牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法

1、牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法 隨著奶牛飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展， 抗生素在預(yù)防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應(yīng)用。 生 鮮牛奶中抗生素的來源主要是： 第一，治療泌乳期病牛時使用的抗生素會從奶牛 體內(nèi)移行到乳腺殘留進入牛奶中， 資料表明治療后的奶牛， 其擠出的牛奶 5 天內(nèi) 都有抗生素殘留； 其二，為了預(yù)防奶牛疾病并提高產(chǎn)量， 在奶牛飼料中添加抗生 素也會造成牛奶中抗生素的殘留；第三，由于牧場管理不善，擠奶、儲奶沒有嚴 格的衛(wèi)生制度和配套的設(shè)施，人為添加或造成牛奶抗生素的污染。 牛奶中含有抗生素， 不僅對人的健康造成很大的危害， 而且對乳品加工企業(yè)帶來 經(jīng)濟損失（因無法生成酸奶和奶酪）。因此必須嚴格控制

2、牛奶中抗生素殘留，除 了要做好科學飼養(yǎng)、 精心管理；正確擠奶和預(yù)防疾病外， 還要規(guī)范抗生素的使用， 按國標中有關(guān)規(guī)定， 用藥后的奶牛 5 天后所產(chǎn)的牛奶才可作為原料乳， 并且要檢 測其殘留。世界糧農(nóng)組織（FAO、世界衛(wèi)生組織（WH）、歐盟（EC及美國的 食品和藥品管理局（FDA等對食品中抗生素最大殘留量都有明確的規(guī)定，我國 也有鮮奶中抗生素殘留量檢驗標準（ 94）。 目前，鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類： 生物測定法（微生物測定法、 放射受體測定法）、免疫法（放射免疫法、熒光免疫法、酶聯(lián)免疫法）、理化分 析法（波譜法、色譜及聯(lián)用技術(shù)）。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素殘留檢測 方法。TT

3、C法TTC法是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標準（一94）的檢測法，屬生物檢測法。 其測定原理基于抗生素對微生物的抑制作用。 如果牛奶中含有抗生素， 則加入菌 種（嗜熱鏈球菌）經(jīng)培育3小時后,加入TTC指示劑（三苯基四氮唑）不發(fā)生還原 反應(yīng), 所以樣品呈無色狀態(tài) ; 如果牛奶中不含抗生素 , 則樣品呈紅色 . 這樣實驗后 樣品顏色不變的為陽性 , 樣品染成紅色的為陰性。TTC法的具體操作步驟：1. 菌液制備：將單菌種（嗜熱鏈球菌）以脫脂乳為培養(yǎng)基，在36± 1 C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng) 15 小時后 , 再以脫脂乳以至于 1：1 稀釋待用 ;2. 取待檢樣液9mL,在80C水浴加熱5分鐘后冷卻到

4、37C以下,加活菌液1mL,在 36C± 1C水浴2小時，加入4%1 勺TTC指示劑,36 C± 1C水浴培養(yǎng)30分鐘；3. 若樣液顏色不變?yōu)殛栃?, 呈紅色為陰性 ; 若陽性的樣液 , 再置于水浴中培養(yǎng) 30 分鐘 , 不顯色的為陽性 , 呈紅色為陰性 .TTC法測定各種抗生素的靈敏度為：青霉素:4ppb,鏈霉素:500ppb,慶大霉 素:400ppb,卡那霉素:5000ppb.它具有費用低,易開展的優(yōu)點；缺點是耗時長，要 求操作人員需有一定專業(yè)知識且實驗過程中菌液的制備、 水浴過程控制都要求嚴 格遵守操作規(guī)程，否則易出現(xiàn)假陽性，以致出現(xiàn)檢驗結(jié)果的不穩(wěn)定性。 Delvot

5、est sp 法（戴爾沃檢測法） 該法最早在香港傳到廣東的， 其使用是基于 20 世紀 80 年代初香港要求廣東出口 的生奶必須“無抗”且要求采用 Delvotest 法檢測。該方法也是生物測定法， 其 試劑是由荷蘭DSM公司生產(chǎn)并由AOA（認證。原理是利用微生物一嗜熱芽胞菌在 64C條件下培養(yǎng)3小時后會產(chǎn)酸，酸引起指示劑BCP溴甲酚紫）變?yōu)辄S色;若牛 奶樣品中不含抗生素 , 培養(yǎng)后樣品呈黃色 , 如樣品中含有抗生素 , 嗜熱芽胞菌生 長受到抑制而無法產(chǎn)酸 , 指示劑將不變色 .Delvotest sp 法的操作步驟 :1. 以無菌操作將一片營養(yǎng)藥片夾放入小試管內(nèi) ;2. 用微量移液管將牛奶樣

6、品注入小試管內(nèi) ;3. 把小試管放入已預(yù)熱至64C的水浴箱或恒溫器中培養(yǎng)；4）. 定時 3 小時取出觀察顏色變化 . 如果底部 2/3 的固體介質(zhì)是黃色 , 則為陰性 , 如果底部 2/3 的固體介質(zhì)是紫色 ,則為陽性 .Delvotest sp 法具有廣譜性 ,可檢測到 -內(nèi)酰胺類抗生素在內(nèi)的更多抗生素 , 如 磺胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、氯霉素等，其中對青霉素和磺胺 類抗生素特別靈敏 . 其靈敏度為：青霉素 :3ppb, 鏈霉素 :300ppb, 慶大霉 素 :400ppb, 卡那霉素 :2500ppb 。 Delvotest sp 法集操作方便，嚴格實用，容易 判斷，結(jié)果可

7、靠，費用適中等優(yōu)點；但也易出現(xiàn)假陽性，實驗證明：當牛奶樣品 中添加微生物防腐劑（如乳酸鏈球菌素 Nisn ）或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時， 便可影響嗜熱芽胞菌生長而使實驗為陽性。Snap 法該方法是酶聯(lián)免疫法，由美國IDEXX公司生產(chǎn)其檢測分析儀及其試劑盒，均獲得 AOA（認證，它利用了竟爭酶聯(lián)免疫技術(shù)。其基本原理是用特異性抗體將固相載 體激活，加入含待測抗原的溶液和一定量的酶標記抗原在45C± 5C共同保溫，使樣品內(nèi)的抗生素與內(nèi)置抗生素標志物竟爭與固定的抗體結(jié)合， 然后進行洗滌和 顯色，內(nèi)置抗生素標志物與固定的抗體結(jié)合形成的復(fù)合體， 通過酶的作用分解可 形成有色物質(zhì)，通過測定色度并

8、與參照物對照，就可以確定結(jié)果是陽性或陰性。Snap法操作步驟：1. 加入乳樣于樣品管中 ,搖勻,加熱樣品和檢測板 5分鐘；2. 加入乳樣于樣品孔中,當激活圓環(huán)開始退卻時,按Snap鍵；3. 反應(yīng)4分鐘，由Snap讀數(shù)儀讀取并打印結(jié)果檢測讀數(shù)小于時判為陰性，大于時 判為陽性 .Snap法是一種將酶化學反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方 法，其敏感性和特異性好，檢測的靈敏度以普遍使用的-內(nèi)酰胺類計：青霉素：5ppb, 阿莫西林 :10ppb, 氨芐西林 :10ppb, 頭孢西林 :8ppb. 其他抗生素如四環(huán)素等的檢 測,則需購買相應(yīng)的試劑來檢測 . Snap 法檢測結(jié)果快速準確 ,

9、 9 分鐘內(nèi)即可檢測 出牛奶中 -內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，且有半定量的讀 數(shù)，可監(jiān)控牧場用藥的情況；檢測儀器穩(wěn)定性良好，結(jié)果重現(xiàn)性高，整個檢測過 程簡單方便；但需購置專用儀器和試劑，成本較高。高效液相色譜檢測法它是一種理化檢測方法 , 是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應(yīng)來測定其 含量. 檢測的過程采用了氣相色譜理論 , 通過高壓液相和高靈敏度的檢測器 , 分離 速度快、效率高和操作自動化。一般要經(jīng)過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱 凈化、衍生化等步驟， 能檢測抗生素的具體含量， 敏感性較高， 但檢測程序復(fù)雜， 費用較高，需購買色譜儀等檢測設(shè)備，不適合小型檢驗室。 傳

10、統(tǒng)的抗生素檢測方法不少 , 有的操作煩瑣 , 有的實驗條件要求高 , 有的檢驗時間 太長； 這些不僅會給乳制品生產(chǎn)企業(yè)造成經(jīng)濟上和時間上的損失 , 而且檢測結(jié)果 常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響 . 鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類 健康的公共衛(wèi)生問題 , 乳品企業(yè)及牧場應(yīng)重視和加強檢測工作 , 應(yīng)用一些簡單、快 速和準確性高的方法來監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量，保證消費者的健康。foodonline/id=15933反應(yīng)原理 本產(chǎn)品主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應(yīng)的基本原理來進行的。 在整 個反應(yīng)當中 , 樣品中氯霉素含量越多，反應(yīng)呈色就越淡。反之，樣品中氯霉素含 量越少，則呈色越深。試劑盒組

11、成1、微量測試孔：每條 8 孔，每板 12條2、氯霉素標準溶液：0ppb、 ppb 、 ppb ，瓶3、10 倍濃縮萃取稀釋液：一瓶， 30ml/ 瓶4、10倍濃縮洗滌液：一瓶， 30 ml / 瓶5、氯霉素酶標記物： 一瓶，8 ml/ 瓶6、底物溶液：一瓶， 12 ml/ 瓶7、反應(yīng)終止液：一瓶， 13 ml/ 瓶 使用說明A、注意事項1、使用前先將氯霉素標準溶液 6 瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標記物， 底物溶液及微量測試孔條置于室溫下，回溫 30 分鐘。2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配制用蒸餾水將 10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以 1： 9 的比例稀釋（即 1mL 濃縮液+9mL

12、蒸餾水），即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。3、回溫后， 取出所需微量測試孔條， 將剩余板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好， 置于 4oC 保存。B、樣品制備1. 待測物為生乳，則依以下方法進行處理 （5 倍稀釋 ）取 100ul 待測生乳加入 400ul 萃取稀釋液，振蕩混合后備用。2. 待測物為蜂蜜，則依以下方法進行處理a. 取2g蜂蜜、4ml蒸餾水與2ml乙酸乙酯置入離心管中，震蕩約 5分鐘，使其 充分混合均勻。b. 離心10分鐘（3000rpm），取上清液（乙酸乙酯）至玻璃管中，于50C下氮氣吹 干（溫度請勿超過 50oC）。c. 加入萃取稀釋液，震蕩約 10 秒鐘后備用。3. 待測物

13、為血清、則依以下方法進行處理a. 抽取待檢動物血液， 離心或靜置取其較透明之上層液 （血清層）使用，注意不要 有溶血。b. 將3ml血清加入離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震蕩混合約30秒。c. 離心10分鐘（3000rpm），取2ml上層液（乙酸乙酯）至玻璃管中，于50oC下氮 氣吹干。d. 于此玻璃管中加入正己烷2ml，先將殘余物完全溶解后，再加入 1 ml萃取稀 釋液，震蕩約 30 秒鐘。e. 離心 1 0分鐘（3000 rpm） ，用吸管吸去上層液 （正己烷） 及中間乳化層部分， 棄掉。再吸取下層液 （ 水層） 備用。f. 若有乳化現(xiàn)象，請先將大部分上層液 （正己烷）取出后，再將玻璃管

14、置入 80oC 水中，隔水加熱約 5 1 0分鐘，可改善乳化情形。4. 待測物為雞肉或魚、蝦，則依以下方法進行處理a. 將 3 克樣品剪碎后放入 50 ml 離心管中，再加入 6ml 乙酸乙酯，并以均質(zhì)機均 質(zhì)約 1 分鐘，再震蕩約 30 秒。b. 離心10分鐘（3000rpm），取2ml上清液（乙酸乙酯）至玻璃管中，于50oC下氮 氣吹干。c. 于此玻璃管中加入正己烷2 ml，先將殘余物完全溶解后（若未能完全溶解，可 能會導(dǎo)致回收率降低 ） ，再加入 1 ml 萃取稀釋液，震蕩約 30 秒鐘。d. 離心10分鐘（3000 rpm），用吸管吸去上層液（正己烷）及中間乳化層部分，棄 掉。再吸取下

15、層液 （水層）備用。e. 若有乳化現(xiàn)象，請先將大部分上層液 （正己烷）取出后，再將玻璃管置入 80oC 水中，隔水加熱約 510分鐘，可改善乳化情形。待測物為血清、則依以下方法 進行處理5. 待測物為內(nèi)臟 （肝、心等），則依以下方法進行處理 （5 倍稀釋）同上述步驟ad,但下層液吸出后，再以萃取稀釋液稀釋 5倍（即下層液50ul加 萃取稀釋液 200ml）。6. 待測物為飼料，則依以下方法進行處理 （10 倍稀釋）同上述步驟ad，但下層液吸出后，再以萃取稀釋液稀釋10倍（即下層液30ul加萃取稀釋液 270ml）。C、操作步驟 本產(chǎn)品的酶標記物與氯霉素標準溶液均直接使用，無需再稀釋。1、于適當

16、微孔中分別加入100mL標準溶液（0,和。2、在另外的微孔中加入 100mL 已完成前處理的樣品溶液。3、再于每一微孔中另再加入50mL酶標記物。4、 輕敲盤子四周，使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育1 小時。5、 將微孔中的反應(yīng)液甩掉，再將洗液加滿每一微孔后甩掉，重復(fù)洗3次。6、最后一次甩掉后，在吸水紙上拍干。7、于每一微孔中加入底物溶液100mL后，輕敲盤子四周，使其充分混合。8、于室溫下避光靜置溫育 20 分鐘。9、于每一微孔中加入100mL反應(yīng)終止液。10、用酶標儀于波長450nm下判讀。D判定1. 計算B/B0值。用樣品或標準液吸光度值（B）除以零標準吸光度值（B0）再乘以 100%

17、。2. 以 B/B0 值為縱坐標，以標樣濃度的對數(shù)值為橫坐標，做標準半對數(shù)曲線。3. 根據(jù)每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應(yīng)樣品的濃度。4. 由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘 以其稀釋倍數(shù)。E、標準曲線F、靈敏度氯霉素試劑檢測盒的平均檢測下限為 ，此濃度之吸光值與陰性標準溶液 （0ppb） 之吸光值有明顯的差異。G、特異性針對以下抗生素進行交叉反應(yīng)之測試，結(jié)果如下：Chloramphenicol =100%Chloramphenicol（free base） <%Gentamycin <%Tetracycline <%Penicill

18、in G <%Sulfamethazine <%H、再現(xiàn)性針對氯霉素檢測試劑盒精密度測試， 重復(fù) 6 次，所得不同濃度標準溶液的吸光值 變異系數(shù)（CV如圖2所示，顯示氯霉素試劑盒有很高的再現(xiàn)性：I 、回收率生乳（添加 104117%蜂蜜（添加 90110%蝦及魚肉（添加 95110%雞肉（添加 90120%血清（添加 100120%內(nèi)臟（添加 100120%飼料（添加 80110%氯霉素檢測試劑盒簡介氯霉素 （Chloramphenicol） 是一 種廣譜抗生素。由于其具有效果好以及價格低廉 等優(yōu)點，目前已被普遍應(yīng)用于各類家禽、 家畜、水產(chǎn)品及蜂制品的各種傳染性疾 病的治療。然而氯霉素有其嚴重的副作用 , 它會抑制人體骨髓的造血功能，從而 引起再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥。目前，我國已禁止其使用。我公司采用國內(nèi)外先進的工藝與技術(shù)， 研發(fā)出氯霉素ELISA檢測試劑