薄層試驗(yàn)方法展開(kāi)劑各項(xiàng)

1、1.方法原理薄層色譜是一種微量分析的別離過(guò)程,它將樣品點(diǎn)在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上利用流動(dòng)相在特定的展開(kāi)室中將混合物中的組份推移到不同距離處,在色譜展開(kāi)整個(gè)過(guò)程中,樣品的成份受到正反不同的力的作用. 1流動(dòng)相利用毛細(xì)管力帶著樣品穿過(guò)固定相. 2樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過(guò)程中由于偶極-誘導(dǎo)-偶極相互作用,氫鍵和范德華力的作用 而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等別離機(jī)理. 由于樣品組份與流動(dòng)相和固定相之間的相互作用力程度不同,整個(gè)毛細(xì)管流動(dòng)過(guò)程中別離運(yùn)動(dòng)都在進(jìn)行.基于這點(diǎn),TLC 系統(tǒng) 流動(dòng)相和固定相必須與樣品很好地匹配. 用顯色試劑處理

2、,許多組份可在日光或紫外燈光下檢視.色譜可用肉眼或使用光密度計(jì)和照相機(jī)記錄或影像系統(tǒng)方法來(lái)評(píng)價(jià). 2 .薄層板 2.1 手工自制板 ,最好使用厚薄 12mm 勺優(yōu)質(zhì)平板玻璃,普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板,玻璃板需洗凈至不掛水,晾干,貯存于枯燥潔凈處備用.玻璃板反復(fù)使用時(shí),應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗,保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求 ,將 1 份吸附劑加適量的水如 1 份硅膠 G 一般加 3 份水,在研缽中用研杵沿一個(gè)方向小心研磨至成均勻的有適當(dāng)粘稠度的月漿,立即傾入涂布器中,均勻地向前推進(jìn)涂布在玻璃板上；或根據(jù)不同涂布器的規(guī)定操作涂布；涂布好的薄層板于 室溫下在水平臺(tái)上晾干,

3、再在規(guī)定的溫度一般為 105c110C下烘約 30 分鐘活化,貯于枯燥器中備用.薄層板的厚度一般為0.250.5mm. 2.2 商品化供給的預(yù)制板和高效板 20 x20cm10 x20cm20 x10cm10 x10cm 圖 1 不同的板尺寸 TLC/HPTLC 預(yù)制板有不同的規(guī)格供給.常用的尺寸為 20 x20,10 x20,20 x10,或 10 x10cm.使用的規(guī)格取決于 TLC 或 HPTLC 的類(lèi)別和樣品的數(shù)目. 2.2.3TLC/HPTLC 板的預(yù)洗及活化 一般來(lái)說(shuō),色譜板應(yīng)用溶劑如氯仿-甲醇8:2,甚至用更強(qiáng)的洗脫溶劑的混合物進(jìn)行預(yù)洗.具體操作可通過(guò)空白色譜 展開(kāi)來(lái)實(shí)現(xiàn). 色譜

4、板預(yù)洗完后,應(yīng)在 105.C 加熱 1 小時(shí)進(jìn)行枯燥,再在室溫下置放至少 2 小時(shí)需采取保護(hù)舉措以預(yù)防實(shí)驗(yàn)室空氣中的 污染物重新附著在其上面,如放置在空的枯燥器中. 3 .樣品點(diǎn)樣 3 .1 點(diǎn)狀點(diǎn)樣和條帶狀點(diǎn)樣 每次點(diǎn)樣前,TLC/HPTLC 板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì),只有無(wú)損傷、清潔的 TLC/HPTLC 板方可使用. 樣品可進(jìn)行點(diǎn)狀或條帶狀點(diǎn)樣.要想獲得最正確的薄層分辨率,必須保證移行方向中的起點(diǎn)要小,常規(guī)的 TLC 薄層點(diǎn)狀 點(diǎn)樣每次點(diǎn) 0.5 至 5 微升,相比之下,HPTLCB 層最大點(diǎn)樣量為 1 微升.點(diǎn)樣量較大的樣品可使用自動(dòng)化裝置點(diǎn)樣,噴霧 成

5、條帶狀是一種可以點(diǎn)樣量大而同時(shí)又能促成最有效別離的點(diǎn)樣方法.在常規(guī)操作過(guò)程中,人工點(diǎn)樣一般使用微量毛 細(xì)管0.5/1/2/3 和 5.,點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管必須完全充滿和完全排空,要以垂直方向小心接觸 TLC/HPTL 詼面,不要損 傷薄層,受損的薄層會(huì)導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動(dòng)而在色譜上產(chǎn)生失真的 TLC 譜帶. 人工點(diǎn)樣建議使用 Nanomat.它點(diǎn)樣位置精確并平安,使薄層免于受損.用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)枯燥 Nanomat 也可用作單個(gè)量的屢次點(diǎn)樣. 樣品體積大于 51,通常用如 Linomat 或 AutomaticTLCSamplerIII 的方法用氮?dú)鈬婌F成窄條.假設(shè)就是要求點(diǎn) 狀樣品點(diǎn)樣,Linomat

6、 和 AutomaticTLCSamplerIII 應(yīng)將條長(zhǎng)度設(shè)定在 1 至 2mm, 3.2 樣品點(diǎn)樣位置 起點(diǎn)的最正確位置如圖 2 和 3 所示.起點(diǎn)下緣的最小距離 b 取決于溶劑量.兩個(gè)起點(diǎn)之間的距離 c 必須令平行移行的主成 份不會(huì)相互觸及.點(diǎn)狀點(diǎn)樣時(shí)原點(diǎn)的直徑應(yīng)小于或等于 3mm高效板原點(diǎn)的直徑應(yīng)更小,條帶的長(zhǎng)度 d 由點(diǎn)樣樣品體 積或樣品的種類(lèi)和相對(duì)于板的尺寸點(diǎn)樣的數(shù)目來(lái)決定.到板側(cè)邊的距離 a 必須足夠大以預(yù)防別離區(qū)失真變形見(jiàn)圖 2 和 3. 圖 2：斑狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置a=20mm,b=10mm,c=兩起點(diǎn)之間的距離. 圖 3:條狀樣品點(diǎn)樣的一般點(diǎn)樣位置a=20mm,b=

7、10mm,c=兩起點(diǎn)之間的距離,d=條的長(zhǎng)度. 4 .層析 4.1 展開(kāi)室 具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可限制展開(kāi)箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點(diǎn). 4.1.2 水平展開(kāi)室可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開(kāi),這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個(gè)數(shù)比常規(guī)上行展開(kāi)的 薄層板增加一倍. 4.1.3 自動(dòng)展開(kāi)室AMD可使用五種溶劑對(duì)同一薄層進(jìn)行屢次展開(kāi),自動(dòng)限制預(yù)飽和、展開(kāi)方式、展開(kāi)距離和枯燥條 件,別離效率比傳統(tǒng)方式提升三倍可在 80mm內(nèi)別離 40 種成分,符合 GLP/GM 嗖求. 4.2 .溶劑 使用的溶劑必須是“分析純或“色譜純,溶劑組成采用體積量比如正丁醇-冰乙酸-水=4:1:1,V/V/V, 文檔來(lái)源為：從網(wǎng)

8、絡(luò)收集整理.word 版本可編輯.歡送下載支持 或者絕對(duì)量(如 18ml 甲苯+2ml 甲醇).其總量應(yīng)足以使 TLC/HPTLC 板的浸入深度約為 5mm 展開(kāi)劑要求新鮮配制, 不要屢次反復(fù)使用,如需分層,那么按要求放置分層后取需要的一相(上層或下層),備用. 在雙槽展開(kāi)室中,對(duì)每種類(lèi)型和規(guī)格和層析板,每槽通常注入的溶劑數(shù)量如表 3. 表 3: 板的規(guī)格板的尺寸(寬 X 高)溶劑量 預(yù)制板 20 x20cm2cx10cmM10cm25m115ml8ml 高效板 20X10cm1010cm10ml5ml (1)硫酸Ssulphuriacid)通用顯色劑. 試液： a、5%濃硫酸乙醇或乙酎溶液

9、b、濃硫酸與甲醇或乙醇等體積混合 c、15%濃硫酸正丁醇溶液 方法：用以上任一試液噴灑或浸濕晾干,于 110 攝氏度加熱至呈色,或達(dá)最強(qiáng)熒光. (2)碘(iodine) 通用顯色劑. 試液： a：0.5%碘的氯仿溶液. 噴后處理：待薄層上過(guò)量碘揮散,噴 1%淀粉溶液,斑點(diǎn)轉(zhuǎn)為蘭色,如有過(guò)量碘留在薄層上,那么背景也呈蘭色. b：碘蒸氣：將少許碘晶體放入一密閉的容器內(nèi),使之充滿飽和碘蒸氣,將薄層放入容器片刻或數(shù)分鐘即顯色.有時(shí)在 容器內(nèi)放一小杯水增加濕度,可提升顯色的靈敏度,可提升顯色的靈敏度.在化合物斑點(diǎn)處顯黃-棕色. (3)磷電目酸(molybdophosphoricacid) 用于復(fù)原性化合

10、物、類(lèi)脂、管體化合物等. 試液：5%或 10%磷鋁酸乙醇溶液噴或浸后處理：于 120 攝氏度加熱至最正確顏色形成,如將薄層放入含 25%氫氧化錢(qián)溶 液的容器內(nèi),可使背景顏色消退. (4)香草醛-硫酸(vanillin-sulphuricacid)用于精油、高級(jí)醇、酚等 試液：香草醛 1g 溶于 100ml 硫酸或香草醛 0.5g 溶于 100ml 硫酸-乙醇(1：1)溶液. 噴或浸后處理：于 120 攝氏度加熱至顏色最深. (5)三氯化鐵(ferricchloride)用于酚類(lèi)、羥酰胺酸. 試液：1%5%三氯化鐵的 0.5mol/L 鹽酸溶液. 注：酚類(lèi)呈蘭色或綠色,羥酰胺酸呈紅色. (6)三

11、氯化鋁(aluminiumchloride)用于黃酮類(lèi)化合物. 試液：1%三氯化鋁乙醇溶液,紫外光長(zhǎng)波下斑點(diǎn)顯黃色熒光. 試液：a：次硝酸鈉 0.85g 溶于 10ml 冰乙酸與 40ml 水中. b:碘化鉀 8g 溶于 20ml 水中. 方法：試液 a 和 b 等量混合,置棕色瓶保存試液.用前將試液 1ml 力口 2ml 冰乙酸和 10ml 水混合. 注：顯色斑點(diǎn)呈橙紅色. (8)苛三酮(ninhydrin)用于氨基酸、胺與氨基糖類(lèi) 試液：苗三酮 0.2g 溶于乙醇 100ml 或溶于 100ml 正丁醇,加乙酸 3ml. 噴或浸后處理：于 110 攝氏度加熱至最正確顏色出現(xiàn). (9)鄰苯二

12、甲酸苯胺用于復(fù)原糖. 試液：苯胺 0.93g 和鄰苯二甲酸 1.66g 溶于 100ml 以水飽和的正丁醇中. 噴或浸后處理：于 105 攝氏度加熱 10min,醛己糖及甲基戊糖呈棕色,醛戊糖呈櫻桃紅色 (10)硫酸鈾：用于生物堿 配制方法：10%硫酸鈾(IV)+15%硫酸的水溶液 (11)桑色素(羥基黃酮)通用顯色劑,有熒光活性 配制方法：0.1%桑色素+甲醇 (13)二硝基苯腫(DNP)用于醛和酮 配制方法：12g 二硝基苯腫+60mL 濃硫酸+80mL 水+200mL 乙醇 (14)高鎰酸鉀用于含復(fù)原性基團(tuán)化合物,比方羥基,氨基,醛 配制方法：1.5gKMnO4+10gK2CO3+1.2

13、5mL10%NaOH+200mL 水.使用期 3 個(gè)月 (15)澳甲酚綠用于竣酸,pKa=5.0 配制方法：在 100ml 乙醇中,參加 0.04g 澳甲酚綠,緩慢滴加 0.1M 的 NaOH 水溶液,剛好出現(xiàn)藍(lán)色即至. (16)鋁酸鋪通用顯色劑 配制方法：235mL 水+12g 鋁酸氨+0.5g 鋁酸錦氨+15mL 濃硫酸 (17)茴香醛(對(duì)甲氧基苯甲醛)1 通用顯色劑 配制方法：135 乙醇+5mL 濃硫酸+1.5mLof 冰醋酸+3.7mL 茴香醛,劇烈攪拌,使混合均勻. 茴香醛(對(duì)甲氧基苯甲醛)2 用于菇烯,枝樹(shù)腦(cineoles),withanolides,出油柑堿(acronyc

14、ine) 配制方法:茴香醛:HClO4:丙酮：水(1:10:20:80) (18)醋酸改進(jìn)碘化鈾鉀試液的配制：A.取次硝酸鈾 0.52g 加冰醋酸 6ml,純化水 24ml;B.取碘化鉀 12g 加純化水 3 0ml.將 A、B 兩液混合,再加純化水 120ml,冰醋酸 160ml 即得. 實(shí)例談薄層色譜展開(kāi)劑選擇 根據(jù)本人的幾年薄層層析經(jīng)驗(yàn),參考藥典等國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)文獻(xiàn),將 2000 版藥典一部里局部有代表性 的對(duì)照品的薄層層實(shí)例按展開(kāi)劑極性排序,并對(duì)其規(guī)律做一些分析.以下的分析和介紹是總體描述性的,目的是快速、簡(jiǎn)便地選擇展開(kāi)劑.如果想了解展開(kāi)劑選擇的各種理論,請(qǐng)參考其他專(zhuān)著. 選擇展開(kāi)

15、劑,要依據(jù)溶劑極性和他們的混溶性,溶劑對(duì)被分析物的溶解性,以及被分析物的結(jié)構(gòu).這里只討 論藥典里通常使用的以硅膠為固定相主體的正相薄層,也不考慮板的活性.E(5LQ3Y 列出溶劑極性參數(shù)表,方便以下比擬展開(kāi)劑.環(huán)已烷：-0.2、石油醍(I 類(lèi),3060C)、石油醍(n 類(lèi),6090C)、正文檔來(lái)源為:從網(wǎng)絡(luò)收集整理.word 版本可編輯.歡送下載支持. 已烷:0.0、甲苯:2.4、二甲苯:2.5、苯:2.7、二氯甲烷:3.1、異丙醇:3.9、正丁醇:3.9、四氫呋喃:4.0、氯仿:4.1、乙醇:4.3、 乙酸乙酯:4.4、甲醇:5.1、丙酮:5.1、乙腈:5.8、乙酸:6.0、水:10.21.

16、 關(guān)于溶劑混溶性,一般根據(jù)相似相溶原那么,需要注意,極性相差大的不混溶,比方正己烷與甲醇.多元展 開(kāi)劑,主體的兩種溶劑不能混溶,就需要通過(guò)第三種溶劑來(lái)調(diào)和.比方：石油醚、正庚烷、正已烷、戊烷、環(huán)已烷和 甲醇、水之類(lèi)的.K#;#I 一般正相色譜,固定相為極性,被分析物質(zhì)的極性越大,需要極性更大的展開(kāi)劑.Ni-yl<y_ 了解被分析物的極性可以通過(guò)分析其結(jié)構(gòu)獲得,很難獲得它的極性指數(shù).物質(zhì)分子化學(xué)結(jié)構(gòu)中,通常由較極性局部和 非極性局部?jī)删植?例如下面以苯丙烷為極性小局部,隨著極性基團(tuán)局部的增加,總體的極性就增加,展開(kāi)劑極性也 增加了. ,依次為肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸.

17、SNZ;V 相應(yīng)展開(kāi)劑分別為：正己烷乙醚冰醋酸(5:5:0.1)、苯冰醋酸甲醇(30:1:3)、氯仿甲醇甲酸(9:1:0.5)、石油 醚乙酸乙酯甲酸(3:6:1)、醋酸丁酯甲酸水(7:2.5:2.5).(由于薄層板、比移值不同的原因,展開(kāi)劑極性比擬是 相對(duì)的,并非絕對(duì)的后者大于前者).?5$d|fE= 現(xiàn)在最重要的問(wèn)題是,不同化合物,怎么定它的極性,又用什么標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定它對(duì)應(yīng)的展開(kāi)劑呢？以下分開(kāi)討論不同化合 物極性情況及其對(duì)應(yīng)的展開(kāi)劑.bJuHg.HVq 首先是極性較小的揮發(fā)性物質(zhì).比方：冰片：石油醛(3060C)一醋酸乙酯(17:3)、厚樸酚：苯醋酸乙酯(9:1.5)、“- 香附酮：苯醋酯乙酯冰

18、醋酸(92:5:5)、丹皮酚：環(huán)己烷醋酸乙酯(3:1),這類(lèi)化合物,以石油醚、正構(gòu)烷和苯為體 積百分?jǐn)?shù)比擬大的溶劑,通常起溶解和別離化合物的作用,而用醋酸乙酯為調(diào)節(jié) Rf(比移值)的溶劑.為了減少拖尾 之類(lèi)其他相似相溶原那么以外的影響,適當(dāng)參加添加劑,如有機(jī)酸或者有機(jī)堿.2rkf$)QM 極性較小的不揮發(fā)性物質(zhì).比方：3-谷管醇：環(huán)己烷一醋酸乙酯一甲醇(6:2.5:1)或者環(huán)己烷一丙酮(5:2)、熊果酸：甲 苯醋酸乙酯冰醋酸 12:4:0.5)、齊墩果酸：氯仿甲醇(40:1)、豬去氧膽酸：氯仿乙醚冰醋酸(2:2:1)、大黃素： 苯一醋酸乙酯一甲醇(15:2:0.2)或者苯一乙醇(8:1)、丹參

19、酮 HA:苯-醋酸乙酯-甲酸(40:25:4)、穿心蓮內(nèi)酯：氯仿-無(wú)水 乙醇 9:1)、靛玉紅、靛藍(lán)氯仿乙醇(9:1)或者苯氯仿丙酮(5:4:1).這類(lèi)物質(zhì)展開(kāi)劑極性比極性較小的揮發(fā)性物質(zhì)洗 脫力強(qiáng)一些,由于這類(lèi)物質(zhì)極性小的母核大,而極性大的基團(tuán)通常可以形成氫鍵,比方羧酸、羥基.以上物質(zhì),母核 分子量減小、母核結(jié)構(gòu)中不飽和健的增加(尤其是出現(xiàn)苯環(huán)),極性基團(tuán)的增加,都使極性增加,展開(kāi)劑極性也增大. 這個(gè)范圍內(nèi)的物質(zhì)很多,一般展開(kāi)劑大百分?jǐn)?shù)的溶劑可以從環(huán)己烷甲苯二甲苯苯氯仿的順序,根據(jù) 極性要求選擇.這里注意,異丙醇、正丁醇極性指數(shù)也比擬小,在這范圍的化合物很少用,由于粘性大、展開(kāi)慢,造 成斑點(diǎn)

20、擴(kuò)散；另外,羥基的氫鍵作用力也有不利.調(diào)節(jié) Rf 值的溶劑,從醋酸乙酯甲醇丙酮乙醇.揮發(fā)性 物質(zhì)也有很多帶羰基、羥基的,但從它的揮發(fā)性就可以明白,分子間作用力不強(qiáng),另外,母核與石油醚、正構(gòu)烷和苯 的結(jié)構(gòu)差異小,估計(jì)更容易脫離硅膠吸附,更快進(jìn)入溶劑中,而不需要通過(guò)提升展開(kāi)劑的極性.bt6o7Z 皂苷類(lèi).人參皂苷：氯仿甲醇水(65:35:10)10以下放置的下層溶液或正丁醇醋酸乙酯水(4:1:5)的上層溶液或 氯仿醋酸乙酯甲醇水(15:40:22:10)10以下放置的下層溶液、芍藥苷：氯仿醋酸乙酯甲醇甲酸(40:5:10:0.2)、 黃芩苷：醋酸乙酯丁酮醋酸水(10:7:5:3)、橙皮苷：苯醋酸乙

21、酯甲酸水(1:12:2.5:3)的上層溶液、葛根素：氯 仿甲醇水 14:5:0.5)、蘆?。捍姿嵋阴ゼ姿崴?8:1:1).這類(lèi)物質(zhì),由于存在糖的多羥基結(jié)構(gòu),苷元的結(jié)構(gòu)影響變 小.展開(kāi)劑中使用極性大的有機(jī)溶劑(氯仿、醋酸乙酯、甲醇、正丁醇)和水.乙酸和甲酸的使用,一方面增大展開(kāi) 劑極性,另外也可以抑制硅膠羥基的作用,減少拖尾.由于混溶性和硅膠耐酸水平的限制,水和酸的使用是有限度的. CB4d 極性大的小分子有機(jī)酸.沒(méi)食子酸：氯仿醋酸乙酯甲酸(5:4:1)、阿魏酸、咖啡酸、菊苣酸、綠原酸、異綠原酸. 這類(lèi)物質(zhì)多數(shù)是苯乙烯母核的,這個(gè)結(jié)構(gòu)的極性本身比擬大,另外有酚羥基和羧酸基團(tuán),個(gè)別有多羥基配基.皂

22、苷的 展開(kāi)劑差不多,極性大.注意甲酸通常指的是濃度 85%左右的,含有水.CbcnSr3EJ 含氮有機(jī)物.鹽酸小檗堿：苯醋酸乙酯甲醇異丙醇濃氨試液(12：6：3：3：0.6)(氨蒸氣飽和)或正丁醇冰醋 酸-水 7:1:2)、麻黃堿：氯仿甲醇濃氨試液(20:5:0.5)或正丁醇冰醋酸水(8:2:1)、甘草酸銨：醋酸乙酯甲酸冰 醋酸水(15:1:1:2).由于 NH2 硅醇基的作用很強(qiáng),在強(qiáng)極性展開(kāi)劑加有機(jī)酸、有機(jī)堿掃尾.對(duì)于極性化合物,使用正 丁醇對(duì)斑點(diǎn)擴(kuò)散影響較小,由于化合物和硅膠的作用強(qiáng).DBA#kvL: 進(jìn)行薄層分析根本可以根據(jù)母核、基團(tuán),選擇相似的化合物對(duì)號(hào)入座.當(dāng)然,具體的條件優(yōu)化那么

23、需要根據(jù)實(shí)際情況了. 遇到較困難的別離,需要使用到做有機(jī)合成時(shí)走板子是常有的事情,展開(kāi)劑的選擇就至關(guān)重要了.需要使用到設(shè)計(jì)優(yōu)化方法的,已經(jīng)不屬于本文討論范圍了薄層色譜,或稱(chēng)薄層層析 thinlayerchromatography ,是以涂布于支持板上的支持物作為固定相,以適宜的溶劑為流動(dòng)相,對(duì)混合樣品進(jìn)行別離、鑒定和定量的一種層析別離技術(shù).這是一種快速別離諸如脂肪酸、類(lèi)固醇、氨基酸、核 苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法,從 50 年代開(kāi)展起來(lái)至今,仍被廣泛采用. 薄層層析 一根本原理 薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板常用玻璃板,也可用滌綸布等上形成薄層,然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開(kāi)

24、.薄層 層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同,分為薄層吸附層析吸附劑、薄層分配層析纖維素、薄層離子交換層析離子交 換劑、薄層凝膠層析分子篩凝膠等.一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析. 吸附是外表的一個(gè)重要性質(zhì).任何兩個(gè)相都可以形成外表,吸附就是其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此外表 上的密集現(xiàn)象.在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的外表上,都可能發(fā)生吸附現(xiàn)象. 物質(zhì)分子之所以能在固體外表停留,這是由于固體外表的分子離子或原子和固體內(nèi)局部子所受的吸引力不相等.在固 體內(nèi)部,分子之間相互作用的力是對(duì)稱(chēng)的,其力場(chǎng)互相抵消.而處于固體外表的分子所受的力是不對(duì)稱(chēng)的,向

25、內(nèi)的一 面受到固體內(nèi)局部子的作用力大,而外表層所受的作用力小,因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體外表時(shí)受到這種 剩余力的影響,就會(huì)被吸引而停留下來(lái).吸附過(guò)程是可逆的,被吸附物在一定條件下可以解吸出來(lái).在單位時(shí)間內(nèi)被 吸附于吸附劑的某一外表積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開(kāi)此外表的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡,稱(chēng)為吸附平衡.吸 附層析過(guò)程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程. 例如用硅膠和氧化鋁作支持劑,其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同,使混合物得以別離.當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動(dòng) 時(shí),帶著樣品中的各組分一起移動(dòng),同時(shí)發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用.由于各組分在溶劑中的溶解度 不同,

26、以及吸附劑對(duì)它們的吸附水平的差異,最終將混合物別離成一系列斑點(diǎn).如作為標(biāo)準(zhǔn)的化合物在層析薄板上一 起展開(kāi),那么可以根據(jù)這些化合物的 Rf 值后面介紹 Rf 值對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)行鑒定,同時(shí)也可以進(jìn)一步采用某 些方法加以定量. 薄層層析有許多優(yōu)點(diǎn)：它保持了操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、顯色容易等特點(diǎn),同時(shí)展開(kāi)速率快,一般僅需 1520 分鐘；混 合物易別離,分辨力一般比以往的紙層析高 10100 倍,它既適用于只有 0.01dg 的樣品別離,又能別離大于 500mg 的樣品作制備用,而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類(lèi)的腐蝕性顯色劑.薄層層析的缺點(diǎn)是對(duì)生物高分子的別離效果不甚理想. 二固定相支持劑的選擇和處理

27、 在薄層層析時(shí),對(duì)支持劑的選擇主要考慮兩方面：一是支持劑的性質(zhì)與適用范圍；二是支持劑的顆粒大小.一般來(lái)說(shuō), 所選吸附劑應(yīng)具有最大的比外表積和足夠的吸附水平,它對(duì)欲別離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的吸附水平,即有足夠的分辨 力；所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反響.吸附力的強(qiáng)弱規(guī)律可概括如下：吸附力與兩相間界面張力的降 低成正比,某物質(zhì)溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比.極性吸附劑易吸附極性物質(zhì),非極性吸附劑易 吸附非極性物質(zhì).同族化合物的吸附程度有一定的變化方向,例如,同系物極性遞減,而被非極性外表吸附的水平將 遞增. 1支持物的性質(zhì)與適用范圍 薄層層析的支持劑較常用的是硅膠、氧化鋁、硅

28、藻土、纖維素、聚酰胺及 DEAE纖維素. 1硅膠硅膠是應(yīng)用最廣泛的一種極性吸附劑.它的主要優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)惰性,具有較大的吸附量,易制備成不同類(lèi)型、孔 徑、外表積的多孔性硅膠,一般以 SiO2?xH2O 通式表示.硅膠的吸附活性取決于含水量,吸附層析一般采用含水量為 10%12%的硅膠,含水量小于 1%的活性最高,而大于 20%時(shí),吸附活性最低.用加熱脫水法可使硅膠活化,降低 吸附活性的硅膠能顯著改善別離性能,增加樣品的負(fù)載量. 硅膠適用于別離酸性和中性物質(zhì),堿性物質(zhì)能與硅膠作用,因此如用中性溶劑展開(kāi),堿性物質(zhì)有時(shí)留在原點(diǎn)不動(dòng),或 者斑點(diǎn)拖尾,而不能很好地別離.為了使某一類(lèi)化合物得到滿意的別離,可改

29、變硅膠酸堿性.例如,可用稀酸或稀堿 液0.10.5mol/L或一定 pH 值的緩沖溶液代替水制備酸性、堿性或某一 pH 值的薄層；也可在硅膠中參加氧化鋁堿 性制成薄層；或在展開(kāi)劑中參加少量的酸或堿進(jìn)行展層. 使用硅膠和硅藻土?xí)r,通常要先參加粘合劑再在支持板上涂布.常用的粘合劑為煅石膏和淀粉,在硅膠、氧化鋁和硅但具有耐腐蝕性試劑的優(yōu)點(diǎn).加淀粉制成的薄層,機(jī)械性能較好,但不宜用腐蝕性強(qiáng)的試劑. (2)氧化鋁氧化鋁為微堿性吸附劑,適用于親脂性物質(zhì)的別離制備,氧化鋁具有較高的吸附容量,價(jià)格低廉,別離效果 好,因此應(yīng)用也較廣泛. 在使用氧化鋁作吸附層析時(shí),要注意選擇適當(dāng)活性及適當(dāng)酸堿度的產(chǎn)品.氧化鋁通常

30、可按制備方法不同而分為堿性、 中性和酸性三種.堿性氧化鋁可應(yīng)用于碳?xì)浠衔锏膭e離；中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、某些苷類(lèi)及酸堿溶液中不 穩(wěn)定的酯、內(nèi)酯等化合物的別離；酸性氧化鋁適用于天然及合成的酸性色素以及醛、酸的別離. (3)聚酰胺聚酰胺由己二酸與己二胺聚合而成,也可用己內(nèi)酰胺聚合而成,因它們都含有大量酰胺基團(tuán),故統(tǒng)稱(chēng)聚酰胺. 聚酰胺薄膜層析是 1966 年后開(kāi)展起來(lái)的一種薄層層析方法,用此方法分析氨基酸衍生物 DNP 一氨基酸、PTH 一氨基 酸、DNS 一氨基酸及 DABTH 一氨基酸時(shí),具有靈敏度高、分辨力強(qiáng)、展層迅速和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn).目前由國(guó)產(chǎn)原料 制成的聚酰胺薄膜性能良好、效果滿意,

31、已用于酚類(lèi)、醌類(lèi)、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸堿基、核苷、核 苷酸、雜環(huán)化合物、合成染料；磺胺、抗菌素、環(huán)酮、殺蟲(chóng)劑及維生素 B 等 16 類(lèi)化合物的分析. (4)硅藻土和纖維素它們是中性支持劑,需在吸附水、緩沖溶液或甲酰胺等之后,才能用于薄層層析. 2支持劑的顆粒大小 用作薄層層析固定相的支持劑顆粒,要求大小適當(dāng)、均勻.顆粒過(guò)大,展開(kāi)時(shí)溶劑推進(jìn)速率太快,別離效果不好；顆 粒太小,展開(kāi)太漫,斑點(diǎn)拖尾不集中,別離效果也差.顆粒大小固定在一定范圍內(nèi)并且薄層厚度均勻一致時(shí),每次得 出的 Rf 值即可保持恒定.無(wú)機(jī)類(lèi)支持劑的顆粒以 150200 目(直徑為 0.070.1mm)、薄層厚度為 0.

32、251mm 較 適宜.有機(jī)吸附劑如纖維素等的顆粒為 70140 目(直徑 0.10.2mm)、薄層厚度為 12mm 最恰當(dāng). (三)薄層板制作 薄層板制作簡(jiǎn)稱(chēng)制板,是指作為固定相的支持劑被均勻地涂布在玻板上,形成一薄層.所用的玻板要求外表平滑、清 潔.玻板的大小按需要選定,常用的規(guī)格為 6cmx20cm、20cmx20cm 及 2.5cmX7.5cm. 1軟板制作 軟板也稱(chēng)干板,是不加粘合劑,將支持劑干粉直接均勻地鋪在玻板上制成的.這種薄層板制作簡(jiǎn)單,展開(kāi)快,但極易 吹散.其具體制作方法如下： (1)選用直彳至約為0.5cm 的玻璃管一根,根據(jù)薄層的厚度(一般為 0.41mm)在其兩端繞膠布數(shù)

33、圈. (2)將支持物干粉倒在玻板上,固定玻板一端以防玻璃推進(jìn)時(shí)移動(dòng). (3)將玻璃管壓在玻板上,將支持劑干粉由一端推向另一端即成薄層. 2硬板制作 硬板或稱(chēng)濕板,是將支持劑加粘合劑和水或其他液體后,均勻地鋪在玻璃板上,再經(jīng)烘干而成的薄層板.制作方法可 用專(zhuān)門(mén)的薄層制板器,也可用手工,均能得到滿意的效果.下面介紹三種手工涂布制板的方法： (1)玻棒涂布將支持劑用水或適當(dāng)溶劑調(diào)成膠漿,倒在玻板上,然后依軟板制作相同方法,用玻棒在玻板上將支持劑由 一端向另一端推動(dòng),即成薄層. (2)玻片涂布在玻板兩旁放置兩塊稍厚的玻板,把支持劑膠漿倒在中間的玻板上,然后用另一塊玻片的邊緣將膠漿刮向 另一端,即成一定

34、厚度的薄層.枯燥后用刀刮去薄板兩側(cè)的支持劑.更換玻板兩旁不同厚度的玻片,即可調(diào)節(jié)薄層的 厚度. (3)傾斜涂布將支持劑膠漿倒在玻片上,然后將玻板傾斜,使膠漿均勻涂布于玻板上.上述任何一種方法將支持劑均勻 涂布于玻板上后,靜置片刻,待薄層外表無(wú)水漬后,置烘箱中,讓溫度升到 100,持續(xù) 1 小時(shí).關(guān)閉電源,待溫度降 至接近室溫時(shí),取出薄層板,放入枯燥器備用.此一步驟稱(chēng)為活化. (四)點(diǎn)樣 點(diǎn)樣是將經(jīng)處理后的樣品點(diǎn)加在薄層的特定部位,這是一項(xiàng)需要十分仔細(xì)的操作步驟,點(diǎn)樣的好壞會(huì)直接影響別離效 果.點(diǎn)樣可用玻璃毛細(xì)管,如作定量測(cè)定,應(yīng)使用微量移液管或微量注射器,市售血球計(jì)數(shù)管經(jīng)加工磨尖頭部并標(biāo)定 體

35、積后使用也甚理想.點(diǎn)樣的位置,上彳 T 展開(kāi)法一般點(diǎn)樣在離薄層下端 45cm 處,下行展開(kāi)法在離上端 68cm 處. 如作雙相紙層析別離,點(diǎn)樣處應(yīng)位于距薄層右側(cè)邊 5cm 與距底邊 5cm 直線的交點(diǎn). 薄層層析點(diǎn)樣方法應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： (1)樣品最好用具揮發(fā)性的有機(jī)溶劑(如乙醇、氯仿等)溶解,不應(yīng)用水溶液,因水分子與吸附劑的相互作用力較弱,當(dāng) 它占據(jù)了吸附劑外表上的活性位置時(shí),就使吸附劑的活性降低,而使斑點(diǎn)擴(kuò)散. (2)點(diǎn)樣量不宜太多,否那么會(huì)降低 Rf 值,一般為幾到幾十體積為 120dg (3)原點(diǎn)直徑要限制在 2mm 以內(nèi).欲達(dá)此目的,就須分次點(diǎn)樣,邊點(diǎn)樣,邊用冷、熱風(fēng)交替吹干. (4

36、)薄層板在空氣中不能放置太久,否那么會(huì)因吸潮降低活性. (五)展層 1展開(kāi)劑的選擇 選擇展開(kāi)劑須視被別離物的極性及支持劑的性質(zhì)而定.對(duì)初選展開(kāi)劑適宜與否的評(píng)價(jià),要根據(jù)其別離有效成分的效果 來(lái)確定.如果不適宜,還需進(jìn)行極性調(diào)整,直到到達(dá)對(duì)有效成分的完全別離為止. 如果薄層層析所用的支持劑是吸附劑,在同一吸附劑上,不同化合物的吸附性質(zhì)有如下規(guī)律：飽和碳?xì)浠衔锊灰?被吸附；不飽和碳?xì)浠衔镆妆晃?分子中雙鍵愈多,那么吸附得愈緊密；當(dāng)碳?xì)浠衔锉灰粋€(gè)功能基取代后, 吸附性增大.吸附性較大的化合物,一般需用極性較大的溶劑才能推動(dòng)它. 選擇展開(kāi)劑的另一個(gè)依據(jù)是溶劑的極性大小.一般而論,在同一種支持劑上

37、,凡溶劑的極性愈大,那么對(duì)同一性質(zhì)的化 合物的洗脫水平也愈大,即在薄層上能把此化合物推進(jìn)得愈遠(yuǎn),Rf 值也愈大.如果用一種溶劑去展開(kāi)某一成分,當(dāng)發(fā) 現(xiàn)它的 Rf 值太小時(shí),可考慮換用一種極性較大的溶劑,或在原來(lái)的溶劑中參加一定量極性較大的溶劑進(jìn)行層層.溶劑 極性大小的次序是： 石油醚二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇甲醇水. 2展層 展層裝置種類(lèi)較多,根據(jù)展層方式根本上可分上行、下行、連續(xù)及水平式四種.不加粘合劑的薄層只能作近水平式(板 與水平成 10 度20 度角)的上行或下行展開(kāi).不管何種展層方式,展層容器必須關(guān)閉,并事先要使展開(kāi)劑蒸氣到達(dá)飽 和.容器的體

38、積大小要視薄層板的面積而定,由于大容器要到達(dá)溶劑蒸氣飽和所需的時(shí)間比小的長(zhǎng).根據(jù)實(shí)驗(yàn)證實(shí), 在不飽和的展層裝置中,由于混合展開(kāi)劑內(nèi)含有幾種揮發(fā)性試劑,致使薄層板邊緣與中間的試劑比例不同,因此樣品 在邊緣和中間展層的距離也不同,這種現(xiàn)象稱(chēng)為邊緣效應(yīng),嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響別離效果. 薄層層析時(shí)為了獲得更好的別離效果,可采用雙向展層和分次展層.分次展層是先用一種溶劑展開(kāi)至一定距離后,將 薄層板取出,待溶劑揮發(fā)后再按同一方向用第二種溶劑展開(kāi). (六)顯色和定量 薄層板展開(kāi)完成后,從展開(kāi)裝置中取出,于室溫或烘箱中枯燥,然后根據(jù)被別離物質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì),選用相應(yīng)的顯色 劑噴霧顯色,或用紫外燈檢測(cè)被別離的物質(zhì)斑點(diǎn),測(cè)

39、量和計(jì)算各斑點(diǎn)的 Rf 值.通過(guò)薄層層析被別離的各種溶質(zhì)組分在 濾紙上移動(dòng)的速率通常用 Rf 表示： Rf=組分移動(dòng)的距離/溶劑前沿移動(dòng)的距離 =原點(diǎn)至組分斑點(diǎn)中央的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離. 在薄層、溶劑、溫度等各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件恒定的情況下,各物質(zhì)的 Rf 值是不變的,它不隨溶劑移動(dòng)距離的改變而變化.Rf 與分配系數(shù) K 的關(guān)系： Rf=1/(1+aK) a 是由薄層性質(zhì)決定的一個(gè)常數(shù).由此可見(jiàn),K 值愈大,溶質(zhì)分配于固定相的趨勢(shì)愈大,而 Rf 值愈?。环粗?K 值愈 小,那么分配于流動(dòng)相的趨勢(shì)愈大,Rf 值是定性分析的重要指標(biāo). 在樣品所含溶質(zhì)較多或某些組分在單相薄層層析中的 Rf 比擬接近

40、,不易明顯別離時(shí),可采用雙相薄層層析法.該法是 將濾紙?jiān)谀骋惶厥獾娜軇┫到y(tǒng)中按一個(gè)方向展層以后,即予以枯燥,再轉(zhuǎn)向 90 度,在另一溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行展層,待溶 劑到達(dá)所要求的距離后,取出薄層,枯燥顯色,從而獲得雙相層析譜.應(yīng)用這種方法,如果溶質(zhì)在第一種溶劑中不能 完全分開(kāi),而經(jīng)過(guò)第二種溶劑的層析能得以完全分開(kāi),大大地提升了別離效果. 由于薄層層析在分析定量時(shí)需注意以下幾點(diǎn)： (1)在噴霧顯色時(shí),不加粘合劑的薄層要小心操作,以免吹散吸附劑. (2)薄層層析還可以用強(qiáng)腐蝕性顯色劑,如硫酸、硝酸、鉻酸或其他混合溶液.這些顯色劑幾乎可以使所有的有機(jī)化合 物轉(zhuǎn)變?yōu)樘?如果支持劑是無(wú)機(jī)吸附劑,薄層板經(jīng)此類(lèi)顯色劑噴霧后,被別離的有機(jī)物斑點(diǎn)即顯示黑色.此類(lèi)顯色劑 不適用于定量測(cè)定或制備用的薄層上. (3)如果樣品斑點(diǎn)本身在紫外光下不顯熒光,可采用熒光薄層檢測(cè)法,即在吸附劑中參加熒光物質(zhì),或在制備好的薄層 上噴霧熒光物質(zhì),制成熒光薄層.這樣在紫外光下薄層本身顯示熒光,而樣品斑點(diǎn)不顯熒光.吸附劑中參加的熒光物 質(zhì)常用的有 15硅酸鋅鎘粉,或在薄層上噴霧 004熒光素鈉、05硫酸奎寧醇溶液或 1磺基水楊酸的丙酮溶 液. 文檔來(lái)源為