中度液壓性創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立與評估

1、中度液壓性創(chuàng)傷性腦損傷模型的建立與評估         10-09-02 10:08:00     編輯：studa20                     作者：崔俊波， 梁建偉， 陳寶貴【摘要】  目的制作中度液壓腦損傷動物模型，并對模型進(jìn)行評估。方法雄性SD大

2、鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、創(chuàng)傷3 d組，創(chuàng)傷7 d組。創(chuàng)傷組沖擊力大小為：(170±10)kPa, 作用時間為(20±2)ms。結(jié)果損傷組75%動物在創(chuàng)傷后立即出現(xiàn)大鼠反射消失、昏迷、四肢運(yùn)動功能減弱，甚至去腦強(qiáng)直，且可出現(xiàn)呼吸暫停，并具有15%左右的死亡率。應(yīng)用NSS評價表明，創(chuàng)傷3 d組創(chuàng)傷后1，3 d評分分別為(14.77±1.17)和(13.38±0.65)，創(chuàng)傷7 d組創(chuàng)傷后1，3 ，7 d評分分別為：(14.62±0.65)，(13.15±0.69)，(14.31±0.75)，與同期正常組比較，P<0.0

3、1。光鏡和電鏡觀察均表明正常組與創(chuàng)傷組之間差異明顯。結(jié)論液壓腦損傷裝置可以建立中度創(chuàng)傷性腦損傷動物模型，且沖擊力定量準(zhǔn)確，制作的模型穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，NSS在評估液壓性創(chuàng)傷性腦損傷模型上具有準(zhǔn)確、簡便的特點(diǎn)，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】  創(chuàng)傷性腦損傷; 液壓腦損傷; 動物模型; NSS創(chuàng)傷性顱腦損傷(traumatic brain injury ,TBI)是世界性的多發(fā)性疾病，也是死亡率和致殘率最高的疾病之一。其中中度TBI占有相當(dāng)大的比例。建立合適的顱腦損傷模型以研究TBI的機(jī)理對于臨床相當(dāng)重要。本文就應(yīng)用液壓腦損傷裝置制作中度腦損傷模型的方法進(jìn)行研究并對模型進(jìn)行評估。1

4、材料與方法1.1 動物來源及分組SPF級、雄性SD大鼠64只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2002-0003。體重(320±10) g，實(shí)驗(yàn)大鼠于動物室內(nèi)分開籠中喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度為(17±3)，濕度為(50±20)%，每日光照12 h，并提供約50 g全營養(yǎng)鼠糧及足量清潔飲水。應(yīng)用SPSS軟件將大鼠隨機(jī)分為4組：正常組和假手術(shù)組各14只，模型3 d組、模型7 d組各18只。正常組和假手術(shù)組于損傷后7 d處死，模型組分3 d、7 d兩個時間點(diǎn)處死動物。1.2 顱腦創(chuàng)傷模型的制作本研究所用液壓腦損傷裝置由天津市環(huán)湖醫(yī)院從美國弗吉尼亞

5、州立大學(xué)定制并提供使用。1.2.1 手術(shù)步驟隨機(jī)挑選動物，大體觀察無異常表現(xiàn)后，稱取體質(zhì)量并記錄。腹腔注射10%水合氯醛0.2 ml/kg體重進(jìn)行全身麻醉，保持自主呼吸。俯臥位固定于動物立體定位頭架，保持頂骨左右位水平、前后位切線水平。頂部備皮、消毒，做正中矢狀切口，長約1.5 cm，雙極電凝止血，鈍性剝離暴露顱骨，于左頂部矢狀縫旁開2 mm，冠狀縫后2.5 mm，用臺式牙鉆行顱骨鉆孔，磨開一直徑4 mm的圓形骨窗，并注意保持硬腦膜完整，用骨蠟或無菌棉簽止血、沖洗潔凈備用。用水門汀將直徑5 mm的打擊管與骨窗相互粘牢，粘合部位固化20 min，達(dá)到水密且牢固的效果。1.2.2 打擊過程與復(fù)蘇先

6、將粘于顱骨上的打擊管內(nèi)注滿37生理鹽水后，將動物連接于液壓沖擊裝置，使打擊管與鼠頭矢狀面平行，與冠狀面平行呈垂直打擊。開啟并調(diào)整數(shù)字示波記錄器、信號放大器進(jìn)入待命狀態(tài)后，調(diào)整擺錘、擺桿抓鉤至所需位置完成打擊前準(zhǔn)備，等動物掐尾反射出現(xiàn)后進(jìn)行打擊。沖擊能量通過液壓連通器原理導(dǎo)入封閉的顱腔內(nèi)，造成腦創(chuàng)傷。裝置通過光電自動控制完成對沖擊時程和強(qiáng)度的檢測與記錄，顯示于示波器并作記錄留分析。撤除粘合于動物顱骨的打擊管，經(jīng)過必要的復(fù)蘇后再以骨蠟封閉打擊骨窗，縫合切口。沖擊時程和強(qiáng)度于示波器分別以毫秒(ms)和毫伏特(mV)顯示，作用于大鼠腦部的作用力在示波器顯示為單峰，將代表強(qiáng)度的電壓(mV)顯示換算為壓強(qiáng)

7、(atm)的公式為：Y= X×0.006 8，其中X代表實(shí)測顯示的mV大小，Y為所轉(zhuǎn)換后求得的壓強(qiáng)，0.006 8為固定系數(shù)。并將壓強(qiáng)換算為kPa。經(jīng)多次前期預(yù)實(shí)驗(yàn)證明：調(diào)整打擊錘角度至12度，則產(chǎn)生的壓力大小(170±10)kPa，作用時間為(20±2)ms，即為本實(shí)驗(yàn)所需要的實(shí)驗(yàn)條件。假手術(shù)組動物麻醉后僅行顱骨鉆孔及固定打擊頭，不進(jìn)行液壓沖擊致傷，骨蠟封閉鉆孔后縫合切口。正常組不進(jìn)行任何損傷。1.3 神經(jīng)行為學(xué)評價應(yīng)用NSS(neurological severity score)量表1，2對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為評價。正常大鼠神經(jīng)行為評價總分為19分。正常組和假手

8、術(shù)組均于創(chuàng)傷后1d、3d、7d評分。模型3 d組于創(chuàng)傷后1d、3d評分;模型7 d組于創(chuàng)傷后1d、3d、7d評分。1.4 病理形態(tài)學(xué)觀察1.4.1 光鏡觀察4組動物每組各用4只動物分別作光鏡觀察。各組動物按時間要求再次麻醉后，迅速取損傷區(qū)腦組織浸入4%多聚甲醛內(nèi)4固定48 h后，修成厚4 mm塊，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，行5 m冠狀切片，作HE染色，Olympus顯微鏡下觀察、照像。1.4.2 電鏡觀察4組動物每組各用3只動物分別作電鏡觀察。各組動物按時間要求再次麻醉后，迅速取損傷側(cè)海馬，投入2.5%戊二醛緩沖液中固定510 min，等組織稍變硬后，在顯微鏡下修整為1 mm×1 mm

9、×1 mm小塊，2%戊二醛/0.1 MPB(pH7.4)內(nèi)，室溫固定2 h，0.1 mol/lPBS清洗3次，10 min/次，1%鋨酸固定30120 min，再用0.1 mol/L的PBS清洗20 min，按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%丙酮(2次)，各5 min進(jìn)行梯度脫水，丙酮與環(huán)氧樹脂11混合浸透2h，再以純環(huán)氧樹脂包埋劑浸透2 h，包埋，80恒溫箱內(nèi)聚合10 h，修塊，半薄切片，光鏡定位后，進(jìn)行超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色各10 min，透射電鏡觀察、拍照、記錄和分析。2 模型評估2.1 傷后體征觀察中度液壓腦損傷后可致75%的大鼠反射消失、昏迷、四

10、肢運(yùn)動功能減弱，甚至去腦強(qiáng)直等神經(jīng)功能障礙5 min左右，且可出現(xiàn)持續(xù)約10 s呼吸暫停。且有15%左右的死亡率。假手術(shù)組有1只大鼠于開骨窗時損傷硬腦膜致出血故予以棄除;創(chuàng)傷3 d組2只大鼠死亡：創(chuàng)傷后15 min因打擊后呼吸停止，搶救無效死亡1只;第3天因高顱壓，腦疝死亡1只。創(chuàng)傷7 d組3只大鼠死亡：創(chuàng)傷后1 h因打擊后大量鼻出血，死亡1只;第3天因高顱壓，腦疝死亡1只;第5天因顱內(nèi)出血死亡1只。     10-09-02 10:08:00     編輯：studa202.3 病理形態(tài)學(xué)2.3.1 光鏡 正常組

11、：肉眼下腦組織表面光滑，溝回整齊、清晰，無充血，腫脹及出血灶。HE染色后觀察：腦組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列有序，染色均勻，無出血、腫脹及損傷，未見炎性細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張現(xiàn)象。皮層神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形或者橢圓形，核膜完整，核仁清晰可見，核仁淡染呈藍(lán)色，周圍神經(jīng)纖維致密，著色均勻;假手術(shù)組與正常組比較，無明顯差別，部分切片偶可見到少許神經(jīng)元腫脹，體積增大，核膜欠清;創(chuàng)傷3 d組：肉眼觀察，骨窗對應(yīng)處的腦皮質(zhì)凹陷，腦皮質(zhì)表面挫裂傷，其他部位腦組織彌漫腫脹。鏡下觀察：蛛網(wǎng)膜下腔出血可延及雙側(cè)大腦半球，以傷側(cè)為明顯，偶爾可擴(kuò)展到小腦表面。腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有明顯出血，累及額頂葉感覺運(yùn)動區(qū)，并延及傷側(cè)海馬、外囊、紋狀體和胼

12、胝體，且出血灶周圍血管擴(kuò)張，微血管外間隙明顯增大，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和組織間隙水腫明顯，炎性細(xì)胞浸潤，部分紅細(xì)胞被吞噬細(xì)胞吞噬、兩側(cè)半球有散在的損傷神經(jīng)元，核呈固縮狀。胞質(zhì)與胞核黏附在一起，胞質(zhì)強(qiáng)烈嗜伊紅，呈嚴(yán)重缺血性改變。同時可見大量的中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞積聚在水腫帶，部分浸潤腦實(shí)質(zhì);創(chuàng)傷7 d組：肉眼觀察，骨窗對應(yīng)處的腦皮質(zhì)凹陷，腦皮質(zhì)表面挫裂傷減輕，其他部位腦組織腫脹。鏡下觀察：蛛網(wǎng)膜下腔出血及腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血部分吸收，組織水腫減輕，傷區(qū)炎癥細(xì)胞略減少，膠質(zhì)細(xì)胞和纖維組織增生，可見泡沫細(xì)胞。2.3.2 電鏡正常組：可見正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體和多聚核糖體等結(jié)構(gòu)，胞體胞核形態(tài)、大小正常。可

13、見正常形態(tài)毛細(xì)血管管腔，電鏡下呈圓形或橢圓形，其內(nèi)有較多紅細(xì)胞，與管壁間有血漿形成的間隙，血管周圍無環(huán)形水腫，可見正常海馬神經(jīng)元;假手術(shù)組：可見到正常的多聚核糖體和粗面內(nèi)織網(wǎng)和近似于正常的血管，血管周圍線粒體輕度腫脹，但血管周圍無環(huán)形水腫;創(chuàng)傷3 d組：可見到海馬神經(jīng)元固縮，胞漿內(nèi)大量線粒體腫脹、水腫，胞核皺縮，甚至固縮，核膜凹陷，嵴斷裂，多聚核糖體解聚，神經(jīng)細(xì)胞胞體及突起固縮，電子密度增高，細(xì)胞及血管外周星形細(xì)胞突起腫脹，嚴(yán)重的星形細(xì)胞胞漿腫脹，和因缺血缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞核反應(yīng)性增大;創(chuàng)傷7 d組：與創(chuàng)傷3 d組比較，細(xì)胞損傷得到減輕，神經(jīng)元接近正常，但仍可看到血管周圍星形細(xì)胞突起腫脹、

14、水腫，線粒體腫脹，嵴消失，因缺血缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞胞核反應(yīng)性增大，和因組織壞死，損傷導(dǎo)致細(xì)胞器退變而形成的髓樣小體，凋亡早期的海馬神經(jīng)元。3 討論TBI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谘芯亢屠斫馀cTBI相關(guān)的復(fù)雜的生理、神經(jīng)行為和組織病理方面的變化中扮演著重要的角色。液壓損傷法原理是通過液壓裝置驟然改變密閉顱腔內(nèi)的壓力而間接造成腦損傷。是近十余年來應(yīng)用最廣的顱腦創(chuàng)傷模型，它的致傷機(jī)理類似與人類頭部撞擊后發(fā)生的腦變形。NSS作為一種從整體上評價動物損傷程度的量表，較之單一的行為學(xué)評價方法具有明顯的優(yōu)勢，本研究也證實(shí)NSS在液壓創(chuàng)傷性腦損傷動物模型的評價方面有良好的可靠性。實(shí)驗(yàn)中為使結(jié)果更加真實(shí)、穩(wěn)定，需注意以下幾個方

15、面：最為重要的是防止液壓打擊系統(tǒng)壓力泄漏;擺錘的長度因?yàn)樵O(shè)計加工時為可調(diào)節(jié)性的，一旦條件確定后，其與擺桿之間的固定螺絲必須旋緊固定;液壓活塞缸體及其所有連接部件內(nèi)必須充滿經(jīng)超聲脫氣的去離子水，保證沒有氣泡，這樣可以盡量減少沖擊時的時程及壓強(qiáng)波動;每次打擊前必須將液壓缸體活塞端調(diào)整至其外端的被打擊緩沖墊與處于自由懸吊狀態(tài)下的擺錘打擊接觸面間處于臨界接觸狀態(tài)，而且兩側(cè)接觸面的角度須調(diào)整到正向完整對合，保證由勢能轉(zhuǎn)化的動能沖量被瞬時全部傳遞給液壓缸體;打擊前為最大程度控制麻醉對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，動物必須處于半清醒狀態(tài)，具體指征包括：鉗夾肢體、尾或耳出現(xiàn)掙扎，角膜反射恢復(fù)，吸痰時明顯嗆咳，未受刺激時安

16、靜不動;用牙鉆開骨窗，注意保持硬腦膜完整，如果損傷硬腦膜，則需將該動物從模型組剔除;用水門汀打擊管與骨窗相互粘牢時，要調(diào)好水門汀的濃度和用量，不可過稀和用量太多而堵塞打擊管，影響壓力的傳遞;絕對避免打擊錘二次打擊液壓活塞，造成大鼠二次腦損傷，而加重大鼠腦損傷的程度。本研究使用標(biāo)準(zhǔn)化的手術(shù)方法及利用立體定向控制儀、國際通用的液壓打擊儀，并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，建立一個精度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡便的大鼠液壓顱腦損傷模型。為進(jìn)一步深入開展TBI的相關(guān)動物實(shí)驗(yàn)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。致謝：南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院車永哲教授在光鏡觀察中給予的指導(dǎo);天壇醫(yī)院電鏡室孫異臨教授在電鏡觀察中給予的幫助。【參考文獻(xiàn)】  1 ShapiraY,LamAM,ClavinCE,et al.Therapeutic time windows an