胰腺癌基因診斷與基因治療研究進(jìn)展-

1、胰腺癌基因診斷與基因治療研究進(jìn)展胰腺癌是消化系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤,起病隱匿,惡性程度高?，F(xiàn)有的影像學(xué)檢查及血清學(xué)檢查尚不能達(dá)到早期診斷;其治療以胰十二指腸切除術(shù)為基礎(chǔ),輔以放療和化療,預(yù)后較差。平均5年生存率低于5%,被稱為“癌中之王”1。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的巨大進(jìn)步發(fā)展起來的基因檢測(cè)技術(shù)為胰腺癌的早期診斷提供了方向,為胰腺癌的有效治療提供了新的途徑。本文就胰腺癌基因診斷和基因治療的研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述。一、基因診斷. 胰腺腺癌腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多個(gè)基因異常變化積累的結(jié)果。許多原癌基因、抑癌基因以及DNA錯(cuò)位修復(fù)基因等,都和胰腺癌有著不可分割的關(guān)系。1.原癌基因1.1 K-ras與胰腺癌有

2、關(guān)的ras基因家族主要是K-ras和N-ras。其中以K-ras的點(diǎn)突變研究的最為深入和廣泛,可見于90%胰腺癌,明顯高于其他癌2。但由于K-ras突變也見于一些良性疾病,臨床上可作為篩選指標(biāo)。某些研究發(fā)現(xiàn),用外周血漿檢測(cè)K-ras突變還可用于評(píng)估腫瘤大小、可切除性以及預(yù)后3,因此外周血漿檢測(cè)K-ras 基因突變有望成為快速準(zhǔn)確診斷胰腺癌的方法。1.2 C-erbB-2(Her2/neuC-erbB-2基因編碼具酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白Her2/neu,表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一。有結(jié)果顯示近70%浸潤(rùn)性胰腺導(dǎo)管癌過度表達(dá)Her2/ neu。正常胰腺導(dǎo)管上皮不表達(dá)Her2/neu,82

3、%的平坦型病變導(dǎo)管,86%的乳頭狀病變導(dǎo)管, 92%的有異型的乳頭狀病變導(dǎo)管上皮表達(dá)Her2/neu4。胰腺癌中Her2/neu的強(qiáng)表達(dá)可能與腫瘤早期增殖有關(guān),為早期診斷和治療提供了線索。1.3 Bcl-2Bcl-2的過度表達(dá)見于約50%的胰腺癌,可阻止胰腺癌細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致腫瘤形成。但無轉(zhuǎn)移的高分化胰腺癌的Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯高于有轉(zhuǎn)移的低分化胰腺癌5。1.4 p840%以上的胰腺癌過表達(dá)p8基因產(chǎn)物,與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),而與預(yù)后無關(guān)6、7。其他如Myc、C-fos、c-raf、HLA-DR-和C-met基因都與胰腺癌有較大的關(guān)聯(lián)。2.抑癌基因2.1p16P16能抑制細(xì)胞周期蛋白D

4、1-細(xì)胞周期依賴激酶CDK4/6,使細(xì)胞穩(wěn)定的處于G1期,從而破壞整個(gè)通路。p16基因失活使活化轉(zhuǎn)錄因子釋放,促進(jìn)了細(xì)胞周期。約90%胰腺癌有p16基因異常8。據(jù)美國(guó)俄亥俄州大學(xué)研究,化學(xué)誘導(dǎo)的大鼠胰腺癌中90.3%與p16失活有關(guān)8。檢測(cè)p16基因突變可為胰腺癌早期診斷提供依據(jù)。2.2 p53活化的p53上調(diào)p21,作用于細(xì)胞周期蛋白E/CDK2而避免細(xì)胞周期停滯于G1/S 期。P53作用的另一個(gè)靶基因是其負(fù)調(diào)控因子MDM2。另外P53蛋白還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻止有癌變傾向的細(xì)胞產(chǎn)生8。約40%-75%的胰腺癌腫存在p53基因的異常。血清中p53蛋白濃度可用于胰腺癌的診斷及判斷腫瘤的進(jìn)展。2.

5、3 DPC4進(jìn)化上非常保守的Smad基因家族。產(chǎn)物蛋白是TGF-受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的必需物質(zhì)。DPC4的丟失可使細(xì)胞過度生長(zhǎng)。臨床上發(fā)現(xiàn)近50%胰腺癌都存在DPC4的缺失。DPC4失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生中的晚期事件。其他如LKB1/STK119、APC和MCC10、DCC11、MPP12、TGF-超家族13、三聯(lián)脆組基因FHIT14等也有資料表明其與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展具相關(guān)性。3.基因組維持基因3.1端粒酶端粒酶是細(xì)胞核內(nèi)的核糖核蛋白酶,具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性。人正常體細(xì)胞端粒酶活性為陰性,而90%左右惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶呈活化狀態(tài)。Hiyama等報(bào)道95%的胰腺癌組織中端粒酶活性呈陽性,而11例良性胰

6、腺腫瘤均呈陰性10。因此端粒酶可作為胰腺癌診斷的基因標(biāo)記物。3.2 BRCA2最近的研究發(fā)現(xiàn)具有BRCA2胚系突變的病人其患胰腺癌的危險(xiǎn)性明顯增加。Goggins等發(fā)現(xiàn)在41例胰腺癌中,15例存在BRCA2雜合子缺失,4例存在突變15。4.血管生成相關(guān)基因近年來的腫瘤研究確立了腫瘤血管生成在腫瘤生成、發(fā)展中的地位和作用。腫瘤血管生成相關(guān)基因的檢測(cè)有助于胰腺癌預(yù)后的判斷,但作為診斷手段尤其早期診斷還需要進(jìn)一步研究。5.基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是80年代發(fā)展起來的新興技術(shù),是基因突變分析、基因測(cè)序和基因表達(dá)研究的高效手段,具有高度敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。利用基因芯片技術(shù)可篩選出在胰腺癌中呈特征性表

7、達(dá)的基因,作出早期準(zhǔn)確的診斷。更重要的是應(yīng)用基因工程的方法來校正這些變異基因,可達(dá)到治愈腫瘤的目的。.其他類型胰腺腫瘤1. 胰腺內(nèi)分泌腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)胃泌素瘤和胰腺內(nèi)分泌腫瘤中MEN-1等位缺失的發(fā)生率58.4%,突變的發(fā)生率23.2%。胃泌素瘤的基因半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)與HER-2/neu相關(guān)。胰腺無功能內(nèi)分泌腫瘤中,大部分有p16的失活, 55%的無功能性胰腺內(nèi)分泌腫瘤有DPC4/Smad4的異常。2. 導(dǎo)管內(nèi)乳頭粘液瘤(IPMT:65%IPMT有K-ras突變(浸潤(rùn)性腺癌90%突變,p16和p53雜合子的缺失在浸潤(rùn)性IPMT中明顯高于非浸潤(rùn)性IPMT16。二、基因治療.基因治療策略1.恢復(fù)

8、抑癌基因和抑制癌基因重新引入野生型抑癌基因拷貝修復(fù)突變基因的功能,來抑制腫瘤生長(zhǎng)或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡,這在高突變率的個(gè)體中,并沒有很大意義。關(guān)鍵是干擾腫瘤細(xì)胞持續(xù)性生長(zhǎng)的途徑。胰腺癌中主要用反義核酸和核酶技術(shù)直接破壞癌基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄。如將含K-ras反義核苷酸的脂質(zhì)體質(zhì)粒載體經(jīng)腹腔注射胰腺癌小鼠模型,獲得明顯的治療效果17。2.酶解藥物前體療法將非哺乳動(dòng)物某些酶通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入腫瘤部位,再給予無毒性前體藥物治療,其經(jīng)酶解代謝后的毒性產(chǎn)物在局部具有高濃度,能將腫瘤細(xì)胞殺死,而全身反應(yīng)輕微。在酶解藥物前體治療研究中還發(fā)現(xiàn)存在“旁觀者效應(yīng)”,利用已轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺死未發(fā)生基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞,或抑制

9、其生長(zhǎng)。3.免疫療法腫瘤的免疫治療就是誘導(dǎo)及增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)。主要包括應(yīng)用腫瘤疫苗、轉(zhuǎn)染某些細(xì)胞因子基因和利用抗體等對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。以腫瘤疫苗研究較為深入。Schnurr等將胰腺癌細(xì)胞提取物載入樹突細(xì)胞制備抗腫瘤疫苗,避免了單一抗原的局限性,結(jié)果表明此種疫苗可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)18。4.抗腫瘤血管生成Kuo等構(gòu)建的表達(dá)vEGF受體Flk1的病毒載體,通過離體和在體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞,抑制胰腺癌生長(zhǎng)19。.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)腫瘤基因治療受基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的限制,包括載體的有效濃度和轉(zhuǎn)導(dǎo)的生物有效性。目前使用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法有三種:病毒、非病毒和物理方法。常用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相

10、關(guān)病毒;非病毒載體有裸DNA技術(shù)和脂質(zhì)-DNA復(fù)合物;物理方法主要有細(xì)針注射和電穿孔20。病毒載體仍然是目前最有效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。目前已有用于胰腺腫瘤細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,如單克隆鼠白血病病毒(MoMLV 21。腺相關(guān)病毒(AAV載體也已經(jīng)用于胰腺癌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)22。雜交載體轉(zhuǎn)導(dǎo)是基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。它既保留了原病毒載體的特性,又能解決滴度和免疫應(yīng)答的問題。.胰腺癌基因治療的靶基因1. K-ras消除優(yōu)勢(shì)途徑:Kuzumaki等從原癌基因v-H-ras得到一種突變N116Y,通過脂質(zhì)體將其導(dǎo)入8種具有K-ras突變的人胰腺癌細(xì)胞株后,發(fā)現(xiàn)可抑制細(xì)胞株的生長(zhǎng),而對(duì)正常的細(xì)胞則不起作用23。

11、免疫治療途徑:胰腺腫瘤肽可放大抗原遞呈效應(yīng),細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL對(duì)突變的ras肽反應(yīng),能暫時(shí)將胰腺癌細(xì)胞株殺死24。反義RNA及核酶途徑:在裸鼠模型中轉(zhuǎn)導(dǎo)含反義RNA的質(zhì)粒,能抑制胰腺腫瘤的生長(zhǎng)17。另外的研究表明,用腺病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)針對(duì)K-ras第12密碼子突變的核酶,發(fā)現(xiàn)突變的K-ras的mRNA和Bcl-2蛋白明顯減少,并且能抑制腫瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡25。2. P16直接在胰腺腫瘤部位或通過門靜脈注射含p16的腺病毒載體(Adp16,在切除腫瘤后能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移26。3. P53腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型p53至胰腺腫瘤細(xì)胞,在體內(nèi)外均能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在體內(nèi)研究中,同時(shí)轉(zhuǎn)染p53和p16

12、能提高細(xì)胞凋亡的程度。所以至少在胰腺癌模型中,可以得出p53和p16在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡上具有協(xié)同作用。最近的研究中發(fā)現(xiàn)88%以上的胰腺癌與CaSm(腫瘤相關(guān)類sm原癌基因有關(guān),特別是與腫瘤的惡性表現(xiàn)聯(lián)系緊密。腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)CaSm至胰腺腫瘤后,在體內(nèi)外能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)27。三、結(jié)語綜上所述有關(guān)胰腺癌基因?qū)W方面的研究進(jìn)展很快, 雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)于胰腺癌組織的基因,但利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)這些基因改變,有希望成為一種新的早期診斷方法。胰腺癌的基因治療取得了可喜的進(jìn)展。盡管目前采用的任何一種基因治療措施都不盡完善,還存在許多問題,腫瘤的基因治療已經(jīng)顯示了良好的發(fā)展前景,經(jīng)過研究者們的不懈努力,通過

13、基因治療治愈胰腺癌有望成為本世紀(jì)新的有效治療手段。參考文獻(xiàn)1.Parker SL, Tong T, Bolden S, et al. Cancerstatistics. CA Cancer J Clin1997;47(1:5-82. Dergham ST, Dugan MC, Arlauskas P, et al. Int J Pancreatol 1997;21(3:225-234.3. Hugh EM, Jacquekine L, Christine L, et al. A prospective study of K-ras mutation in theplasma of pancre

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