六味地黃湯對雌性致衰模型小鼠生殖器官影響的實驗研究

1、六味地黃湯對雌性致衰模型小鼠生殖器官影響的實驗研究【摘要】 目的觀察六味地黃湯（LW）對雌性致衰小鼠生殖器官的影響。方法小鼠頸背部皮下注射D - 半乳糖建立衰老模型，同時給予六味地黃湯、己烯雌酚，然后檢測六味地黃湯對-內(nèi)啡肽（-EP）、血清雌激素（E2）、孕激素（P）含量以及對卵巢、子宮形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果六味地黃湯能夠提高-內(nèi)啡肽含量，增加小鼠陰道脫落細胞涂片內(nèi)角化上皮細胞和表層細胞，卵巢重量增加。結(jié)論六味地黃湯具有雌激素樣作用，可能通過調(diào)理下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO)的功能，使卵巢功能恢復(fù)。 【關(guān)鍵詞】 六味地黃湯； 卵巢早衰Abstract：ObjectiveTo observe the

2、 effects of Liuwei Dihuang Tang on causing senility to ovaria of mice. MethodsTo establish senility model through subcutaneous injection of D-galactogen into the neck and back of mice, which were subsequently treated with Liuwei Dihuang Tang and ethylene cyclohexne. Meanwhile, to observe the effects

3、 of Liuwei Dihuang Tang on the content of -endorphin, sero-estrogen and progestogen, and on ovaria and uterine histomorphology. ResultsLiuwei Dihuang Tang could improve the content of -endorphin, increase the cornified and epithelial cell and epidermal cell in the vaginal exfoliated cell smear of mi

4、ce. ConclusionLiuwei Dihuang Tang serves the same function as estrogen, which restores the normal functioning of ovaria by regulating the workings of subthalamus-hypophysis-ovarian axis.Key words：Liuwei Dihuang Tang; POF 六味地黃湯（LW）是中醫(yī)滋補腎陰的代表方劑。由熟地、山茱萸、山藥、茯苓、澤瀉、牡丹皮6味藥組成,其特點是長于三陰(肝脾腎)并補而以補腎為主的方劑。長期臨床觀察

5、此方有抗衰老功能，但從未看到抗衰老實驗室對小鼠生殖器官細胞、形態(tài)結(jié)構(gòu)研究的報道。本研究通過把六味地黃湯用于實驗小鼠活體內(nèi)對卵巢、子宮組織細胞、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，從而為六味地黃湯對卵巢早衰分子生物學(xué)研究提供較可靠的實驗依據(jù)。 卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指卵巢功能提前衰退，表現(xiàn)為婦女40歲之前非生理性的月經(jīng)停止，伴有潮熱、原發(fā)及繼發(fā)不孕、全身和生殖器萎縮，卵泡刺激素(follicular stimulating homone,FSH)升高(FSH40IU/L)及E2下降。目前病理機制不甚清楚，而建立POF動物模型對其病因的基礎(chǔ)研究以及指導(dǎo)臨床的診斷和治療

6、有重要意義。由于半乳糖血癥患者常表現(xiàn)為原發(fā)性閉經(jīng)或卵巢早衰，且有報道動物體內(nèi)的半乳糖增多可引起類似與卵巢早衰的改變，故本課題組采用D -半乳糖建立小鼠卵巢早衰動物模型1，通過觀察LW對小鼠下丘腦垂體卵巢軸（HPO）的調(diào)節(jié)作用及對小鼠生殖器官形態(tài)學(xué)影響，探討LW對POF的治療機制，指導(dǎo)臨床診斷和治療。1 材料與儀器1.1 動物雌性昆明種小鼠60只，812周齡，體質(zhì)量25 30 g，由河南省南陽醫(yī)專實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，溫度2535，相對濕度為5060，自由進食、水。1.2 藥品與試劑六味地黃湯草藥藥材購于河南省南陽市醫(yī)藥公司，由南陽醫(yī)學(xué)高等專校藥理教研室按比例組方 ，經(jīng)煎制、過濾、濃縮

7、為1 g/ml (以生藥汁) 六味地黃湯口服液，高壓滅菌，O冰箱保存?zhèn)溆?。D - 半乳糖為上海恒信制藥廠產(chǎn)品，批號為20010218。 用滅菌生理鹽水配制成50 g/L,0冰箱保存?zhèn)溆?。乙烯雌酚由上海衡山藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為000201。雌二醇（E2）放射免疫藥盒購自天津德普公司；孕醇（P）放射免疫藥盒購自醫(yī)學(xué)科學(xué)院和醫(yī)學(xué)技術(shù)中心；-內(nèi)啡肽（-EP）放射免疫藥盒購自海軍放免技術(shù)中心。其他制劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 儀器和設(shè)備(2/2)VI普通類B型脫水機，孝感宏業(yè)TS-12L；日本原裝進口（1/2）JVCTK-C921EC顯微鏡攝像機；日本原裝進口OLYMPUSCX31顯微鏡；德國原裝進口

8、mICROMGMBH Hm200切片機；CS攤片機。體溫計，DT一ITB型;電子天平，JD2000 - 2 ;Y計數(shù)器，GAMMA -C120。2 方法2.1 衰老動物模型的建立采用D-半乳糖亞急性衰老模型建立法。D -半乳糖按每只小鼠經(jīng)背部皮下注射D - 半乳糖0.3 ml/（kgd），注射42 d。2.2 實驗分組 將60只小鼠隨機分成正常對照組（A）、衰老模型組(B)、六味地黃湯治療1組(C)，六味地黃湯治療2組(D)，乙烯雌酚組(E)，每組12只。A組、B組各鼠每天灌胃生理鹽水20 gkg-1，同時B組，C組，D組，E組各鼠每天經(jīng)背部皮下注射D-半乳糖0.3 mlkg-1，連續(xù)給藥42

9、 d。從11天開始，C組，D組分別灌服六味地黃湯（原汁1 g/ml濃度）20 gkg-1d-1或40 gkg-1d-1，E組乙烯雌酚0.7 mgkg-1d-1灌胃，連續(xù)給藥32 d。2.3 觀察指標及方法2.3.1 動情周期的測定給藥兩周，逐只連續(xù)觀察受試動物外陰部、陰道上皮脫落細胞動情周期變化。用消毒棉簽插入小鼠陰道約0.5 cm，輕輕轉(zhuǎn)動后取出，將棉簽上的陰道脫落細胞均勻涂于潔凈的載玻片上，待涂片風(fēng)干后用堿性美藍溶液染色5 min，然后用蒸餾水沖洗，自然風(fēng)干后鏡檢，觀察細胞形態(tài)，確定動情周期。每日下午定時陰道涂片、H-E染色，細胞學(xué)檢查。2.3.2 P，E2，-內(nèi)啡肽檢測各組連續(xù)灌胃治療2

10、周后，稱量體重并在大鼠動情間期，按放射免疫藥盒操作說明測定-內(nèi)啡肽及雌、孕激素的含量。每只鼠取血清200 l，血清量不足的動物將血清合并后檢測。成批檢測P，E2,-內(nèi)啡肽，留樣時要求用1%肝素和抑肽酶抗凝，迅速低溫4離心，取血漿低溫20保存待測。2.3.3 生殖器官體質(zhì)量觀察42 d采血后斷頭法處死動物，摘取子宮、卵巢，剔除脂肪和其他組織，濾紙稍拭后，分別放入電子分析天平精確稱出濕重。2.3.4 形態(tài)學(xué)觀察分組編號并浸入10福爾馬林固定、包埋、切片、HE染色、封片，進行組織學(xué)觀察 。2.3.5 統(tǒng)計學(xué)處理:用SPSS13.0進行統(tǒng)計處理,統(tǒng)計學(xué)方法為樣本均數(shù)的T檢驗。1 3 結(jié)果3.1 小鼠陰

11、道脫落細胞涂片的影響小鼠性周期一般為5 d。灌胃2周檢測,除了E組有不同程度延長(56 d)外，其余各組周期均不相同。表現(xiàn)為B組與C組周期紊亂，長短不一。 D組與A組周期基本穩(wěn)定為45 d。在灌胃4周檢測,A組周期無明顯改變、仍表現(xiàn)為45 d；而其余各組均有明顯改變，表現(xiàn)為D組周期延長至67 d； E組延長至78 d；C組基本趨于正常，表現(xiàn)為45 d； B組周期仍不規(guī)則。結(jié)果顯示，D,E組與A組角化上皮細胞最高值及表層細胞最高值比較差異顯著(P0.05), C,D,E組與B組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異( P0.05)。 考慮是雌激素水平增高的表現(xiàn)，雌激素的作用是上皮增生、細胞成熟。其影響程度一般以角

12、化細胞指數(shù)為依據(jù)。說明六味地黃湯可以提高雌激素水平，使其角化上皮細胞和表皮細胞增多。3.2 給藥2周血清雌激素(E2)、孕激素(P)水平及-內(nèi)啡肽（EP）含量的變化結(jié)果見表1。表1 各組E2，P，-EP含量的比較 （略）3.3 六味地黃湯對小鼠卵巢重量的影響結(jié)果見表2。表2 各組六味地黃湯與雌激素對小鼠卵巢重量的影響 （略） 灌胃LW能增加卵巢重量，提示六味地黃湯對致衰小鼠動情周期的紊亂有明顯的調(diào)節(jié)作用。3.4 形態(tài)學(xué)變化3.4.1 卵巢卵巢大體觀察：B 組雙側(cè)卵巢縮小，表面明顯蒼白，點狀突起較少。A，C,D 組雙側(cè)卵巢色澤較紅，表面可見多個白色點狀突起。E 組雙側(cè)卵巢縮小,但卵巢色澤較紅，表

13、面可見白色點狀突起。 卵巢光鏡形態(tài)(40) :A組及C組可見原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡、成熟卵泡較少，黃體數(shù)目較多，有的可見新鮮血黃體，間質(zhì)少，間質(zhì)腺少見(見圖1)。B組可見原始卵泡，未見初級卵泡，次級卵泡和成熟卵泡，閉鎖卵泡較多，可見較多間質(zhì)腺及陳舊黃體(見圖2)。D組和E組可見原始卵泡及大量初級卵泡、次級卵泡和接近成熟卵泡，黃體較多，間質(zhì)少，間質(zhì)腺體少見(見圖3)。3. 4.2 子宮(40) A,C組可見正常子宮內(nèi)膜，內(nèi)膜厚占子宮壁的2/3，上皮以分泌細胞為主，胞質(zhì)中有大量分泌泡，固有層有大量子宮腺，腺腔大，腔內(nèi)有分泌物，結(jié)締組織疏松，其中有豐富的毛細血管及小動、靜脈(見圖4)。B組可見

14、內(nèi)膜薄，占子宮壁的1/3，上皮以柱狀細胞為主，胞質(zhì)中分泌物少，固有層結(jié)締組織分布廣泛，子宮腺少，腺腔?。ㄒ妶D5）。D組和E組可見內(nèi)膜厚，占子宮壁的1/32/3，上皮單層柱狀，分泌細胞多，固有層結(jié)締組織疏松，子宮腺多，血管豐富（見圖6）。 病變化說明六味地黃湯可使卵巢重量增加，色澤較紅，促進卵泡發(fā)育，具雌激素樣作用；并能增加致衰小鼠子宮中腺體及血管數(shù)量，使子宮內(nèi)膜肌層增厚，纖維結(jié)締組織減少，緩解子宮萎縮，表明六味地黃湯和雌激素均有營養(yǎng)子宮及改善其功能的作用。與報道相符3，4 。4 討論 女性生殖功能的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)主要通過由下丘腦、垂體和卵巢組成的生殖功能調(diào)節(jié)軸。下丘腦-垂體-卵巢軸是一個完整而協(xié)調(diào)

15、的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，它的每個環(huán)節(jié)均有其獨特的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，并且互相調(diào)節(jié)、互相影響。它的主要生理功能是控制女性發(fā)育、正常月經(jīng)和性功能，因此又稱性腺軸。此外，它還參與機體內(nèi)環(huán)境和物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。-EP是女性生殖內(nèi)分泌話動的重要調(diào)節(jié)因素，下丘腦含有豐富的EP，它對垂體、體溫調(diào)節(jié)中樞、飲食中樞均有重要要的生理作用，同時，研究發(fā)現(xiàn)-EP與下丘腦-垂體-腎上腺軸、下丘腦-垂體-卵巢軸有著密切的關(guān)系1，2 。而此軸的功能正是中醫(yī)“腎”所具有的功能，有人證實這就是中醫(yī)“腎”本質(zhì)所在。本實驗研究結(jié)果表明用D -半乳糖建立衰老模型，小鼠血漿-EP含量均明顯下降，提示-EP的改變與臨床腎陽虛癥狀的發(fā)生及卵巢摘除術(shù)有

16、關(guān)，至于-EP下降的原因，可能大量應(yīng)用D -半乳糖抑制卵巢雌、孕激素的分泌及手術(shù)導(dǎo)致雌、孕激素的改變有關(guān)3 。運用六味地黃湯與西藥的模型小鼠血漿-EP的含量與A組接近。表明六味地黃湯能使-EP含量恢復(fù)正常，提示-EP可能參與性腺軸的功能活動，尤其對卵巢功能有促進、調(diào)節(jié)、改善作用。 雌激素和LW對HPO軸的調(diào)節(jié)作用比較。二者均能降低垂體LH的水平。不同：雌激素使小鼠動情周期時間延長而LW對動情周期延長不明顯；雌激素使卵巢重量明顯減輕，而LW組使卵巢重量明顯增加。和文獻報道相符4，5 證實雌激素和六味地黃湯對致衰小鼠HPO軸紊亂發(fā)揮調(diào)節(jié)上的差異。雌激素和LW對致衰小鼠HPO軸紊亂的調(diào)節(jié)作用不同，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的環(huán)節(jié)或機理也不同,有待進一步研究4 。 綜上所述，六味地黃湯的作用決不是簡單的雌激素代替或單因素干預(yù)。而是通過對內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能促進導(dǎo)致卵巢與下丘腦-垂體-性腺功能的恢復(fù)，六味地黃湯對卵巢的作用不是單一的、獨立的，而是多方面的、綜合的?？紤]其可能的機制為六味地黃湯通過調(diào)理HPO的功能，使卵巢形態(tài)功能恢復(fù) ，并具有雌激素樣作用，從而發(fā)揮對衰老小鼠卵巢、子宮明顯的治療效果及抗衰老作用；六味地黃湯本身具有雌激素樣作用?！疚墨I】 1李 潔，楊 菁.卵巢早衰動物模型建立的研究進展