Transwell是檢測細胞侵襲能力的檢測方法.資料

1、Transwell是檢測細胞侵襲能力的檢測方法我們所使用的是Chemicon公司的ECM554,基質(zhì)膠已經(jīng)包被好了，買來就可以用, 很方便，而且我彳門算過，跟自己買膠來包被價格相差不大。這種膠 4度下很軟,37度則 變得比較堅硬，因此用前應先放在培養(yǎng)箱中10分鐘作用，使膠完全凝固。該試劑盒對穿過膜的細胞進行熒光染色，再用裂解液裂解細胞后檢測熒光值。我們在實際使用的時候?qū)Υ┻^膜的細胞采用1%結晶紫染色，鏡下計數(shù)細胞數(shù)目。結晶紫也可以用33%醋酸溶解，再用酶標儀570nm檢測，同樣可以反應穿過細胞數(shù)因為基質(zhì)膠的厚度直接影響穿過膜的細胞數(shù)，因此建議有條件的話還是買這類 已經(jīng)鋪好膠的試劑盒，比較可靠。

2、說明書該公司網(wǎng)上可以下載，對原理也有比較詳細的闡述，可以去查一下。我們做的時候，上室用0.5%BSA的培養(yǎng)液，下室用5%血清的培養(yǎng)液，下室血清的 濃度可根據(jù)細胞類型的不同進行調(diào)整，如果細胞侵襲能力強，可適當降低血清濃度，否 則可適當提高血清濃度。需要注意的是：1。上室內(nèi)的細胞數(shù)目要適當，過多,穿過膜的細胞會過多過快，如果用計數(shù)法的 話將難以計數(shù)；最少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有細胞存在。具體細胞密度 需要自己摸索。2。細胞計數(shù)的準確性對結果影響很大，各組間最好不要分開計數(shù)。盡量用同一 密度的細胞懸液給予不同處理，保證各組細胞量一致3。對細胞的處理不可影響細胞生存。否則難以肯定是細胞量的改

3、變還是侵襲能力改變侵襲小室其實不止是transwell的,其它像Boyden chamber Thincert也挺好用 的。我用過Thincert,個人感覺不錯，而且價格便宜，是grelner的，孔徑8微米用于24 孔板的一個才45塊人民幣，而且可以零買，不想transwell,總是一箱一箱的賣，實在是 太貴了！侵襲實驗要結合實驗目的，不一定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵襲實驗的步驟(摘自A quantitative cell migration assay using ThinCert? cell culture inserts，大家如需要，可用 google搜之：1. Prep

4、are cell cultures according to standard cell culture procedures2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA3. Harvest cells and wash them twice in PBS4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml5. Place 24 well ThinCe

5、rtTM cell culture inserts in the wells of a CELLSTAR? 24 well cell culture plate6. Add 600 l culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate7. Add 200 l cell suspension to each cell culture insert8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture in

6、cubator at 37C and 5 % CO29. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 l serum-free culture medium with 8 M Calcein-AM10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO211. Remove the culture medium from the cell culture inserts1

7、2. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 l prewarmed Trypsin-EDTA per well13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO2, ag itate the plate from time to time14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 l

8、of the Trypsin-EDTA solution （now containing the migratory cells from each well into a black flat bottom 96 well plate15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm從第9步開始計數(shù)侵襲細胞時，這份說明書用的是熒光標記，但這種方法成本高 而且繁瑣。我做的時候改為giemsa染

9、色,發(fā)現(xiàn)效果不錯，具體如下：9 .侵襲實驗完成后，取出小室，用棉簽小心將膜上表面的細胞擦拭去除；10 用手術刀片小心沿小室邊緣將膜切下；11 .把膜下表面向上放在一個潔凈的24孔板的孔中；12 .甲醇:冰醋酸（3:1固定10min后用10%giemsa染色;13 .在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)細胞（即染成紫紅色的點，未著色的多為細 胞碎屑計數(shù)并拍照留念Transwell細胞體外侵襲實驗概述目的:總結并改進細胞體外侵襲實驗的操作經(jīng)驗。方法：采用改進后細胞體外侵 襲實驗分別研究不同濃度TNFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱;粉防己堿對HUVEC人類臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移能力的

10、抑制作用；VEGF對人結 腸癌HT229細胞體外侵襲能力的影響。結果：改進后侵襲試驗定位準確，結果清晰。 結論:按照作者建議的方法操作，能夠縮短實驗時間，有助于提高細胞體外侵襲實驗的 質(zhì)量。細胞體外侵襲實驗主要應用于各種細胞因子對惡性月中瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影 響及一些抑制血管生成的新藥研究，但在具體實驗中獲得真實、最佳實驗結果的圖 像,并借以說明問題并非簡單。很多研究人員在此方面花費了很多時間和科研經(jīng)費，從刺激實驗用的細胞到蘇木素染色，看似簡單的實驗步驟中有很多環(huán)節(jié)需要研究者注意.材料與方法1.1Matrigel:Becton Dickinson Compary, - 20 C 保存；Tans

11、well plate:Costar ,USA , # 3422 聚碳酯膜微孔直徑為 8 pm;蘇木素染液，梯度乙醇，二甲苯溶液。1.2 趨化因子的制備取傳代第二天長勢良好的NIH3T3細胞，無血清培養(yǎng)基輕柔漂洗兩次；加入無血清培養(yǎng)基，37C ,5 %CO2培養(yǎng)24 h48h收集細胞培養(yǎng)上清;4 C,12 000rpm離心,10 min，取上清;0.22 11m膜過濾除菌；分裝，在-20 C保存。1.3transwell培養(yǎng)板準備所有操作均需無菌操作。-20C保存的Matrigel在冰上保 2C8c過夜融化。在冰上用預冷的槍頭吸取100仙l Matrige加入冰預冷的300 比血清培養(yǎng)基中，充分

12、混均。取上述稀釋的 Matrigel 25 加入transwell板上室，覆蓋整 個聚碳酯膜,37 ,30 min，使Matrigel聚合成膠。已鋪好 Matrigel的transwell培養(yǎng) 板置于37c可保存2周。1.4Matrigel侵襲實驗（Matrigel Invasion Assay刺激后的各組細胞用 PBS漂洗3 次。以常規(guī)方法用無血清培養(yǎng)基制備單細胞懸液，5 105個細胞/ ml,每組細胞各分為兩部分。胎盤蘭拒染實驗，細胞活力需大于95 %。Transwell培養(yǎng)板上室加入 100仙細胞懸液（5 1處4個并加入無血清培養(yǎng)基200 ul。Transwell培養(yǎng)板下室加入 500小

13、晅化因子,37 C ,5 %CO2培養(yǎng)24 h。用濕棉簽輕輕擦去 Matrigel凝膠和聚碳酯 膜上表面的細胞。小心取出上室，用線拴住，并做好標記,用冰預冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水（80 % ,95 % ,100 %二甲苯透明。小心將聚 碳酯膜自上室基底切取下來，置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下表面的 細胞在高倍鏡下（400隨機取6個視野1 計數(shù)，取平均數(shù)。重復實驗兩次。注意事項2. 1NIH3T3細胞制備的趨化因子與胎牛血清趨化因子是能使細胞產(chǎn)生趨化運動的一類細胞因子2 。目前利用NIH3T3細胞制備趨化因子做細胞體 外侵襲實驗的實驗室比較多，時間較

14、長且實驗步驟繁瑣。眾所周知，胎牛血清中有趨化因子，我們在不同濃度TNFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細胞 體外侵襲能力的強弱實驗中發(fā)現(xiàn)用胎牛血清和用NIH3T3細胞制備的趨化因子做細胞體外侵襲實驗效果是一樣的，兩組遷移的細胞數(shù)很接近。在實驗 時間上用NIH3 T3細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為1周，而用胎牛血清作趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為2d，實驗時間節(jié)省了很多。因此認為可以用胎牛血清來代替NIH3T3細胞制備的趨化因子。2. 2細胞的準備所需細胞應處在對數(shù)生長期，細胞活力需大于95 %。如果細胞 活力小，就會造成細胞穿透能力下降，影響實驗結果。2. 3擦去Matrigel

15、凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞先用干棉簽將上室內(nèi)液體吸去再用蒸儲水浸濕的棉簽輕輕擦去 Mat rigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞，如果沒有 擦凈聚碳酯膜上表面的細胞，在細胞計數(shù)時就會將沒擦掉的細胞也計進來。尤其是 細胞為圓形的時候，就會分辨不出是穿過去的細胞還是沒穿過去的細胞 ，對于長梭形 細胞來說，穿過去的細胞為長梭形，沒穿過去的細胞多為圓形。2. 4蘇木素染色上室浸泡在新蘇木素中的時間為1 min，用過多次的蘇木素為2min。在研究粉防己堿對HUVEC人類臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用沒有將 多余蘇木素洗去，直接脫水、透明，造成細胞圖片背景模糊，細胞不清楚。在作不同濃 度TNFa刺激下的HCCC29810膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗時我們將其置 于盛有自來水的燒杯中，反復漂洗幾次，將多余蘇木素洗去再行脫水、透明；這樣做出 的細胞圖片背景干凈，細胞清楚。2. 5脫水和透明時間脫水時間各為1 min，在二甲苯中的時間不要過長，以2 min3