術(shù) C.

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