層析柱的干法濕法填充和相關(guān)知識

1、層析柱裝填及相關(guān)常識常說的過柱子應(yīng)該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由于柱分的經(jīng)驗成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。 1、柱子可以分為：加壓，常壓，減壓 壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產(chǎn)品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數(shù)。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節(jié)省一半甚至更多，但是由于大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發(fā)（有時在柱子外面有水汽凝結(jié)），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，

2、而且時間長）。以前曾經(jīng)大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓后，就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。2、關(guān)于柱子的尺寸，應(yīng)該是粗長的最好 柱子長了，相應(yīng)的塔板數(shù)就高。柱子粗了，上樣后樣品的原點就?。ǚ从吃谥由暇褪菢悠穼颖容^薄），這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那么分離的難度可想

3、而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那么各組分就比較容易得到完全分離了。當然采用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對于產(chǎn)品來說也許就不算什么了（有些不環(huán)保的說，不過溶劑回收重蒸后也就減小了部分浪費）。現(xiàn)在見到的柱子徑高比一般在1：510，書中寫硅膠量是樣品量的3040倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)分的比較開（是指在所需組分rf在0.20.4，雜質(zhì)相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小

4、淋洗劑的極性等等。3、關(guān)于無水無氧柱，適用于對氧，水敏感，易分解的產(chǎn)品 可以濕柱，也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次，因為溶劑和硅膠飽和時放出的熱量有可能是產(chǎn)品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。也是因為分離的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因為是schlenk操作，所以點板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好準備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點，不過幾次之后就知道樣品在哪，也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱，需要六個schlenk，現(xiàn)在

5、只一個就能把所要的全收集到。無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為硅膠中有大量的羥基裸露在外，很容易是樣品分解，特別是金屬有機化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成堿性、中性和酸性的，選擇余地比較大，但是比硅膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產(chǎn)品在哪里了，沒有驗證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。4、關(guān)于濕法、干法上樣 濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關(guān)系?？墒怯械纳蠘雍笤诠枘z上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會

6、出現(xiàn)，是因為硅膠對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發(fā)生，這就應(yīng)該先重結(jié)晶，得到大部分的產(chǎn)品后再柱分，如果不能重結(jié)晶那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會隨著溶劑一起走，顯色是一個很長的脫尾），這時就必須用干法上柱了。樣品和硅膠的量有一種說法是1：1，我覺得是越少越好，但是要保證在旋干后，不能看到明顯的固體顆粒（那說明有的樣品沒有吸附在硅膠上）。溶劑的選擇。當然是最便宜，最安全，最環(huán)保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻中有寫用正己烷的，太貴了，除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還

7、快，不過因為極性很小，有時還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別讓溶劑流干了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅膠的吸附是一個放熱過程，所以夏天的時候經(jīng)常會在柱子里產(chǎn)生氣泡，天氣冷的時候會好一些。甲醇，據(jù)說能溶解部分的硅膠，所以產(chǎn)品如果想過元素分析的話要留神，應(yīng)該經(jīng)過后繼處理，比如說重結(jié)晶等。其他的溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。由于某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這里是用10升或25升的塑料桶裝的，就要注意這些工業(yè)品的純度是較低的。經(jīng)常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質(zhì)，其他的雜質(zhì)就可想而知了，所以在比較嚴格的柱分時就

8、要對溶劑重蒸。當然過原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。另外溶劑在過柱子后最好也回收使用，一方面環(huán)保，另一方面也能節(jié)省部分經(jīng)費，缺點是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發(fā)度的不同會導致極性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子后，溶劑最后回收要采用常壓，因為在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質(zhì)一起出來，常壓時就會減少這種現(xiàn)象，如果雜質(zhì)和你下面要過的樣品有反應(yīng)那就慘了。5、關(guān)于操作問題。 5.1 裝柱。 柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑，會被淋洗劑帶到產(chǎn)品中的，可以采用四氟節(jié)門的。干法和

9、濕法裝柱覺得沒什么區(qū)別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應(yīng)該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側(cè)斜著下來）。書中寫的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數(shù)情況下有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習了。但是柱子更忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚至作廢！ 硅膠的預處理濃鹽酸浸泡硅膠14小時，然后用蒸餾水洗滌硅膠4次后，將起進行減壓抽濾，后不斷加蒸餾水沖洗。在1小時之后，抽濾的水呈中性，但仍然含有氯離子。經(jīng)過4小時不斷的沖洗才使得抽濾液中基本不含氯離子。晾干一周后，在110烘箱中活化2小時。 活化后的

10、硅膠加石油醚浸泡并攪拌均勻。在裝柱時，宜使用口徑較大的玻璃漏斗置于 層析柱上部，注入1/2高的石油醚，打開下部活塞，然后盡量均勻地將硅膠傾入漏斗，這樣可以防止層析柱中形成斷層(這一步是實驗的關(guān)鍵步驟)。添硅膠裝柱子（添硅膠）時，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了可能分離效果不好，太長了也會由于擴散或拖尾導致分離效果不好。 濕法裝柱是先把硅膠用適當?shù)娜軇┌鑴蚝?，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗?quot;走柱子"，本法最大的優(yōu)點是一般柱子裝的比較結(jié)實，沒有氣泡。 干法裝柱

11、則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側(cè)，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會使得柱子裝的很結(jié)實。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），容易產(chǎn)生氣泡，這一點在使用低沸點的淋洗劑時如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出

12、來，嚴重時，整個柱子變花，樣品不可能平整地通過，當然也就談不上分離了。解決的辦法是：第一、硅膠一定要添結(jié)實；第二、 一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復到室溫后再撤去壓力。 也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個必要。PS:干法裝硅膠柱經(jīng)驗（帶口罩在通風廚進行）一邊裝一邊兩邊均勻用力拍打，或者裝完后用真空泵抽一下。 我們用干法裝柱都是，把硅膠裝進去之后，拿洗耳球稍微敲打幾下后，拿水泵抽緊，邊抽邊用洗耳球敲柱，這樣可以把柱子裝的非常緊湊，盡量排空空氣，這樣上洗脫劑

13、的時候就不會那么容易斷開。裝柱子下面的活塞一定要打開。 干法裝柱子下面的活塞一定要打開 干法裝柱先保證柱子清洗干凈，玻璃柱內(nèi)壁光滑（水洗后不掛珠），柱底安裝了砂漏或者以脫脂棉替代，活塞打開保證空氣流通。將經(jīng)過預先計算、秤量好的硅膠一次性沿漏斗倒入柱內(nèi)。如果不是預先計算秤量好硅膠，則在裝柱時猶豫不決，容易被柱內(nèi)暴騰的硅膠粉迷惑，不能確認已經(jīng)裝到了多高的柱高度。兩次甚至三次、多次補加硅膠容易導致裝柱斷層。一次裝柱后，在柱下端左右手同時用膠塊等物（柔和又有一定硬度的即可）敲打柱子。不斷敲打，同時觀察硅膠上端表面的變化，保證硅膠面平行下降，直到硅膠面落實不再有氣體在硅膠面“冒泡”為止。樣品溶液用一定體

14、積硅膠（硅膠粒度可小于裝柱硅膠）拌勻后，涼干。均勻鋪蓋在柱子上表面（一般2cm左右，也要根據(jù)柱高、柱直徑來確定），稍微敲打柱壁使上樣硅膠踏實?；狙b柱完成了。5.2 上樣。 用少量的溶劑溶樣品加樣，加完后將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（24cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。 上樣也有干法和濕法之分：干法上樣就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層

15、。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。然后用少量 薌 洗滌后，再加入。濕法較方便，熟手一般采用此法。5.3 淋洗劑的選擇。 感覺上要使所需點在rf0.20.3左右的比較好。不要認為在板上爬高了分的比較開，過柱子就用那種極性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分開，因為柱子是一個多次爬板的狀態(tài)，可以通過公式的比較：0.6/0.8一次的分離度，肯定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。5.4 樣品的收集。 用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話，就不容易流出。這樣就會發(fā)生，后面的點先出，而前面的點后出。這時可以采用氧化鋁作固定相。另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個樣品，wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。 5.5 最后的處理。 柱分后的產(chǎn)品，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質(zhì)也會累積到產(chǎn)品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶劑洗滌一下，因為大部分的雜質(zhì)是溶在