中國藥典微生物限度檢查方法驗證方案

1、人工牛黃 甲硝噪膠囊微生物限度檢查方法驗證方案起草部門：QC組簽名：日期：審核部門：QC組簽名：日期：部門：質(zhì)量部簽名：日期：批準質(zhì)量負責人簽名：日期：質(zhì)量部 頒發(fā)本文件根據(jù)需要應分發(fā)于以下部門：01質(zhì)量部下表用于記錄修訂/變更主要內(nèi)容及歷史文件編號修訂原因修訂日期TS-VP-4201-00按GMP（2010年修訂版）要求新制定1 .概述2 .驗證目的和范圍3 .組織及職責4 .驗證進度計劃表5 .驗證所需要的儀器設備及相關(guān)文件的確認6 .驗證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗樣品的確認7 .驗證項目和驗證方法7.1 試驗菌株7.2 需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證的菌液制備7.3 需氧菌

2、總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證-常規(guī)傾注平皿法7.4 需氧菌總數(shù)檢查方法驗證一離心沉淀-薄膜過濾法7.5 控制菌檢查方法驗證一離心沉淀-薄膜過濾法8 .偏差與漏項控制9 .驗證報告會審1 .概述我公司生產(chǎn)品種人工牛黃甲硝n坐膠囊，產(chǎn)品微生物限度檢查項目為需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、以及 大腸埃希菌檢查和沙門菌檢查。參照中國藥典2015版四部附錄1105:微生物計數(shù)法，以及 1106:控制菌檢查法的規(guī)定， 本公司對該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法予以驗證。通過驗證以確認所采用的微生物限度檢查方法適用。人工牛黃甲硝嚏膠囊處方中含有甲硝嚏、人工牛黃以及常用輔料成分，文獻資料介紹甲硝嚏對細菌有抑菌

3、特性，對霉菌和酵母菌無抑菌活性。甲硝n坐在水中微溶，可以通過離心沉淀-薄膜過濾法去除其對微生物生長的影響。本驗證方案通過試驗菌株的回收率測試，首先確認常規(guī)傾注平皿法是否適用于本品的微生物限度檢查；如常規(guī)傾注平皿法不適用，則進一步驗證可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的微生物限度檢查。本驗證方案根據(jù)樣品特性制定微生物限度檢查方法和檢驗條件，按制定的方法進行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標準。2 .驗證目的和范圍驗證該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法的適用性，對其有效性進行評價，保證檢驗結(jié)果的可靠性。本驗證方案采用3批按GM廖求組織生產(chǎn)的人工牛黃甲硝嘎膠囊，進行微生物限度檢查方法

4、的驗證。 3.組織及職責1.1 驗證方案和驗證報告的起草、審核、批準驗證方案由質(zhì)量部 QC組負責起草，由質(zhì)量部審核，最終由質(zhì)量負責人批準。驗證方案實施完成后， 由QC組負責匯總微生物限度檢查法驗證的結(jié)果、撰寫報告，由質(zhì)量部審核，最終由質(zhì)量負責人批準報告。1.2 驗證方案的培訓驗證方案在經(jīng)質(zhì)量負責人批準后，由QC組組長對本次驗證實施的相關(guān)人員組織培訓工作，并將該次的培訓記錄歸檔。1.3 驗證方案實施過程中的變更和偏差驗證方案實施過程中如有變更和偏差，質(zhì)量負責人應當組織進行評估并采取相應的控制措施。1.4 驗證工作小組成員表姓名部門及職務職責黃漢新質(zhì)量負責人/質(zhì)量受權(quán)人負責驗證方案及報告的批準胡建

5、新質(zhì)量部QA組長審核驗證方案、審核驗證報告并協(xié)調(diào)工作曾鳳敏質(zhì)刊QC組長負責驗證方案審核、實施、匯總報告及培訓工作劉紅華質(zhì)量部QC負責驗證方案起草、具體實施、報告工作4 .驗證進度計劃表本次微生物限度檢查方法驗證的計劃安排時間是2015年12月至2016年1月5 .驗證所需要的儀器設備及相關(guān)文件的確認5.1 主要檢驗儀器設備確認表序號儀器設備名稱型號編號校準單位校準日期有效期至1電子天平2生化培養(yǎng)箱3生化培養(yǎng)箱4生化培養(yǎng)箱5立式壓力蒸汽滅菌鍋6生物潔凈安全柜復核人/日期:檢查人/日期:5.2 驗證所需文件的確認表文件名稱文件編碼是否有效版本文件保存處人工牛黃甲硝n坐膠囊內(nèi)控質(zhì)量標準口是 口否質(zhì)量

6、部人工牛黃甲硝n坐膠囊檢驗操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部取樣操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部微生物限度檢查操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部微生物實驗室清潔消毒操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部培養(yǎng)基的管理制度口是 口否質(zhì)量部檢定菌的保存、傳代、使用、銷毀規(guī)程口是 口否質(zhì)量部LDZX-30FBS立式壓力壓蒸汽滅菌器操 作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部« SPX-150B生化培養(yǎng)箱操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部BHC-1300IIA/B3 生物潔凈安全柜操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部JJ200電子天平操作規(guī)程口是 口否質(zhì)量部復核人/日期:檢查人/日期:6 .驗證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗樣品的確認6.1 試驗菌種檢查表1 丁 P菌種名稱代碼

7、凍干菌種 批號來源1金黃色葡萄球菌CMCCB) 26003中國食品藥品檢定研究院2銅綠假單胞菌CMC CB) 10104中國食品藥品檢定研究院3枯草芽抱桿菌CMCCB) 63501中國食品藥品檢定研究院4白色念珠菌CMCCF) 98001中國食品藥品檢定研究院5黑曲霉CMCCF) 98003中國食品藥品檢定研究院6大腸埃希菌CMCCB) 44102中國食品藥品檢定研究院7乙型副傷寒沙門菌CMCCB) 50094中國食品藥品檢定研究院復核人/日期:6.2試驗所需的培養(yǎng)基檢查1 丁 P名稱生產(chǎn)廠家是否通過培養(yǎng) 基適用性試驗批號01胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否02胰酪大豆月東

8、瓊脂培養(yǎng)基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否03沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否04沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否05麥康凱液體培喬基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否06麥康凱瓊胎培喬基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否07RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否08木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊月日A 口笠小士北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否09三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基北京二藥科技開發(fā)公司口是 口否檢查人/日期:檢查人/日期:復核人/日期:6.3.檢驗樣品確認表1 丁 P品名生產(chǎn)廠家批號規(guī)格是否按GMP要求生產(chǎn)1人工牛黃甲硝陛膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝陛0.2g

9、人工牛更5mg口是 口否2人工牛黃甲硝陛膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝陛0.2g人工牛更5mg口是 口否3人工牛黃甲硝陛膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝陛0.2g人工牛更5mg口是 口否檢查人/日期：復核人/日期:7 .驗證項目和驗證方法7.1 驗菌株人工牛黃甲硝n坐膠囊需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證所用的菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌檢查方法驗證所用的菌株為大腸埃希菌、乙型副傷 寒沙門菌。試驗菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。7.2 氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證

10、的菌液制備分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、 枯草芽胞桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，3035c培養(yǎng)1824小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9 %無菌氯化鈉溶液 9ml,采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5- 10-7，制成50100cfu/ml的菌懸液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 中，2025c培養(yǎng)23天，取此培養(yǎng)液1ml加0.9 %無菌氯化鈉溶液 9ml,采用10倍遞增稀釋法，稀釋至 105107,制成50100cfu/ml的菌懸液備 用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面上，2025c培養(yǎng)57天，直到獲得豐富的抱子。加入35ml

11、含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，吸至無菌試管中，取 1ml 加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7,制 成50100cfu/m 的抱子懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置，應在 2小時內(nèi)使用；若保存在 28C,可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸 液可保存在28C ,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。驗證時，對各試驗菌的回收率逐一進行驗證。7.3 需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證-常規(guī)傾注平皿法7.3.1. 供試液的制備取供t品10g,加0.9%無菌氯化鈉溶液至 100ml,振搖，制成1: 10的供試

12、液。7.3.2. 試驗組取1: 10的供試液1ml和7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注不超過45c的胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基 20ml混勻，每株試驗菌株平行制備 2個平皿。置3035 c培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3天（金黃 色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌），或培養(yǎng) 5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。另取1: 10的供試液1ml和7.2項下制備的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入平皿中，立即傾注不超過45 c的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備 2個平皿。置2025 c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。取1: 10的供試液1ml注入平皿中

13、，立即傾注不超過45 c的胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，平行制備2個平皿。置3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5天，點計菌落數(shù)。另取1: 10的供試液1ml注入平皿中，立即傾注不超過45 c的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻，平行制備2個平皿。置2025c培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5天，點計菌落數(shù)。取0.9%無菌氯化鈉溶液 1ml和7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注不超過45c的胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備 2個平皿。置3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌），或培養(yǎng) 5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。另取0

14、.9%無菌氯化鈉溶液 1ml和7.2項下制備的50100cfu的白色念珠菌、黑曲霉，分別注入平皿中，立即傾注不超過 45 C的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻，每株試驗菌株平行制備 2個平皿。置2025 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。常規(guī)傾注平皿法方法驗證的接受標準試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值（即試驗菌的回收率）應在0 .5 ?2范圍內(nèi)。常規(guī)傾注平皿法方法驗證的結(jié)果常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1:人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、

15、枯草芽抱桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉 5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數(shù)2：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉 5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數(shù)3:人工牛黃甲硝n坐膠囊批號

16、：;胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉 5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期:常規(guī)傾注平皿法測定霉菌與酵母菌總數(shù)方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復

17、核人/日期：試驗次數(shù)2：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數(shù)3:人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長：5天試驗菌株菌種代數(shù)試驗組供試品對照組菌液對照組試驗菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期:常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)方法驗證小結(jié)按照驗證方案的要求進行試驗，若各試

18、驗菌株的回收率在0.52范圍內(nèi)，則可確認常規(guī)傾注平皿法適用于本品的需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)檢查。如常規(guī)傾注平皿法適用于霉菌與酵母菌總數(shù)檢查，但不適用于需氧菌總數(shù)檢查，則下面進一步驗證可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的需氧菌總數(shù)檢查。7.4 需氧菌總數(shù)檢查一離心沉淀-薄膜過濾法7.4.1. 供試液的制備取供t品10g,力口 0.9%無菌氯化鈉溶液至 100ml,振搖，制成1: 10的供試液貯備液。取 1:10的供試 液貯備液50ml,經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液得供試液。7.4.2. 試驗組取供t液1 ml,加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全

19、量通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素膜） 后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次），然后在第 3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，過濾。每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035 c倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌）或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。7.4.3. 供試品對照組取供t液1 ml,加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素膜） 后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100

20、ml/次），平行制備 2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035c倒置培養(yǎng)5天，點計菌落數(shù)。7.4.4. 菌液對照組100m10.9%取0.9%無菌氯化鈉溶液 300 ml, 200ml通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素膜）后，在余下的無菌氯化鈉溶液中加入7.2項下制備的50100cfu的試驗菌，過濾。每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035c倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌），或培養(yǎng)5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。稀釋劑對照組依口7.2項下菌液制備方法，以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液，將各

21、菌液稀釋至含菌50100cfu/m1 ,然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1 ml ,加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素 膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次），每株試驗菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆豚瓊脂培養(yǎng)基平皿上，3035 c倒置培養(yǎng)3天（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌），或培養(yǎng) 5天（白色念珠菌、黑曲霉），點計菌落數(shù)。7.4.6. 離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)方法驗證的接受標準試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比

22、值（即試驗菌的回收率）應在0 .5 ?2范圍內(nèi)，同時稀釋劑對照組與菌液對照組菌落數(shù)的比值應也在0 .5 ?2范圍內(nèi)。7.4.7. 離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)方法驗證的結(jié)果試驗次數(shù)1:人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉 5天試驗菌株菌種試驗組供試品對照組菌液對照組稀釋劑對膨a試驗組各菌株回收率稀釋劑對 照菌 株回收率12均值112均值12均值金更色葡萄球菌銅綠假單胞菌抱桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期:試驗次數(shù)2： 人工牛黃甲硝n坐膠囊

23、批號 ：;胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉 5天試驗菌株菌種試驗組供試品對照組菌液對照組稀釋劑對膨a試驗組各菌株回收率稀釋劑對 照菌 株回收率12均值112均值i2均值金更色 葡萄球菌銅綠假單胞菌抱桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：試驗次數(shù)3:人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：;胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基配制批號： 培養(yǎng)箱 型號 編號;培養(yǎng)溫度： ;培養(yǎng)時長： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌3天，白色念珠菌、黑曲霉 5天試驗菌株菌種試驗組供試品對照組菌液對照組稀釋劑對膨

24、a試驗組各菌株回收率稀釋劑對 照菌 株回收率12均值112均值12均值金更色葡萄球菌銅綠假單胞菌抱桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗人/日期：復核人/日期：7.4.8. 離心沉淀-薄膜過濾測定需氧菌總數(shù)方法驗證小結(jié)按照驗證方案的要求進行試驗，若試驗組各試驗菌株的回收率在0.52范圍內(nèi)，稀釋劑對照組各試驗菌株的的回收率也在 0.52范圍內(nèi)，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的需氧菌總數(shù)檢查。人工牛黃甲硝n坐膠囊照此驗證過的供試液制備方法及計數(shù)方法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)。7.5 控制菌檢查方法驗證一離心沉淀-薄膜過濾法若在7.3需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗證-常規(guī)傾注平皿法的試驗中，證實了人工

25、牛黃甲硝嚏膠囊有抑菌性，不能使用常規(guī)傾注平皿法進行需氧菌總數(shù)檢查，則為了確?？刂凭鷻z查的可靠性，采用可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法進行控制菌檢查，按照以下方案進行方法學驗證。7.5.1. 試驗菌株人工牛黃甲硝n坐膠囊質(zhì)量標準中規(guī)定檢查的控制菌為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌，所以選擇這兩種菌株進行控制菌檢查的方法學驗證。試馬菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。7.5.2. 控制菌檢查方法驗證的菌液制備分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，3035c培養(yǎng)1824小時，取此培養(yǎng)液 1ml加0

26、.9 %無菌氯化鈉溶液 9ml,采用10倍遞增稀釋法，稀釋至 10-510-7，制成 50100cfu/ml 的菌懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內(nèi)使用；若保存在 28C,可在24小時內(nèi)使用。驗證時，對各試驗菌的回收率逐一進行驗證。7.5.3. 大腸埃希菌檢查方法驗證供試液的制備取供t品10g,加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml,振搖，制成1: 10的供試液貯備液。取 1:10的供試液貯備液50ml,經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘，取上清液得供試液。取供t液10ml,加至100 ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次

27、），然后在第3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加入 100cfu的大腸埃希菌， 過濾。取膜接種至 100ml胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，混勻， 3035c培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物 1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244c培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035 C培養(yǎng)1872小時。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應有大腸埃希菌典型菌落生長。組100cfu/ml ,然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。取上層菌液1 ml ,加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素 膜

28、）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次）。取膜接種至 100ml胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，混勻，3035c培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物 1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244c培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035 C培養(yǎng)1872小時。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應有大腸埃希菌典型菌落生長。取0.9%無菌氯化鈉溶液 300 ml ,全量通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素膜）后，取膜接種至 100ml胰 酪大豆月東液體培養(yǎng)基中，混勻，3035c培養(yǎng)1824小時。陰性對照應無菌生長。試驗次數(shù)1：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號：大腸

29、埃希菌對照菌來源 批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)故關(guān)宜胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度c型號編號溫度c型號編號溫度c結(jié)果判斷培養(yǎng)時間開始月日時 結(jié)束_月_日_時開始月日時 結(jié)束_月_日_時開始月日時 結(jié)束一月_日_時試驗組陽性 對照組陰性 對照組試驗人/日期：復核人/日期:試驗人/日期:試驗次數(shù)2：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號：過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)故關(guān)宜胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度c型號編號溫度c型號編號溫度c結(jié)果判斷培養(yǎng)時間開始_月_日_時

30、結(jié)束一月一日時開始_月_日_時結(jié)束一月一日時開始月_日_時結(jié)束月一日時試驗組陽性 對照組陰性 對照組大腸埃希菌對照菌來源 批號（菌種編號）復核人/日期:試驗次數(shù)3：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號 ：大腸埃希菌對照菌來源 批號（菌種編號）過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)故關(guān)宜胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度c型號編號溫度c型號編號溫度c結(jié)果判斷培養(yǎng)時間開始月日時 結(jié)束_月_日_時開始月日時 結(jié)束_月_日_時開始月日時 結(jié)束一月_日_時試驗組陽性 對照組陰性 對照組試驗人/日期：復核人/日期:大腸埃希菌檢查方法驗證結(jié)果小結(jié)按照驗證方案的要求進

31、行試驗，若試驗組與陽性對照組均檢出典型大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長，則可確認離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的大腸埃希菌檢查。人工牛黃甲硝n坐膠囊照此驗證過的供試液制備 方法及大腸埃希菌檢查方法進行檢查。菌檢查方法驗證7.5.4.1 供試液的制備取樣品10g加0.9%無菌氯化鈉溶液至 100 ml制成1:10的供試液。取全部供試液經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘，取全部上清液為供試液。1.1.1.2 試驗組取全部供試7加至 100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次（100ml/次）。然后在第 3次沖洗液（100ml0.9%無菌氯化鈉溶液）中加

32、入 100cfu的乙型副傷寒 沙門菌，過濾。取膜接種至 200ml胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，混勻， 3035c培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物 0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基，3035c培養(yǎng)1824小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035c培養(yǎng)1848小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落，于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時。1.1.1.3 陽性對照組100cf

33、u/ml ,然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上層菌液作下面的試驗。0.45 11 m混合纖維素取上層菌液1 ml ,加至100 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，混勻，全量通過薄膜（孔徑膜）后，以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次（100ml/次）。取膜接種至 200ml胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基中，混勻，3035c培養(yǎng)1824小時。取上述增菌培養(yǎng)物 0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基，3035c培養(yǎng)1824小時。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035c培養(yǎng)1848小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落，于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時。1.1.1.4 陰性對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液 300 ml ,全量通過薄膜（孔徑 0.45心m混合纖維素膜）后，取膜接種至200ml胰酪大豆月東液體培養(yǎng)基中，混勻，3035c培養(yǎng)1824小時。陰性對照應無菌生長。1.1.1.5 離心沉淀-薄膜過濾法測定乙型副傷寒沙門菌方法驗證結(jié)果試驗次數(shù)1：人工牛黃甲硝n坐膠囊批號乙型副傷寒沙門菌對照菌來源過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判 斷培養(yǎng) 基胰酪大豆豚液體“口笠配制批號RV