黑曲霉植酸酶液體發(fā)酵工藝研究

1、第14卷第3期武漢科技學院學報Vo1.14No.3黑曲霉植酸酶液體發(fā)酵工藝研究王亞林嚴建芳(武漢工業(yè)學院生物與化學工程系武漢430022)摘要研究了黑曲霉液體培養(yǎng)生產植酸酶的發(fā)酵工藝,研究了培養(yǎng)基碳源、誘導物、表面活性劑等因素對產酶的影響,對發(fā)酵時間、pH變化規(guī)律等進行了研究和分析。關鍵詞植酸酶黑曲霉發(fā)酵中圖分類號Q815;Q814.9植酸酶作為一種飼料和食品添加劑,在國內外已開始得到廣泛應用,特別是由于其在改善環(huán)境方面的作用,更是受到人們的極大關注。植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量較高而具有較大的開發(fā)價值。目前,美國、荷蘭和丹麥等國已先后運用發(fā)酵法生產植酸酶,我國也已在進行

2、這方面的研究開發(fā)?？梢灶A計,植酸酶制劑將有良好的市場前景。1材料與方法1.1菌種黑曲霉(Aspergillusniger)WS201,武漢工業(yè)學院微生物室保存。1.2培養(yǎng)基1.2.1種子培養(yǎng)基:豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基。1.2.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgSO47H2O0.05,KCl0.05,MnSO4.4;H2O0.03,pH值5.5。1.3培養(yǎng)方法配制培養(yǎng)基時適當加熱、搖動或攪拌,使淀粉溶解成液態(tài)或膠狀,121滅菌20min。在30±1下?lián)u床培養(yǎng)35d(轉速220250r/min)。1.4植酸酶的測定植酸酶活

3、力的定義:37,pH5.5條件下每分鐘從植酸鈉中釋放出1mol無機磷所需的酶為1u。酶活測定方法:取0.1ml含酶液加至一潔凈試管中;加入0.9ml反應液,反應液為含0.5%植酸鈉的乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.5),在37恒溫反應30min;加入1ml10%三氯醋酸終止反應;加入2ml顯色液,搖勻后靜置1530min顯色,顯色液由1%鉬酸銨50ml與3.66收稿日期:2001-06-26作者簡介:王亞林,男,副教授,在讀博士生;研究方向:發(fā)酵工程、生化工程© 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights r

4、eserved.武漢科技學院學報2001年32gFeSO47H2O混合配制。將以上藍色溶液在721分光光度計上于750nm處比色,讀出吸光度A750nm,查標準曲線計算酶活(標準曲線為KH2PO4中磷含量與A750nm的關系曲線)。2結果與討論2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的研究2.1.1培養(yǎng)基碳源含量的影響選擇葡萄糖和玉米淀粉為黑曲霉培養(yǎng)的碳源,葡萄糖和玉米淀粉用量之比為37,培養(yǎng)基碳源的含量指葡萄糖和玉米淀粉用量之和。不同碳源用量發(fā)酵試驗結果見表1(每個試驗均做23個重復,結果取平均值,下同)。表1培養(yǎng)基碳源的含量對產酶的影響試驗編號碳源含量(%)酶活(u/ml)17.032.328.546.5310.

5、036.1411.537.4513.034.0試驗中發(fā)現(xiàn)當碳源用量超過10%時,培養(yǎng)基粘度過大,造成培養(yǎng)基供氧不足,菌絲生長不良,產酶下降且殘?zhí)沁^高。因而碳源用量以8.5%為宜。2.1.2植酸鈉的添加效果植酸酶為一種誘導酶,理論上底物或底物類似物對植酸酶的產生應該有一定的誘導作用。本試驗選擇植酸鈉為誘導物,在培養(yǎng)基中少量添加,誘導植酸酶的產生,發(fā)酵產酶結果見表2。表2植酸鈉添加對產植酸酶的影響試驗編號植酸鈉(%)酶活(u/ml)1013.820.0524.130.1024.540.1531.050.2022.960.2525.8表2結果表明:少量添加植酸鈉后產酶迅速增加,說明植酸鈉有明顯的誘導

6、作用。植酸鈉用量在(0.050.15)%范圍內時,產酶量可穩(wěn)定在一個相對較高的水平,植酸鈉用量過大則意義不大。2.1.3表面活性劑的添加效果黑曲霉產生的植酸酶是一種胞外酶,在培養(yǎng)基中添加少量的表面活性劑可提高細胞的通透性,有利于酶的產生。本試驗選用吐溫-80(TW-80)為表面活性劑,設計了幾種不同的用量,發(fā)酵產酶結果見表3。表3TW-80添加對產植酸酶的影響試驗編號TW-80(%)1035.920.0553.330.1058.140.1575.350.2055.5酶活(u/ml)© 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd.

7、 All rights reserved.第3期王亞林等:黑曲霉植酸酶液體發(fā)酵工藝研究33從表3結果可見,TW-80添加量為0.05%時,與不添加相比產酶增加明顯;TW-80添加量為0.15%時,酶活達75.3(u/ml),產酶提高2倍以上;TW-80添加量繼續(xù)增加,則產酶開始下降,這是因為過量的表面活性劑會對細胞產生傷害之故。2.2發(fā)酵條件與過程研究2.2.1培養(yǎng)時間與產酶的關系黑曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)分為兩個階段,細胞生長階段和產酶階段,發(fā)酵應在產酶高峰期結束。本試驗研究了發(fā)酵時間與產酶的關系,試驗結果見圖1。從圖1可見,發(fā)酵前兩天產酶水平極低,之后迅速提高,其中在7284h產酶維持在較高的水平,

8、然后產酶開始緩慢下降。因此,發(fā)酵時間應為7284h。2.2.2pH值與產酶的關系培養(yǎng)基初始pH值與發(fā)酵產酶的關系見圖2。結果表明pH值為5.5效果較好。試驗中發(fā)現(xiàn),接種后黑曲霉生長導致pH下降,培養(yǎng)24h其pH值從5.5降至3.8左右,之后pH值緩慢回升。為觀察pH值與產酶的關系,在培養(yǎng)至24h人為調節(jié)pH為5.5繼續(xù)培養(yǎng),結果顯示這種調節(jié)對其產酶有一定的促進作用,但效果不是特別明顯,這方面的工作有待繼續(xù),結果見圖3、圖4。圖1培養(yǎng)時間與產酶的關系圖2培養(yǎng)基初始pH值對產酶的影響圖3發(fā)酵液pH值隨時間的變化圖4發(fā)酵過程pH、酶活隨時間的變化© 1995-2005 Tsinghua T

9、ongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.武漢科技學院學報2001年343結論(1)培養(yǎng)基的研究表明:碳源用量以8.5%為宜;植酸鈉有明顯的誘導作用植酸鈉用量在0.05%0.15%范圍內為宜;與不添加相比,TW-80添加產酶增加明顯,添加量以0.15%為宜,酶活達75.3(u/ml),產酶提高2倍以上。(2)發(fā)酵時間應以7284h為宜;黑曲霉生長導致pH下降,在培養(yǎng)至24h人為調節(jié)pH為5.5繼續(xù)培養(yǎng),對其產酶有一定的促進作用。參考文獻1Yuong-okkin,Hyung-kwounkin.PurificationandPropert

10、iesofathermostablephytasefromBacillussp.Ds11.En2zymeMicrob.Technil.1998,22(3):226.2張若寒.植酸酶活性的檢測方法J.中國飼料,1997,5:30232.3石炳興.植酸酶的制備性質及其在飼料工業(yè)的應用J.上海飼料,1996,3:728.StudyonAspergillusNigerFermentationProcessesofPhytaseWANGYa2linYANJian2fangAbstractTheprocessesoffermentationforproducingPhytasewerestudied.Thesetestsincludedcom2positionsofculturemedium,suchas,C-resources,evocator,externalactivereagent.Therelationshipsoffe