生化藥物和基因工程藥物含量測(cè)定

1、藥品檢驗(yàn)技術(shù)課程單元教學(xué)設(shè)計(jì)情境：藥物雜質(zhì)檢查(03) 任務(wù)：一般雜質(zhì)檢查方法(02)教學(xué)目標(biāo)設(shè)計(jì)序號(hào)5上課地點(diǎn)理實(shí)一體化教室授課形式講授、學(xué)生操作練習(xí)教 學(xué) 目 標(biāo)技能目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)生化藥物和基因工程藥物含量測(cè)定。藥物含量測(cè)定及方法教 學(xué) 重 點(diǎn)生化藥物和基因工程藥物含量測(cè)定教 學(xué) 難 點(diǎn)能夠根據(jù)藥物含量測(cè)定及方法。能力訓(xùn)練任務(wù)及案例教學(xué)進(jìn)程設(shè)計(jì)（下面各格均可合并）步驟教學(xué)內(nèi)容教學(xué)方法教學(xué)手段學(xué)生活動(dòng)時(shí)間分配基礎(chǔ)知識(shí)的講解藥物含量測(cè)定及方法教師舉例、點(diǎn)評(píng)、歸納概括引出知識(shí)點(diǎn)。做好課堂筆記案例分析分組實(shí)驗(yàn)討論25分鐘例如：含量測(cè)定生化藥物和基因藥物的含量表示方法：百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子

2、藥物或經(jīng)水解后 變成小分子的藥物。生物效價(jià)或酶活力單位：適用于酶類、蛋白質(zhì)類藥物。含量測(cè)定方法： 理化分析法： 化學(xué)分析法：重量測(cè)定法、滴定分析法 電化學(xué)分析法 光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法 色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、HPGFC、 灌注色譜法、HPCE法 酶法：酶活力測(cè)定法、酶分析法 電泳法 生物檢定法1電化學(xué)分析法 藥物膜電極 生物組織膜電極 藥物電極 微生物電極 離子選擇性電極法 免疫電極 免疫場(chǎng)效應(yīng)管 酶電極 2. HPLC法 RP-HPLC：柱前衍生化自動(dòng)測(cè)定氨基酸 柱：RP18， 柱溫：48 流動(dòng)相：A-0.05% TFA；B-乙腈-異丙醇

3、（4：1） 梯度洗脫 熒光檢測(cè)器：lex=280nm340nm,lem=430nm測(cè)定： 樣品-肽 樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2，110，20h 24h。 樣品干燥：真空 樣品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/L NaOH 進(jìn)樣測(cè)定HPIEC 測(cè)定對(duì)象：蛋白質(zhì)，多肽 柱：離子交換鍵合相 流動(dòng)相：0.3mol/L1.0mol/L的鹽的緩沖液。 梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵 素類鹽 特點(diǎn)：可回收活性蛋白。HPGFC 應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測(cè)定。 示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量 的測(cè)定 柱：Beckman Ultrasphero

4、gel SEC 3000 流動(dòng)相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4 （1:1）0.05%疊氮化鈉應(yīng)用示例：ChP（2000）重組人胰島素的質(zhì)量控制鑒別： 法1：在效價(jià)測(cè)定項(xiàng)下，供試品主峰的保留時(shí)間 應(yīng)與對(duì)照品的一致。 法2：供試品與對(duì)照品分別經(jīng)過(guò)酶解后，再分別 進(jìn)行梯 度洗脫，供試品的肽圖譜與對(duì)照品 的肽圖譜一致。檢查 檢查項(xiàng)目：有關(guān)物質(zhì)、高分子蛋白、鋅、氮、 干燥失重、無(wú)菌、細(xì)菌內(nèi)毒素。 有關(guān)物質(zhì)：供試液經(jīng)梯度洗脫，按峰面積歸一化 法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的量不得超過(guò)3.0%。 高分子蛋白質(zhì)： 固定相：色譜用親水硅膠，它可以分離分子量為50006000的球 狀蛋白。流動(dòng)相

5、：0.4mol/L 碳酸氫銨-乙腈（69 : 31）測(cè)定：分別測(cè)定供試液（1mg/ml）和對(duì)照液（將供試液稀釋成0.01mg/ml），供試液顯示的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，應(yīng)不大于對(duì)照液主峰面積（限量1.0%)。效價(jià)測(cè)定： 固定相：ODS C18 流動(dòng)相：硫酸鹽緩沖液-乙腈（7426） 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定胰島素主峰和A21脫氨胰島素峰之 間的分離度與拖尾因子。含量測(cè)定：分別進(jìn)樣供試液和對(duì)照液，按峰面積外標(biāo)法計(jì) 算含量。3.灌注色譜法 固定相：聚苯乙烯二乙烯高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)上構(gòu)成貫穿孔 顆粒分離介質(zhì)-POROSR。 雙模式孔結(jié)構(gòu)：80150nm大擴(kuò)散孔 600800nm貫穿孔允

6、許液體傳送流經(jīng)過(guò)分離介質(zhì)內(nèi)表面，使樣品由流動(dòng)相直接灌注入介質(zhì)顆粒中，擴(kuò)散作用不再是主要的。 介質(zhì)顆粒內(nèi)部可利用反應(yīng)的表面積增加，容量和分辨率也隨之增加，可使生物活性大分子快速分離純化。方法： 取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37±0.5恒溫水浴保溫，記時(shí)。反應(yīng)系統(tǒng)在3040秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時(shí)，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法 操作，凝結(jié)塊在2小時(shí)內(nèi)不溶。4. 生物法： 利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)鑒別藥物。 例：家兔驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素。 利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。雜質(zhì)檢查 一般雜質(zhì)檢查 特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析 生產(chǎn)過(guò)程中雜質(zhì)的檢查 1. 原料藥純度分析： 多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質(zhì) 酶類藥物-酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析， 具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查 選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物進(jìn)行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個(gè)胰蛋白酶單位中不得大于50單位，