人及哺乳動(dòng)物受精早期的糖類調(diào)節(jié)-- 生理學(xué)

1、人及哺乳動(dòng)物受精早期的糖類調(diào)節(jié)- 生理學(xué)哺乳動(dòng)物受精早期的重要步驟是精卵識(shí)別（或結(jié)合）以及精子與卵透明帶（ZP）的結(jié)合。對(duì)應(yīng)配子膜上存在的互補(bǔ)分子參與了精卵相互作用。雖然目前對(duì)于互補(bǔ)分子的化學(xué)性質(zhì)還了解得很小，但越來越多的研究表明受精過程中精子獲能和精卵識(shí)別是由糖類調(diào)節(jié)的，即糖蛋白在生殖系統(tǒng)中起重要作用。一些聚糖中的糖原部分可調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附包括精卵識(shí)別和結(jié)合以及精子輸卵管粘附和子宮胚胎著床。若干類聚糖，包括高甘露糖或雜合型聚糖，唾液酸糖基化和半乳糖糖基化的糖蛋白，與受精中的許多環(huán)節(jié)有關(guān)。因此，通過改變有生物活性的聚糖將有可能影響受精過程。長(zhǎng)期以來，受精過程是生殖醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。從動(dòng)物受精過程

2、中得到的知識(shí)，使人的體外受精獲得了成功。至今，我們對(duì)動(dòng)物受精過程最了解的還是小鼠1。小鼠成功的受精包括以下幾個(gè)連續(xù)的步驟：即：精子在雌性生殖道內(nèi)獲能。獲能精子和ZP結(jié)合。頂體反應(yīng)（AR）的發(fā)生。精子穿透ZP。精、卵質(zhì)膜相互融合。本文討論人及哺乳動(dòng)物受精早期的糖類調(diào)節(jié)，特別是著重糖殘基在精子獲能和精卵識(shí)別中的重要的作用。一、精子獲能精子在從附睪頭到附睪尾的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，其質(zhì)膜發(fā)生了很多變化2。但剛射出的精子不能立即與卵子受精，它們還必須在雌性生殖道停留一段時(shí)間并發(fā)生一系列的生化和功能上的調(diào)整，即稱為獲能。這些改變，包括去除精子質(zhì)膜所吸附的精漿蛋白及修飾和（或）重新組合精子表面的分子，以保證精子能夠

3、結(jié)合并穿透ZP。Yanagimachi和Chang最先報(bào)道了使用交配后從雌性生殖道獲得的精子或使用經(jīng)輸卵管液培養(yǎng)后的附睪精子，使倉(cāng)鼠卵子體外受精獲得成功。這些研究表明雌性生殖道內(nèi)存在一種或多種因子使精子獲能。大多數(shù)研究者認(rèn)為，獲能可導(dǎo)致精子質(zhì)膜上那些修飾離通道的精子質(zhì)膜蛋白或糖蛋白和脂類成分發(fā)生改變，從而使精子產(chǎn)生獲能、超激活運(yùn)動(dòng)和AR的跨膜離子運(yùn)動(dòng)。但獲能的分了機(jī)制仍未完全了解。對(duì)于大部分哺乳動(dòng)物，其精子在輸卵管峽部發(fā)生超激活運(yùn)動(dòng)，然后進(jìn)入輸卵管壺腹部，即體內(nèi)受精部位。含有牛血漿白蛋白（BSA）和能量物質(zhì)的培養(yǎng)基能使哺乳動(dòng)物精子在體外獲能。精子一旦獲能，則伴隨著一系列生化變化，即：腺苷酸環(huán)化

4、酶的激活和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量的增加。胞內(nèi)pH增高。鈣離子(Ca2+)內(nèi)流。膜表面成分的丟失。精子質(zhì)膜改變。精子對(duì)外源凝集素的結(jié)合類型發(fā)生改變。從精子外源凝集素結(jié)合特性的改變可知，其表面的糖蛋白在獲能期間已發(fā)生改變。這是因?yàn)樽訉m和輸卵管分泌物中的糖基轉(zhuǎn)移酶可轉(zhuǎn)變精子質(zhì)膜糖蛋白。通過對(duì)暴露于精子表面的聚糖末端增加糖殘基，從而改變內(nèi)源的質(zhì)膜糖蛋白，可望改變其外源凝集素結(jié)合特性。輸卵管特異糖蛋白（OGP）對(duì)精子獲能起直接作用。OGP存在時(shí)，精子獲能比其缺乏時(shí)高2倍并可增加體外受精率3。另外，當(dāng)OGP存在時(shí)，獲能精子使同源卵子受精的能力更強(qiáng)。獲能精子在OGP存在時(shí)，對(duì)卵巢卵子的穿透率比無OGP時(shí)

5、高3倍3。這表明輸卵管及其分泌物在精子功能中起重要作用。蛋白多糖和氨基葡聚糖均可誘發(fā)精子獲能。肝素可與人及一些哺乳動(dòng)物精子結(jié)合。其結(jié)合能力依賴于pH、離子強(qiáng)度、溫度以及特異受體-配體相互作用。綜上所述，獲能反映了成熟精子質(zhì)膜上的多種變化。雖然不同動(dòng)物的分子機(jī)制有所不同，但最終導(dǎo)致精子超激活運(yùn)動(dòng)發(fā)生和使其具有AR的能力。二、精卵相互作用精子獲能后以十分精確的方式與ZP相互作用。對(duì)小鼠的研究表明，獲能精子和ZP結(jié)合可分為兩個(gè)步驟。首先，精子質(zhì)膜和卵ZP可逆性松散地結(jié)合，接著則是牢固地不可逆結(jié)合。一個(gè)卵子表面可結(jié)合多個(gè)精子，但通常只有一個(gè)精子穿過ZP并和卵質(zhì)膜發(fā)生融合。小鼠、大鼠和其他一些種類的ZP

6、是由ZP1、ZP2和ZP3三種糖蛋白組成，豬則存在第四種類型的ZP（ZP4）4。在卵子成熟過程中，分泌的ZP糖蛋白以非共價(jià)方式相互作用，形成纖維網(wǎng)絡(luò)，從而構(gòu)成胞外基質(zhì)。這種結(jié)構(gòu)使ZP具有彈性并使AR后的精子易于穿透。許多事件都由ZP調(diào)節(jié)，如：相關(guān)種屬特異性的精卵識(shí)別以及獲能精子與卵子結(jié)合。激活精子，導(dǎo)致AR發(fā)生。阻斷多精受精。保護(hù)受精卵至著床前的發(fā)育胚胎1。最近幾年，對(duì)影響配子質(zhì)膜表面相互作用的互補(bǔ)分子的識(shí)別及其特異性已取得可喜進(jìn)展。對(duì)于小鼠ZP（mZP）的表達(dá)表明：精子-ZP一級(jí)結(jié)合受存在于精子質(zhì)膜上的特異ZP3受體和ZP3調(diào)節(jié)。精子與ZP3結(jié)合引發(fā)AR。精子-ZP二級(jí)結(jié)合即AR或AR后的精

7、子與ZP2的結(jié)合。ZP1并不直接與精子相互作用。針對(duì)性的破壞mZP3基因可導(dǎo)致雌性小鼠卵子缺乏ZP3從而喪失生育力5。在小鼠、倉(cāng)鼠、豬和大鼠中的ZP2和ZP3都是高度糖基化的。低含量的mZP3就可使每個(gè)卵子結(jié)合的精子數(shù)下降并呈劑量依賴關(guān)系。這種抑制是由于加入的mZP3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了精子頭部質(zhì)膜上互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。ZP的聚糖成分使其具有配合活性：改變mZP3多肽結(jié)構(gòu)不會(huì)破壞其抑制精卵結(jié)合的能力。不同的外源凝集素能抑制或破壞精卵結(jié)合。特異的單糖、雙糖、寡糖和糖蛋白可抑制或阻斷精卵結(jié)合。用外糖基化酶處理卵子可抑制或阻斷精卵結(jié)合。用鏈霉蛋白酶降解mZP3后得到的糖多肽（1.56.0kDa）仍保留精子結(jié)合特

8、性。精子結(jié)合特性對(duì)三氟甲烷磺酸處理（導(dǎo)致單糖殘其上N-和O-連接寡糖鏈的斷裂）頗為敏感6。這些研究為了證明糖蛋白上的聚糖成分是精子的配體提供了重要的依據(jù)。然而，精確識(shí)別使mZP3具有配體活性的糖殘基尚有爭(zhēng)議。較早的研究中，用杏仁糖肽酶（可水解各類N-連接多糖上的-天冬酰胺-葡糖胺）處理小鼠卵子可強(qiáng)烈抑制精卵結(jié)合。mZP2和mZP3上存在的N-連接的高甘露糖或雜合寡糖鏈可能在精卵結(jié)合中起作用，并且這些寡糖單元可能是精子質(zhì)膜上存在的甘露糖苷酶識(shí)別或結(jié)合部位的組成部分。它是一種屬于水解斷裂糖苷鍵的糖苷酶，這些水解酶都有相同的催化機(jī)制，最常見的是在糖殘基斷裂前形成酶-糖底物中間體。有證據(jù)表明存在精子酶

9、中間產(chǎn)物復(fù)合物：在大量的甘露糖殘基被切割以前，ZP底物已形成并參與受精的下一步反應(yīng)。此外，NagDas等已證明mZP2和mZP3上天冬酰胺-連接（N-連接）聚N-乙酰乳糖胺等聚糖的存在4。在其他細(xì)胞中，N-連接的聚乳糖胺鏈有多種多樣的尾部順序包括：Gal1、3Gal，4GlcNAc1，3Gal-R。這種-連接的半乳糖基末端順序是由一類限度的N-連接的半乳糖基結(jié)合物包括細(xì)胞表面成分構(gòu)成的。如果這種順序在mZP3上也存在，那么它可能在精卵結(jié)合中起作用。應(yīng)當(dāng)指出mZP3以及用作體外試驗(yàn)的聚糖是由卵巢ZP純化，而不是用輸卵管中的卵子純化得到的。雖然從卵巢和輸卵管卵子純化的mZP3在化學(xué)性質(zhì)和功能上是相

10、似的，但卵子表面的結(jié)構(gòu)在輸卵管環(huán)境中發(fā)生了改變。這表現(xiàn)在與OGP或與其他糖蛋白例如糖基轉(zhuǎn)移酶等結(jié)合。輸卵管液中存在的糖基轉(zhuǎn)移酶有可能參與了最終暴露在ZP表面的糖鏈的修飾。ZP糖蛋白上任何糖殘基在輸卵管中的改變，對(duì)精子受體活性即識(shí)別和結(jié)合這些糖殘基都可能產(chǎn)生影響。這表明在輸卵管微環(huán)境中的聚糖和它的互補(bǔ)受體可能與體外精卵結(jié)合試驗(yàn)不同。最近研究已確定了一些精子上作為受體的蛋白。其中半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。SP56，ZP受體激酶（ZRK）和精子粘附分子參與了精子-ZP一級(jí)結(jié)合，而PH-20蛋白，頂體酶原，SP38和SP17則參與二級(jí)結(jié)合7。精子-ZP一級(jí)結(jié)合引發(fā)精子與ZP的相互作用并激發(fā)AR，而精子-ZP二級(jí)

11、結(jié)合使精子粘附于ZP并穿透ZP。存在于精子表面的1-4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶不僅具有酶的活性，同時(shí)還作為一個(gè)凝集素識(shí)別具N-乙酰葡糖胺未端的寡糖鏈配體。純化的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和抗-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的抗體可抑制精卵相互作用。已有研究表明半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性作用于ZP3。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可能還存在信息傳遞功能。過度表達(dá)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因小鼠精子比正常精子更多地結(jié)合ZP3，且大部分發(fā)生AR6。SP56系56kDa的外周膜蛋白。它最初是在小鼠精子中發(fā)現(xiàn)的，并能與純化的小鼠ZP3和ZP3的糖多肽共價(jià)結(jié)合。特異單克隆抗體分析表明SP56存在小鼠精子頭部背面。純化的SP56可與小鼠卵結(jié)合從而抑

12、制體外精卵結(jié)合。ZRK是一個(gè)跨膜受體且具酪氨酸激酶活性。酪氨酸磷酸化是精子受精所必需的，抑制酪氨酸蛋白激酶活性可阻斷受精。用單克隆抗體mAb97.25發(fā)現(xiàn)了95kDa的精子蛋白參與精卵相互作用。該精子蛋白是酪氨酸磷酸化且存在于精子表面頂體區(qū)域。其多肽成分可競(jìng)爭(zhēng)性抑制人精子-ZP相互作用。精子粘附分子家族（1216kDa）可和包括ZP糖蛋白在內(nèi)的一些配體結(jié)合。當(dāng)精子獲能后，大部分精子粘附分子都丟失了，但還有一些仍存在于精子表面和ZP發(fā)生結(jié)合，其中包括AWN-1，AQN-1和AQN-3（精子粘附分子）。但這些分子是否普遍存在于哺乳動(dòng)物精子中，是否是精子-ZP結(jié)合所必須，還不清楚。PH-20是由糖基

13、磷脂酰肌醇錨定的質(zhì)膜蛋白，參與精子-ZP二級(jí)結(jié)合。它存在于精子表面頭部后頂體區(qū)域和頂體內(nèi)。前者在精子穿過顆粒細(xì)胞時(shí)起作用，而后者則在二級(jí)結(jié)合時(shí)與ZP結(jié)合。PH-20廣泛存在于哺乳動(dòng)物精子中，且是高度免疫的基因蛋白，因此有助于避孕疫苗的研制。頂體酶原很早就被人們認(rèn)為參與精子-ZP二級(jí)結(jié)合。當(dāng)AR發(fā)生時(shí)，頂體酶原受ZP的調(diào)控轉(zhuǎn)變成頂體酶。由于它的ZP結(jié)合特性和水解蛋白質(zhì)的特性，頂體酶原被認(rèn)為在精子結(jié)合和穿透ZP中起重要作用。豬ZP2和頂體酶原發(fā)生結(jié)合，并且已得到頂體酶原與ZP結(jié)合的殘基結(jié)構(gòu)9。牛精子中和頂體酶原結(jié)構(gòu)相似的SP38，與其有相同的結(jié)合特性。SP38及來源于SP38和頂體酶的寡多肽可抑制

14、SP38-ZP的結(jié)合。SP17上有一個(gè)重要?dú)埢徽J(rèn)為是C-型凝集素半乳糖結(jié)合所需區(qū)域。Richardson等認(rèn)為在AR時(shí)，SP17暴露于兔精子表面并移動(dòng)到精子頭部與ZP2結(jié)合。此外，人精了含有-D-甘露糖苷糖酶和一個(gè)甘露糖結(jié)合蛋白。這些大分子都具有和ZP上含甘露糖的寡糖連結(jié)合的受體樣作用。人精子抗原FA-1和選擇素（selectin）樣分子10能與同源ZP結(jié)合。小結(jié)精卵相互作用乃當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)研究的前沿領(lǐng)域之一，方興未艾。它們通過互補(bǔ)分子即受體（精子上）-配體（ZP上）機(jī)制激發(fā)精卵識(shí)別，亦即ZP表面糖蛋白和精子質(zhì)膜上互補(bǔ)糖類結(jié)合酶和外源凝集素樣分子在精卵相互作用中起重要作用。但這些受體和配體的化

15、學(xué)性質(zhì)及其特性，尚未被闡明。精卵識(shí)別（結(jié)合）是通過單一個(gè)還是多個(gè)受體-配體相互作用；體外精卵結(jié)合試驗(yàn)中所確定的互補(bǔ)分子是否與輸卵管中的相同，尚待深入研究。雖然受精事件因種而異，其進(jìn)行的順序也不盡相同，但精子獲能、精卵相互作用、頂體反應(yīng)的發(fā)生等機(jī)制還是很相似的。這些事件在受精早期至關(guān)重要。然而調(diào)節(jié)上述事件的機(jī)制細(xì)節(jié)，仍是生殖生物學(xué)一個(gè)未解決的基本問題。ZP聚糖的巨大差異提示，某些配體（聚糖）-受體相互作用在配子相互作用和成功的受精前就起作用了。最近研究表明精子和ZP的最初識(shí)別過程是一個(gè)復(fù)雜的結(jié)合過程，包括多種精子蛋白與ZP3的結(jié)合11。因此，深入地了解獲能、精卵相互作用和頂體反應(yīng)機(jī)制，必將使我們

16、獲得更多的方法以確定糖類殘基及其互補(bǔ)分子的特性。參考文獻(xiàn)1 yanagimachi R et al. Physiol Reprod,1994:189-3172. tulsiani DRP et al. Dev Biol ,1995;167:584-5973. verhage HG et al .Biol Reprod ,1998;58:1098-11014. nagDas SK et al. Biol Reprod ,1994;51:262-2725. liu C et al. Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:5431-54366.Daulat rP et la. Biol Reprod ,1997;57:487-4947. mc