2019年蛋白免疫印跡雜交

1、蛋白免疫印跡雜交(Western Blot )技術(shù)手冊(cè)蛋白免疫印跡雜交(Western Blot )技術(shù)手冊(cè)蛋白免疫印跡雜交(Western Blot WB )是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺 電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜(blot )上，然后通過一抗/ 二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。WE是進(jìn)行蛋白質(zhì)分析最流行和成熟的技術(shù)之一。本指南討論 Western Blot操作方法及常見問題 分析，有助于成功完成WBA蛋白樣本提取制備1細(xì)胞或組織裂解2蛋白酶和磷酸酶抑制劑3蛋白定量4電泳上樣樣品的準(zhǔn)備B 電泳1 PAGE膠的制備2蛋白分子量Marker3陽性對(duì)照4內(nèi)參對(duì)照5上樣與電泳C 轉(zhuǎn)膜

2、與顯色(Western Blot )1 膠中蛋白的檢測(cè)2 蛋白轉(zhuǎn)膜3 膜上蛋白的檢測(cè)：麗春紅4 膜的封閉5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 顯色D 常見問題分析與解決方案附錄1 WB實(shí)驗(yàn)試劑配制方法附錄2 SDSPAGE交的配制9WB概述：檢測(cè)Protein Blot onNitrocelluloseLabel whh SpecificDetect AntibodySDS PolyaarylamideGel Electropho resisReveals Protein of Interest聚丙烯醸胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜I孵育1小時(shí)或過夜麗一抗孵育丄小時(shí)或過夜*1小時(shí)3x5分鐘1 X 10分審中I錚育底

3、缽（如溝顯色法，則直按孵育至顯色即可）1分鐘I膠片屢進(jìn)關(guān)1 - 30分鐘A蛋白樣本提取制備蛋白樣品制備是Western Blotting 的第一步，更是決定WE成敗的關(guān)鍵步驟，總體原則和注意事項(xiàng)：1盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度只集中于提取目的蛋白（通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品）2:保持蛋白的處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的 PH鹽濃度 表面活性劑、 還原劑等的選擇）3:提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，（低溫操作，加入 合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）4:盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不 同提取策略）5:樣品分裝，長(zhǎng)期于-80C中保存，避免反復(fù)凍融。A-

4、1細(xì)胞或組織裂解A-1-1細(xì)胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提試劑盒的選擇目的蛋白分布定位推薦裂解液Lysis buffe推薦試劑盒全細(xì)胞NP-40 or RIPA （附錄 1）全蛋白抽提試劑盒細(xì)胞質(zhì)（可溶蛋白）Tris-HCl （附錄 1）胞漿蛋白和核蛋白抽 提試劑盒線粒體蛋白提取試劑 盒細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞骨架等不 溶蛋白）Tris-Trit on（附錄 1）蛋白分級(jí)抽提試劑盒細(xì)胞質(zhì)（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提試劑 盒細(xì)胞膜NP-40 or RIPA （附錄 1）膜蛋白抽提試劑盒蛋白分級(jí)抽提試劑盒細(xì)胞核RIPA （附錄 1）核蛋白抽提試劑盒線粒體RIPA （附錄 1）線粒體蛋白抽

5、提試劑 盒亞細(xì)胞定位蛋白抽提試劑盒細(xì)胞裂解操作方法：1 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶 抑制劑（種類與量見本節(jié)2）2 吸凈PBS加入預(yù)冷的裂解液，（1 ml per 10 7 cells/IOOmmdish/150cm 2 flask; 0.5ml per 5x1062cells/60mm dish/75cm flask）.3 用細(xì)胞刮子刮取貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微 量離心管中，54C離心12,000 rpm , 20 min （根椐細(xì)胞種類不同 調(diào)整離心力）6 輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白 樣本，棄沉淀 .A-1

6、-2 組織裂解1 用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶 水解，2 將組織塊放在圓底的微量離心管或 Eppendorf 管中，加入液 氮凍結(jié)組織于冰上均質(zhì)研磨，長(zhǎng)期可保存于 -80C，3 每約5 mg加入約300卩l(xiāng)預(yù)冷的裂解液lysis buffer，冰浴勻漿后置于4C搖動(dòng)2小時(shí)，裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例，（最終 的蛋白濃度至少達(dá)到 0.1 mg/ml, 理想的蛋白濃度應(yīng)為 1-5 mg/ml）.4 4C離心12,000 rpm , 20 min，輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制劑推薦購(gòu)商品化蛋白酶和磷酸

7、酶抑制劑復(fù)合試劑盒或 COOKTAIL或按下表 配制：InhibitorProtease/phosphatase InhibitedFinal co in lysisAprotininTrypsin, Chymotrypsin, Plasmin2 pg/mlLeupeptinLysosomal5*10 pg/Pepstatin AAspartic proteases1 pg/mlPMSFSerine. Cysteine proteases1 mMEDTAMetalloproteases that requireMg+ and Mn+5 mMEGTAMetalloproteases that r

8、equire Ca+1 mMNa FluorideSerine/Threonine phosphatases5-10 mlVNaOrthovanadateTyrosine phosphatases1 mM備注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下:所有步聚均需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行:1. 用雙蒸水配制100 mM正磯酸鈉溶液.2. 用鹽酸HCI調(diào)至pH 9.03. 煮沸至溶液無色，盡量減少水分揮發(fā).4. 冷卻至室溫5. 再調(diào)pH至9.06. 再煮沸至無色7. 重復(fù)上述過程,直至溶液煮沸冷卻后達(dá)pH 9.08. 用水定容至原體積9. 分裝保存于-20。C.溶液變黃則棄之不用A-

9、3蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法(均有商品化試劑盒可選擇，操作簡(jiǎn) 單、需分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀)，小牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線如果裂解液中有NP40或其它表面活性劑，則推薦使用 BCA法。三種方 法或產(chǎn)品比較列表如下：方法原理靈敏性干擾因素應(yīng)用Lowry 法Folin 酚試劑法蛋白質(zhì)在堿性溶液中肽 鍵與CiT螯合，形成蛋白 質(zhì)一銅復(fù)合物，還原酚 磷鉬酸產(chǎn)生監(jiān)色化合 物，藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì) 濃度呈線性關(guān)系較咼約5卩g/ml對(duì)可達(dá)1-1500 卩 g/ml適用于脂類含量較 高的樣品測(cè)定，也 能耐受相當(dāng)濃度的 去垢劑如SDS受硫酸銨；Tris緩 沖液；甘氨酸；各 種硫醇干擾耗費(fèi)時(shí)

10、間長(zhǎng)4 60分鐘；操作 嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏 深淺隨不同蛋 質(zhì)變化；標(biāo)準(zhǔn) 線不是嚴(yán)格的 線形式，且專 性差Bradford 法考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋 白質(zhì)結(jié)合呈藍(lán)色，在波 長(zhǎng)595nm吸收峰，在一 定的范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的 含量呈線性關(guān)系高約15卩g/ml,微孔法測(cè)定范圍為1-25 卩 g/ml試管法測(cè)定范圍為100-1500 卩 g/ml易受強(qiáng)堿性緩沖液，TritonX-100，SDS等去污劑的影 響快速515 分 顏色穩(wěn)定；深 隨不同蛋白質(zhì) 化；標(biāo)準(zhǔn)曲線 輕微的非線性BCA法BCA法基于雙縮脲原理， 堿性條件下蛋白質(zhì)將CiT還原成 Cu1+，BCA(Bic inchoninic酸)螯合cU+作為顯色

11、劑，產(chǎn)生蘭紫色并在562 nm有吸收峰單價(jià)CU+與 蛋白呈劑量相關(guān)性，很高 0.5-20 卩 g/ml試管法可測(cè)范圍20 - 2,000 卩 g/ml微孔法為0.510 卩 g/ml不易受般濃度去污劑的干擾可受螯合劑；略高 濃度的還原劑的影 響較快40分鐘 較好的方法； 干擾能力強(qiáng)BCA測(cè)定方法如下：A.酶標(biāo)板操作1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑孔號(hào)01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（卩L）01248 :121620去離子水（卩L）2019181612 1840對(duì)應(yīng)蛋白含量（卩g）00.51.02.04.06.08.010.02. 根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA

12、試劑B（ 50:1 ）配制適量BCAX作液，充分混勻；3.各孔加入200卩L BCA工作液;4. 把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec, 37C放置30分鐘，然后在562nm下比色測(cè)定。以蛋白含量（卩g）為橫坐標(biāo)，吸光值 為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；5. 稀釋待測(cè)樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為20卩L,加入BCA工作液200卩L,充分混勻，37C放置30分鐘后，以標(biāo) 準(zhǔn)曲線0號(hào)管做參比，在562nm波長(zhǎng)下比色，記錄吸光值；6. 根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（卩g），除以樣品稀釋液總體積（20卩L），乘以樣品稀 釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度（單位：卩g/卩L）。B.分光光度

13、計(jì)測(cè)定1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：各管按照下表加入試劑孔號(hào)01234567蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（卩L）051020406080100去離子水（卩L）1009590806040200對(duì)應(yīng)蛋白含量（卩g）02.55.010.0 :20.0 30.0 400 50.C2.根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA式劑B （50:1 ）配制適量BCA工作液，充分混勻；4. 各管充分混勻，37C放置30分鐘，然后在562nm 下比色測(cè)定。以蛋白含量（卩g）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo) 準(zhǔn)曲線；5. 稀釋待測(cè)樣品至合適濃度，樣品稀釋液總體積為100卩L,加入BCA工作液1000卩L,充分混勻，37C放置30分

14、鐘后， 以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)管做參比，在562nm波長(zhǎng)下比色，記錄吸光值；6. 根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量（卩g），除以樣品稀釋液總體積（100卩L），乘以 樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度（單位：卩g/卩L）。A-4 電泳上樣樣品的準(zhǔn)備A-4-1 變性、還原蛋白樣本一般的抗體只能識(shí)別抗原蛋白中的部份序列結(jié)構(gòu)（表位），因此， 為使抗體能夠達(dá)到結(jié)合該表位而需要將蛋白樣本進(jìn)行變性，使之打開折 疊的空間結(jié)構(gòu)，蛋白變性一般使用含陽離子變性去污劑如SDS的上樣buffer（ loading buffer ），并于 95-100C 煮沸 5 分鐘，對(duì)于多次跨膜蛋 白，可以于 70C 加

15、熱 5-10 分鐘，標(biāo)準(zhǔn)的上樣 buffer 稱為 2X Laemmli buffer ，上樣時(shí)與樣本！：！混合后變性上樣即可：2X Laemmli buffer4% SDS10% 2-mercaptoehtanol20% glycerol0.004% bromophenol blue0.125 M Tris HClCheck the pH and bring it to pH 6.8.SDS勺陰離子環(huán)繞蛋白肽鍵使之帶負(fù)電荷， 蛋白分子量不同，結(jié)合的SDS 數(shù)量不同，所帶負(fù)電荷也不同，電泳遷移速度不同，因此SDS-PAG電泳可將不同分子量的蛋白分離開。A-4-2天然和非還原樣本某些抗體識(shí)別的表

16、位是非連續(xù)氨基酸構(gòu)成的蛋白三維結(jié)構(gòu)，此種情 況則需要進(jìn)行非變性的WB抗體的說明書一般會(huì)標(biāo)注，這種非變性電泳 不加SDS樣本也不需煮沸。某些抗體僅識(shí)別蛋白的非還原態(tài)，如某些cysteine基的氧化態(tài)，因此loadi ng buffer和電泳液中不加入 ？-mercaptoetha nol a nd DTT蛋白狀態(tài)凝膠狀態(tài)load ing buffer電泳緩沖液還原一變性還原和變性有?-mercaptoetha nol 或DTT和SDS有SDS還原一天然還原和非變性有?-mercaptoetha nol 或 DTT，無 SDS無SDS氧化-變性非還原和變性無?-mercaptoetha nol 或

17、 DTT，有 SDS有SDS氧化-還原非還原和天然無?-mercaptoetha nol 或 DTT，無 SDS無SDS注：除說明書特別標(biāo)注之外，一般情況下，均使用變性和還原電泳B 電泳B-1 PAGE膠的制備聚丙酰胺凝膠PAGE電泳根椐蛋白分子量進(jìn)行分離蛋白，PAGE膠是由兩種化合物聚合而成的，即丙烯酰胺(acr )和N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis).， 聚合需加入過硫酸銨及DMAP或 TEMED凝膠為中性、水溶性、三維網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)。凝膠的孔徑取決于總丙烯酰胺的百分含量(T)和交聯(lián)度(%C，T%=(a+b)/m*100%;和 C%=a/(a+b)*100%,其中：a=雙體(bis)的重量;b=

18、單體(arc)的重量;m=溶液的體積(ml)。丙烯酰胺總量增加，則 孔徑減小，5%C勾成最小的孔徑，任何的 %C增加或降低，孔徑都增加， 凝膠的百分濃度組成需兩個(gè)參數(shù)，丙烯酰胺(acr )和N,N-甲叉雙丙烯 酰胺(Bis).的總量百分濃度(w/v)。不同分子量的蛋白選擇不同的凝膠濃度(參考下表，原則上高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離蛋白分子量(kDa)凝膠濃度(%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008不同濃度的凝膠的配制方法見附錄2 首先配制各組分貯備液，然后分 別配制濃縮膠和分離膠。B-2蛋白分子量 Marker預(yù)染或非預(yù)染各種分子量

19、的蛋白，用于標(biāo)示電泳中蛋白的大小和示蹤商業(yè)化產(chǎn)品:非預(yù)染Marker(MW 116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)預(yù)染Marke r(MW116, 97.4, 66, 45, 36 29, 24, 20.1, 14.2KDa)於齡*10gwam字押SDS-PAGESMM41s-tenDFAQE4B供. SM4P11 站族 SOS-MGEMvlSMOKiSD5-PAGEB4 4.il *wa W.!電5MQI?1斗松SMEQ 巨PJMJJe-t6H60frPAMwmjs10-W* &D&-MGEB- 3陽性對(duì)照目的蛋白或明確表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)

20、胞的蛋白提取物，用于檢驗(yàn)整 個(gè)實(shí)驗(yàn)體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質(zhì)量和效率。建議使 用該對(duì)照?？刹殚單墨I(xiàn)或抗體說明書選擇購(gòu)買或自提該對(duì)照樣本。B-4內(nèi)參對(duì)照管家基因編碼的、很多組織和細(xì)胞中都穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，用于檢測(cè)整個(gè) WB實(shí)驗(yàn)過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量的 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。必須設(shè)立。內(nèi)參名稱分干量大小適用范圍beta-act in43kDa胞漿和全細(xì)胞；GAPDH30-40kDa胞漿和金細(xì)胞Tubulin55kDa跑漿和全細(xì)胞VCDAl/Porin31kDa線粒體線粒體Lamin Bl16kDa細(xì)胞核帶適千去除核膜的樟本）Itbp38kDa細(xì)胞核汗適豐去除D曲的樣

21、本）|50Kda37Kda1fKdalODKda話心a一內(nèi)參 Beta-actin 抗體 at 1/5000 dilution,Lysates/proteinsat 20ug per laneLane 1 : HeLa nu clearLane 2 : HeLa whole celllysate Lane 3 : A431 cell lysateLane 4 : Jurkat celllysateLa ne 5 : HEK293 cell lysate.B-5上樣與電泳每孔上樣量為20-40卩g蛋白，使用專用槍頭或注射針頭，勿溢出加樣 孔，標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液：1X Tris-glyci ne :2

22、5 mM Tris base190 mM glyci ne0.1% SDS調(diào) pH;8.3.電泳時(shí)間按電流儀說明書推薦方法使用,（1小時(shí)或過夜，取決于電壓大 ?。?dāng)染料到達(dá)膠的底部，關(guān)電源停止電泳，膠不能存放，應(yīng)立刻進(jìn) 行下一步的轉(zhuǎn)膜。C 轉(zhuǎn)膜與顯色（Western Blot ）C-1膠中蛋白的檢測(cè)電泳后檢測(cè)蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬斯藍(lán)染 色檢測(cè)，如果凝膠中的蛋白需要進(jìn)行轉(zhuǎn)膜則需可逆的銅染法，否則采用 不可逆考馬斯藍(lán)法染色。銅染法：電泳膠用蒸餾水洗數(shù)秒鐘，加入 0.3 M CuCI2染色5-10分鐘, 再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶，膠置于0

23、.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次，再置于電轉(zhuǎn)緩沖液中開始轉(zhuǎn)膜。考馬斯藍(lán)法：用40液蒸水,10%醋酸,50%甲醇的溶液固定膠中蛋白， 考馬斯藍(lán)R-250染液（凱基產(chǎn)品）室溫染色4小時(shí)至過夜，保持搖勻， 轉(zhuǎn)入67.5%雙蒸水，7.5% 醋酸，25%甲醇I搖勻至脫去多余的染料，蛋 白被染成深藍(lán)色。C-2蛋白轉(zhuǎn)膜蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，在電場(chǎng)下從膠中轉(zhuǎn)至膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電 轉(zhuǎn)儀制造商的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和濕轉(zhuǎn)兩種，半干式轉(zhuǎn)膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列為：海綿/紙/膠/膜/紙/海綿

24、，全部緊密排列，特 別是膠/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向確認(rèn)正確負(fù)極方為帶 負(fù)電的膠里的蛋白，向正極方（膜）電遷移。標(biāo)準(zhǔn)的電轉(zhuǎn)緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS但加入20% 甲醇，如果轉(zhuǎn)膜的蛋白分子量大于80KD則推薦加入SDS使之終濃度為0。1%半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為：/紙/膠/ 膜/紙，用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕后， 直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間。膠于負(fù)極而膜置于正極。半干式的電轉(zhuǎn) 緩沖液可不同于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液， 推薦為：48 mMTris, 39 mMglycine, 0.04% SDS, 20%甲 醇，兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和 PVDF膜（正電荷

25、尼龍膜），根據(jù)不 同需要選擇（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分鐘，再孵育于冰冷 的電轉(zhuǎn)緩沖液中5分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡 3-5分鐘， 否則轉(zhuǎn)膜時(shí)會(huì)導(dǎo)致條帶變形。PVDF尼龍fl!n鬲葛低ffi于 SOS存在時(shí)與*白舲StMOaucm5MOD 岬cm；瓠wasS干 &MS6U軟酈8姿勸時(shí)強(qiáng)Xft淖昭臨是否瑚1隈閥1 1耳沖液閥遲適用東色方港Z萍金、痛啊I、MKA. flPJt汁、舞坷斷亮蘭適用檢測(cè)方注量色：S. 燉廿匕農(nóng) M 性、化學(xué)赴快Ig瑚黑墨色法抽匝看t.蠱色.化工堆WJhit邀簾范K1me陀植#白盤即xtits白腳已舷麗并析*童檢當(dāng).0.1 um ft濫用于7kDa

26、T白偃冰度小分子蛋白.關(guān)性 *白、搭白*白Stf.覆砂檢舸用r倔離注：大蛋白和小蛋白的轉(zhuǎn)膜 電轉(zhuǎn)移緩沖液中SDS與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會(huì)影響轉(zhuǎn) 膜效果，如下調(diào)整可以增加轉(zhuǎn)膜效率： 大蛋白（大于100 KD）1 對(duì)于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出 也非常慢，因此對(duì)于這種大分子量蛋白應(yīng)該用低濃度的凝膠，8%或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時(shí)需十分小心，2 大蛋白易在凝膠里形成聚集沉淀，因此；轉(zhuǎn)膜時(shí)在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度為0.1%的SDS以避免出現(xiàn)這種情況，甲醇易便 SDS從蛋 白上脫失，因此應(yīng)降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。3

27、 降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的比例以促進(jìn)凝膠的膨脹，易于大蛋 白的轉(zhuǎn)出4如果使用硝酸纖維素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)移緩沖液中，但轉(zhuǎn)膜前PVDF需用甲醇活化。5選擇濕式，4C轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜。小蛋白(小于100 KD1 SDS妨礙蛋白與膜的結(jié)合，特別是對(duì)小蛋白更是如此，因此，對(duì)于小分子的蛋白，電轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加SDS2 保持20%勺甲醇濃度對(duì)于大于500KD的蛋白，請(qǐng)參考下述文獻(xiàn)：Bolt and Mahoney,High-efficie ncy blotti ng of prote ins of diverse sizes followi ng so

28、dium dodecyl sulfate polyacrylamide, gel electrophoresis.An alytical Biochemistry 247, 185 - 192 (1997).更多的轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)：?避免用直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會(huì)封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑?排列三明治時(shí)，盡量用移液器或15ml試管趕除膠與膜之間的氣泡，或?qū)⑷髦畏旁谘b有的培養(yǎng)皿中以防止氣泡產(chǎn)生，請(qǐng) 戴手套！?確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否剛導(dǎo)致電流不能通過膜，從而轉(zhuǎn)膜無效?雞抗體易于與PVDF膜和其它尼龍膜結(jié)合，導(dǎo)致高背景，請(qǐng)?zhí)鎿Q成硝酸纖維素膜以降低背景。C-3膜上蛋白

29、的檢測(cè)：麗春紅為檢測(cè)轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色,2%的麗春紅貯備液 （20ML）：: 2%麗春紅（0.4 克）溶于 30%三氯乙酸（6 克） 和 30%磺基水楊酸 （6 克 ）麗春紅染色工作液： 2%的麗春紅貯備液 1：10 稀釋，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法：將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色工作液中，在室溫下?lián)u動(dòng)染色5 分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰， （膜也可以用 TBST 或水重新洗后再進(jìn)行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進(jìn)行 封閉。10x TBS 的配制24.23 g Trizma HCl80.06 g NaCl加約 800 ml 超純水用

30、純HCI調(diào)pH至7.6定容至 1 L.TBST的配希9配制 1 L TBST：: 量取 100 mI 10x TBS+ 900超純水 + 1mI Tween20Tween20非常粘稠，用槍頭不易吸取，請(qǐng)確定加入準(zhǔn)確的量，最好用Tris buffer.配成10%勺Tween20母液后使用。C-4 膜的封閉為防止一抗或 / 和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進(jìn) 行膜的封閉，傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或 BSA脫脂奶粉成本低但不能用于磷 酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白， 該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白） 使用脫脂奶粉會(huì)結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景。某些抗體用BSA封閉時(shí)因不明原因可能會(huì)

31、產(chǎn)生比脫脂奶粉更強(qiáng)的信號(hào)， 請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書注明的注意事項(xiàng)和膜的特殊的封閉方法。配制5%兌脂奶粉或BSA溶液：每100 ml TBST中加入5 g脫脂奶粉或 BSA混勻后過濾，如不過濾會(huì)導(dǎo)致使膜污染上細(xì)微黑顆粒。封閉時(shí)，4C搖動(dòng)，封閉1 hour，再用TBST洗 5秒，進(jìn)入下一步抗 體的孵育。C-5 一抗的孵育孵育Bufer :按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用 TBSTffi釋一抗，如果 說明書沒有建議的稀釋倍數(shù)，則參照一般推薦的稀釋倍數(shù)(1:100-1:3000)，抗?jié)舛冗^高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶。某些實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體，而有些實(shí)驗(yàn)室用不含封閉劑的 TBST來孵育抗體，結(jié)果因抗體而

32、異，有時(shí)兩者結(jié)果相同，有時(shí)結(jié)果不同。注：如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度 (0.5 - 0.25%)脫 脂奶粉或BSA的封閉液來，稀釋，可產(chǎn)生相對(duì)更強(qiáng)的信號(hào)條帶。孵育時(shí)間：一抗的孵育時(shí)間可從幾小時(shí)至過夜(一般不超過18小時(shí))不等，取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度，建議使用較高的 抗體稀釋倍數(shù)和較長(zhǎng)的孵育時(shí)間來保證特異性結(jié)合。孵育溫度：盡可能低溫孵育，如果在封閉液中孵育一抗過夜，應(yīng)在4C進(jìn)行否則會(huì)產(chǎn)生污染而破壞蛋白(降別是磷酸基團(tuán))。孵育一抗時(shí)需保持適當(dāng)?shù)膿u動(dòng)使之均勻覆沒膜，防止結(jié)合不均勻。C-6二抗的孵育一抗孵育結(jié)束后，用TBST搖動(dòng)洗膜數(shù)次，每次5min或更長(zhǎng), 去除殘留的

33、一抗。孵育Bufer和稀釋倍數(shù)：用TBST按說明書推薦的倍數(shù)稀釋二抗，如果 說明書沒有標(biāo)出稀釋倍數(shù)，則按常規(guī)的倍數(shù)稀釋 （1:1000- 1:20,000） 預(yù) 試，二抗的濃度過高也會(huì)導(dǎo)致非特異性條帶。亦可以在封閉液中孵育二 抗（和一抗），但可能在降低背景同時(shí)導(dǎo)致特異性條帶的信號(hào)也減弱， 可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結(jié)合。孵育時(shí)間和溫度：室溫、1-2 hours, 搖動(dòng)二抗連接物：推薦使用二抗連接 HRP不建議連接AP堿性磷酸酶，因其 不夠靈敏。C-7顯色顯色分為酶促底物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光法或熒光法酶促底物發(fā)光法代表為DAB顯色法，與其它同類方法的比較如下圖所示:底物DAB4-CNA EC穩(wěn)走

34、牲好一般避光靈礒度250pgIng一般低高終產(chǎn)物不能很好的成像容易成像成像性顫色隅色介于藍(lán)色與藍(lán)紫邑之間（可用棕紅色于 double-stajning)垂性有（嶽意誥瘙作用）無有TMBlOOpg高容易成像藍(lán)紫色無而現(xiàn)在最常用的是化學(xué)發(fā)光法：HRP化學(xué)發(fā)光底物L(fēng)uminol （ECL法 chemiluminescenee ） 及其改良法， 對(duì)于HRP偶聯(lián)的二抗，一般傳統(tǒng)上使用 ECL和ECL+推薦使用后者, 更靈敏。其中不同商家的產(chǎn)品特點(diǎn)總結(jié)如下表：主要優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)下限信號(hào)持續(xù)時(shí)間首選檢測(cè)方法建議一抗稀釋度建議二抗稀釋度產(chǎn)品保存期SuperSig nal? WestPico化學(xué)發(fā)光底物 與ECL?系

35、統(tǒng)相比減 半的價(jià)格、雙倍的信 號(hào)10-12gSuperSig nal? Wes tFemto超靈敏型底物 適用于hrP測(cè)的最靈敏的化學(xué)發(fā)光底物10-15gSuperSig nal? West Femto增強(qiáng)型底物 延長(zhǎng)的信號(hào)持續(xù)時(shí)間 使這種底物用于今天 的成像設(shè)備最為理想10-14g6-8小時(shí)8小時(shí)24小時(shí)X膠片成像設(shè)備或X膠片成像設(shè)備或X膠片1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,0001:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000室溫1年4C1年或室溫6個(gè)月室溫1年ECL Acfva

36、nceECLECL PM推薦應(yīng)用用干極高的靈敏性的WB-抗和感靶蛋白含童極低的樣龍常規(guī) Western blotting較高靈敏性的west blotting和化學(xué)岌光靈敏性2X 1J14gitr12g2x io10g杭體經(jīng)濟(jì)性極好I好非常好1 一抗稀釋度1:100 0001:10 0001:20 000二抗稀釋度1:500 0001:150001:200 000封閉劑Yes-ECL Advance BlockCertain systemsCertain systems樣#:重新標(biāo)記可以可以可以信號(hào)持續(xù)時(shí)間4-6 h1-2 h2 車 I8h硝北纖維或PVDF硝化纖堆或PVDF硝化纖維或PVDF

37、建吸檢測(cè)方法K膠片/CCDE膠片/CCD熒光掃描儀皿膠片丿建議印跡硝化纖維硝化纖維或PVDF硝化纖維或PVDF膜X-ray膠片：傳統(tǒng)上使用手工曝光的方法，可控制X-ray膠片在曝光和 在定影劑的時(shí)間調(diào)節(jié)。而全自動(dòng)X-ray膠片曝光器也廣泛使用并操作簡(jiǎn) 便。注意不能過度曝光，特別不適于檢測(cè)相對(duì)蛋白量，過度曝光導(dǎo)致全暗的 背景沒有反差和/或產(chǎn)生大量的非特異性條帶。數(shù)字圖像顯影：新一代的膠片顯色方法是使用數(shù)碼相機(jī)在暗室中拍攝膜 上的化學(xué)發(fā)光，將其轉(zhuǎn)成數(shù)字信號(hào)，再通過儀器自帶的軟件進(jìn)行分析。 有些新一代商品化的數(shù)字成像儀器已不再檢測(cè)HRP連接的抗體（如: ECLchemiluminescenee ），

38、女口 STORMS析儀只檢測(cè)熒光標(biāo)記的抗體。D常見問題分析與解決方案問題可能原因驗(yàn)證或解決辦法背景高圭寸閉不充分延長(zhǎng)封閉時(shí)間，更換合適的封閉劑（脫脂奶粉，BSA血清等）一抗?jié)舛冗^高增加一抗稀釋倍數(shù)，抗體孵育溫度過高4C孵育二抗非特異性結(jié)合或與封閉劑交叉反應(yīng)設(shè)置二抗對(duì)照（不加一抗）,降低二抗?jié)舛纫豢够蚨古c封閉劑有交叉反應(yīng)在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng)洗膜不充分增加洗滌次數(shù)膜不合適NC膜比PVDF!背景低膜干燥保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象沒有陽性條帶或很弱一抗、二抗等不匹配訂購(gòu)試劑時(shí)認(rèn)真選取一抗與組織種屬，一抗與二 抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底 物。可通過設(shè)

39、置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有 效性。一抗或/和二抗?jié)舛鹊驮黾涌贵w濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間封閉劑與一抗或二抗有交 叉反應(yīng)封閉時(shí)使用溫和的去污劑，如 TWEEN20或更換 封閉劑（常用的脫脂奶、BSA血清或明膠一抗不識(shí)別目的物種的靶 蛋白檢查說明書，或做ClustalW比對(duì)，設(shè)陽性對(duì)照樣本中無靶蛋白或靶蛋白設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒含量過低（抗原無效）有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太 低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔 20-30ug 蛋 白,樣本制備時(shí)使用蛋白酶抑制劑，或分級(jí)提取 目的蛋白。轉(zhuǎn)膜不充分，或洗膜過度使用麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,PVDF膜需浸透,需 正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿

40、過度洗膜過度封閉使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液,或 更換封閉劑，減少封閉時(shí)間一抗失效使用有效期內(nèi)抗體，分裝保存,避免反復(fù)凍融取 用，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用二抗受疊氮鈉抑制所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉（HRP的抑制劑）酶和底物失效直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶 失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物，使 用新鮮的底物.曝光時(shí)間過短延長(zhǎng)曝光時(shí)間多非特異性條 帶或條帶位置不 對(duì)細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋 白表達(dá)模式的分化使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實(shí)驗(yàn)體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有 多種修飾形式：乙?；⒘?酸化、甲基化、烷基化、糖 基化等查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的 大小

41、蛋白樣本降解使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑新蛋白或同族蛋白的分享 同種表位的不同剪接方式查其它文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說明書報(bào) 導(dǎo)的細(xì)胞株或組織一抗?jié)舛冗^高降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異性結(jié)合降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照選擇特異性更強(qiáng)，只針對(duì)重鏈的二抗抗體未純化使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶蛋白存在二聚體或多聚體SDS-PAG電泳上樣前，煮沸10 min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性背景有白色/黑色斑點(diǎn)轉(zhuǎn)膜時(shí)有氣泡或抗體分布不均盡量去除氣泡，抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)抗體與封閉劑結(jié)合過濾圭寸閉劑暗片現(xiàn)白條帶一抗或二抗加入過多稀釋抗體的濃度目的條帶過低/過高S

42、DS-PAG膠濃度選擇不合 適調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子 量小的蛋白用咼濃度膠“微笑”條 帶遷移過快電泳溫度過高降低電泳速度，低溫電泳（冷室）轉(zhuǎn)膜不充分膜沒有完全均勻濕透使用100% methanol浸透膜靶蛋白分子量小于10,000選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近 轉(zhuǎn)移緩沖液pH值可嘗試使用其他緩沖液如 CAPS緩沖液（pH10.5 或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液甲醇濃度過高過高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與 SDS分離，從而沉 淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑 制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用 乙醇或異丙醇代替轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠Thick gel對(duì)

43、于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí) 間IlMwbilNP4。 rtlbrmMl:5rOOO1 2Q(QQQ1:100P000H Sall1 Wia i|*Optimizatio n of sec on dary an tibody dilutio n for immuno detectio n of ERK 1 with Immobilo n Western Chemilumin-escent HRPSubstrate. Two-fold dilutions of rat liver lysate samples were applied to each gel.Electroblotte

44、d proteins were probed with rabbit anti-ERK1 antibody (1:1,000 dilution) and HRPconjugated goat anti-rabbit IgG (1:5,000, 1:20,000 and 1:100,000dilutions, left to right).附錄1 WB實(shí)驗(yàn)試劑配方1 Nonidet-P40 (NP40) buffer150 mM sodium chloride1.0% NP-40 ( 或 Triton X-100 )50 mM Tris, pH 8.02 RIPA buffer (R adio I mmunoPrecipitation Assay buffer )150 mM sodium chlori