抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性測定方法79498

1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性測定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍(lán)四陛光化還原法）1、試劑的配制（1） 0.05mol/L 磷酸緩沖液（PBS, pH7.8）:A 母液：0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液：取 Na2HPO4 12H20 （分子量 358.14） 71.7g;B 母液：0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液：取 NaH2P04 2H2O （分子量 156.01） 31.2g。分別用蒸儲水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS （pH7.8）的配制：分別取 A 母液（Na2HPO4） 228.75ml , B 母液（NaH2P。4） 21.25ml,用蒸儲

2、水定容至 1000ml。參考文獻(xiàn)：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術(shù).高等教育出版社，2000: 267268。（2） 14.5mM甲硫氨酸溶液：取 2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。（3） 30dM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na 2用磷酸緩沖液定容至 100ml。（4） 60dM核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml,避光保存。（5） 2.25mM 氮藍(lán)四陛（NBT）溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml,避光保存。酶液制備：取0.2g （可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研

3、缽中， 加入1.6ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在 4C、 12000g下離心20min ,上清液即為酶液。2、酶活性測定（1）反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準(zhǔn)）：分別取Met溶?夜162ml, EDTA-Na2溶液0.6ml, 磷酸緩沖液5.4ml, NBT溶液6ml,核黃素溶液6ml,混合后搖勻；（2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30 M酶液于試管中（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min;同時做兩支對照管，其中 1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入 30 M PBS （不加酶液）照光 后測定作為最大光還原管，另1支只加緩

4、沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。（4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測OD560（出現(xiàn)顏色即 可測定）。（5）酶活性計算：SOD活性單位以抑制 NBT光化還原50%所需酶量（測的樣品值要 在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（u）。SOD 總活性=（Ack-AE ） V （1/2Ack>W< Vt）SOD比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g FW）;比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；A e為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml ,加入PBS的體積）；Vt為測定時的酶液

5、用量（ml, 30ul）; W為樣品鮮重（g,測定時應(yīng)換算為葉綠體 的質(zhì)量mg）;蛋白質(zhì)含量單位為 mg/go二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、過氧化物酶（POD ）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/L 磷酸緩沖液（pH6.0）:分別取 A 母液（Na2HPO4 ） 123ml 和 B 母液（NaH 2PO4 ） 877ml 混勻即為 1000ml PBS（0.2M , pH6.0）;（2）反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準(zhǔn)）：取200ml PBS（0.2M , pH6.0）,加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱 攪拌溶解，冷卻后加入 0

6、.112ml 30%的H2O2,混勻后保存于冰箱中備用。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液并加入30 口酶液，以PBS為對照調(diào)零，而后測定OD470值（測定40秒）。 （邊加樣邊測定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4）酶活性計算：以每 min OD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。POD= （ A A470 XVt / （W< Vs XQ.01 6 （u/g min）A A470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品鮮重（g） ; t為反應(yīng)時間（min）; Vt為提取酶液總體積（ml, （1.6ml）; Vs為測定時取用酶液體

7、積（ ml, 30ul）。2、過氧化氫酶（CAT ）活性測定（1）試劑配制:0.15mol/L 磷酸緩沖液（pH7.0）:取 A 母?夜（Na2HPO4）457.5 ml 和 B 母液（NaH2P04）292.5 ml混合后用蒸儲水定容至 1000ml。（2）反應(yīng)液配制：取 200ml PBS （0.15M, pH7.0）,加入 0.3092ml 30% 的 H2O2 （原液） 搖勻即可。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml （可視情況調(diào)整）酶液，以 PBS為對照調(diào)零， 測定OD240 （紫外）（測定40s）。（4）酶活性計算：以每 min OD值減少0.01為1個酶活性單位（u）。C

8、AT= A A240 x Vt /WW< Vs XQ.01 的 （u/g min）A A240為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化； W為樣品鮮重（g） ; t為反應(yīng)時間（min）; Vt為提 取酶液總體積（ml, 1.6ml）; Vs為測定時取用酶液體積（ ml, 0.1ml）。四、超氧陰離子自由基（。2.一）產(chǎn)生速率的測定（羥胺氧化法）1、試劑的配制（1） 1mM鹽酸羥胺溶?稱取 0.02085g鹽酸羥胺用蒸儲水定容至300ml;（2） 17mM對氨基苯磺酸溶液：稱取 1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰 醋酸：水=1: 3配制）加熱溶解后定容至 400ml;（3） 7mM -泰胺溶

9、液：稱取 0.4008g “-泰胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水 =3: 1配制） 定容至400ml。2、O2.-含量的測定（1）樣品液提取方法同 SOD測定；（2）取0.5ml提取液（酶液）（可視情況調(diào)整用量）中加入0.5ml PBS （0.05M, pH7.8）,1ml 1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。（3）在25 c下保溫1小時；（4）依次先加入1ml 17mM對氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM a -泰胺，混合后快速搖勻；（5）在25c下保溫20min后在3000Xg下離心3min后馬上進(jìn)行測定（或置于冰箱待測）；（6）以對照管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測定 OD530值（測定）；（7）。

10、2.-含量的計算：由測得的 OD530,查NO2-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到NO 2-；根據(jù)羥胺與O2.- 的反應(yīng)式：NH2OH+2O2.-+H+NO2H2O2 +H2O 計算O2.,即NO2- >2=O2.;再。2.-產(chǎn)生速率（以 nmol min-1mg-1根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得蛋白表示，也可以nmol min-1g-1 鮮重表示）。O2.一產(chǎn)生速率=（CXV） / （t>W）（nmol min-1g-1 鮮重）C 為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度（umol/L） ； V 為測定時所取提取液用量（葉綠體稀釋后的體積 ）； t 為反應(yīng)時間（60min）； W 為樣品鮮重（葉綠

11、體實際質(zhì)量g）參考文獻(xiàn)：王愛國，羅廣華.植物生理學(xué)通訊，1990, （6）: 5557五、丙二醛含量的測定1、試劑配制：10%TCA 100g 三氯乙酸 f1L0.67%TBA 3.35g 硫代巴比妥酸 -500ml 10%TCA （避光）2、測定步驟:0.2 樣品+1.6ml 10%TCA 研磨-12000g 離心 10min -上清 1.5ml +1.5 0.67% TBAf沸水煮 30min -冷卻，離心上清 OD5。，OD32, OD003、計算組織中MD總量：MDAB度 C （umol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450MD給量（umol/g FW）=C X

12、 V/W式中V為提取液體積（1.6ml） , W為樣品鮮重（0.2g）。六、 植物細(xì)胞質(zhì)膜透性的測定（電導(dǎo)儀法）（ 1 ）取新鮮葉片或根系（不能萎蔫）0.3g ，用自來水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾遍后用吸水紙吸干水分；（ 2）樣品剪碎（也可打孔取樣）放入試管（或15ml 大離心管）中，加10ml 去離子水，在室溫下放置3h 使葉片充分吸水后測定溶液電導(dǎo)率（R1） ；（ 3）再放入恒溫水浴鍋中在100沸水浴中煮20min 以殺死葉片組織，用冷水冷卻到室溫后測定溶液電導(dǎo)率（R2） ；（ 4）用公式計算質(zhì)膜相對透性（用相對電導(dǎo)率表示）：相對電導(dǎo)率（% =R1/R2X100%還可以計算植株傷害程

13、度：傷害率二（處理電導(dǎo)率一對照電導(dǎo)率）/ （煮沸電導(dǎo)率一對照電導(dǎo)率）X 100%七、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍(lán)染色法）1、試劑的配制（ 1）考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取100 mg 考馬斯亮藍(lán)，溶于50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85% （W/V）的磷酸，再用蒸儲水定容到1L。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫卜可在暗中保存一個月。（2） 100g/ml牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml, 再從中吸取 40ml用蒸儲水定容至 100 ml （也可取10mg BSA定容至100ml即為100 d g/ml 標(biāo)準(zhǔn) BSA 溶液） 。2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定：取20"提取液（酶液）加入 80屋0.05M, pH