儀器分析章節(jié)小結(jié)

1、光譜分析法概論-章節(jié)小結(jié)1 .基本概念電磁輻射：是一種以巨大速度通過空間而不需要任何物質(zhì)作為傳播媒介的光子流。磁輻射性質(zhì)：波動(dòng)性、粒子性電磁波譜：所有的電磁輻射在本質(zhì)上是完全相同的，它們之間的區(qū)別僅在于波長(zhǎng)或頻率不同。若把電磁輻射按波長(zhǎng)長(zhǎng)短順序排列起來，即為電磁波譜。光譜和光譜法：當(dāng)物質(zhì)與輻射能相互作用時(shí)，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生能級(jí)躍遷，記錄由能級(jí) 躍遷所產(chǎn)生的輻射能強(qiáng)度隨波長(zhǎng)（或相應(yīng)單位）的變化，所得的圖譜稱為光譜。利用物 質(zhì)的光譜進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的方法稱光譜法。非光譜法：是指那些不以光的波長(zhǎng)為特征訊號(hào)，僅通過測(cè)量電磁輻射的某些基本性質(zhì)（反射、折射、干涉、衍射和偏振）的變化的分析方法。原子光譜

2、法：測(cè)量氣態(tài)原子或離子外層電子能級(jí)躍遷所產(chǎn)生的原子光譜為基礎(chǔ)的成分分析方法。為線狀光譜。分子光譜法：以測(cè)量分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)、分子中原子的振動(dòng)能級(jí)（包括分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)）和分子電子能級(jí)（包括振-轉(zhuǎn)能級(jí)躍遷）所產(chǎn)生的分子光譜為基礎(chǔ)的定性、定量和物質(zhì) 結(jié)構(gòu)分析方法。為帶狀光譜。吸收光譜法：物質(zhì)吸收相應(yīng)的輻射能而產(chǎn)生的光譜，其產(chǎn)生的必要條件是所提供的 輻射能量恰好滿足該吸收物質(zhì)兩能級(jí)間躍遷所需的能量。利用物質(zhì)的吸收光譜進(jìn)行定性、 定量及結(jié)構(gòu)分析的方法稱為吸收光譜法。發(fā)射光譜法：發(fā)射光譜是指構(gòu)成物質(zhì)的原子、離子或分子受到輻射能、熱能、電能 或化學(xué)能的激發(fā)躍遷到激發(fā)態(tài)后，由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)以輻射的方式釋放能量，而

3、產(chǎn)生 的光譜。利用物質(zhì)的發(fā)射光譜進(jìn)行定性定量及結(jié)構(gòu)分析的方法稱為發(fā)射光譜法。2 .基本計(jì)算(1 )電磁輻射的頻率：v=c/入=1/入=V /C(2 )電磁輻射的能量：E=h v=hC/入=hC d3 .光譜分析儀器組成：輻射源、分光系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)紫外-可見分光光度法-章節(jié)小結(jié)1 .基本概念透光率(T):透過樣品的光與入射光強(qiáng)度之比。T=|t/|。吸光度(A):透光率的負(fù)對(duì)數(shù)。A= lgT=lg(l o/l t)吸光系數(shù)(E):吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度。根據(jù)濃度單位的不 同，常有摩爾吸光系數(shù)&和百分吸光系數(shù)之分。電子躍遷類型：(1) d- d*躍遷：處于 d成鍵軌道上的電子

4、吸收光能后躍遷到d*反鍵軌道。飽和烴中電子躍遷均為此種類型，吸收波長(zhǎng)小于150nm。*反鍵軌道上，(2) n-n 躍遷：處于 n成鍵軌道上的電子吸收光能后躍遷到n所需的能量小于d-d *躍遷所需的能量。孤立的n - n*躍遷吸收波長(zhǎng)一般在200nm左 右，共軛的n- n*躍遷吸收波長(zhǎng)200nm，強(qiáng)度大。*(3) n- n躍遷：含有雜原子不飽和基團(tuán)，其非鍵軌道中的孤對(duì)電子吸收能量后向n反鍵軌道躍遷，這種吸收一般在近紫外區(qū)(200 400nm )，強(qiáng)度小。(4) n- d躍遷：含孤對(duì)電子的取代基，其雜原子中孤對(duì)電子吸收能量后向(T反以上四種類型躍遷所需能量(T- d鍵軌道躍遷，吸收波長(zhǎng)約在 200

5、nm 。(5) 電荷遷移躍遷和配位場(chǎng)躍遷生色團(tuán)：有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有n - n 或n- n躍遷的基團(tuán)，能在紫外一可* *見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的原子團(tuán)。助色團(tuán)：含有非鍵電子的雜原子飽和基團(tuán)，與生色團(tuán)或飽和烴連接時(shí)，能使該生色 團(tuán)或飽和烴的吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，并使吸收強(qiáng)度增加的基團(tuán)。紅移(長(zhǎng)移)：由于化合物的結(jié)構(gòu)改變，如發(fā)生共軛作用、引入助色團(tuán)以及溶劑改 變等，使吸收峰向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。藍(lán)移(紫移或短移)：當(dāng)化合物的結(jié)構(gòu)改變或受溶劑影響使吸收峰向短波方向移動(dòng)。增色效應(yīng)：由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強(qiáng)度增加。減色效應(yīng)：由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強(qiáng)度減小。吸收帶及其特點(diǎn):吸收帶符號(hào)

6、躍遷類型波長(zhǎng)(nm )吸收強(qiáng)度(ema()其他特征R*n t n250-500< 100溶劑極性f, 入 maxjK共軛n t n*210-250> 104共軛雙鍵f 入maxf，強(qiáng)度fB芳芳香族C=C骨架振動(dòng)及環(huán)內(nèi)*n Tn230-270200蒸氣狀態(tài)出現(xiàn)精 細(xì)結(jié)構(gòu)E苯環(huán)內(nèi) n Tn共軛*180 (E1 )200 (E2)104103助色團(tuán)取代 入maxf，生色團(tuán) 取代，與K帶合 并強(qiáng)帶：化合物的紫外可見吸收光譜中，摩爾吸光系數(shù)值大于104的吸收峰。計(jì)算分光光度法：運(yùn)用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)的方法，在傳統(tǒng)分光光度法基礎(chǔ)上，通過量測(cè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)的變換、解析和預(yù)測(cè)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定

7、量的方法。2 基本原理(1 ) Lambert-Beer定律：當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，樣品對(duì)光的吸收度與樣品的濃度及厚度成正比。A=ECI(2 )吸光度的加和原理：溶液中存在多種無相互作用的吸光物質(zhì)時(shí)，體系的總吸光度等于各物種吸光度之和。 A總=A a+A b+A c+”(3 )計(jì)算分光光度法： 雙波長(zhǎng)分光光度法：等吸收雙波長(zhǎng)消去法和系數(shù)倍率法均利用使 A干擾=0 , A信號(hào)= A被測(cè)原理消去干擾組分的吸光度值。 導(dǎo)數(shù)光譜法：禾U用導(dǎo)數(shù)光譜的輸出信號(hào)更多、更明顯(可顯示出結(jié)構(gòu)相似的不同化合物的 微小差別)及易于辨認(rèn)等特點(diǎn)定性；利用導(dǎo)數(shù)光譜法能消除背景干擾及分離重疊譜帶等優(yōu)勢(shì) 褶

8、合光譜法：是一種信號(hào)處理技術(shù)，即通過褶合變換，顯示原始光譜在構(gòu)成上的局部細(xì)節(jié) 特征，對(duì)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別；同時(shí)減少了混合物中共存組分之間的數(shù)學(xué)相關(guān)性， 因而可以測(cè)定共存組分的含量。3 .基本計(jì)算(1) Lambert-Beer 定律數(shù)學(xué)表達(dá)式： A=-IgT=ECI 或 T=10 =10-A -ECI(2)摩爾吸光系數(shù)與百分吸光系數(shù)的關(guān)系:(3)單組分定量: 吸光系數(shù)法：C= A/EI 對(duì)照法:C*s = 4校正曲線法（4）多組分定量（a + b的混合物）： 解線性方程組：廠-牛嗚-雪c _月嚴(yán)牟-為必總: E苗;-哥卑 等吸收雙波長(zhǎng)消去法："-邑-如-務(wù)-曲- '匯

9、-型* 系數(shù)倍率法： A =耳色譜分析法概論-章節(jié)小結(jié)r 1 i,*“I一、主要內(nèi)容1 .基本概念保留時(shí)間tR：從進(jìn)樣到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的時(shí)間間隔。死時(shí)間t。：分配系數(shù)為零的組分即不被固定相吸附或溶解的組分的保留時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間tR':某組分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的組分在柱中多停留的時(shí)間。相對(duì)保留值 陽，1 :兩組分的調(diào)整保留值之比。 5 / 21 分配系數(shù)K:在一定溫度和壓力下，達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相與流動(dòng)相中的濃度 之比。保留因子k :在一定溫度和壓力下，達(dá)到分配平衡時(shí)，組分在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量 之比。分離度R:相鄰兩組分色譜峰保

10、留時(shí)間之差與兩色譜峰峰寬均值之比。分配色譜法：利用被分離組分在固定相或流動(dòng)相中的溶解度差別或分配系數(shù)的差別而實(shí) 現(xiàn)分離的色譜法。吸附色譜法：利用被分離組分對(duì)固定相表面吸附中心吸附能力的差別或吸附系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離的色譜法。離子交換色譜法：利用被分離組分離子交換能力的差別或選擇性系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離 的色譜法。分子排阻色譜法：根據(jù)被分離組分分子的線團(tuán)尺寸或滲透系數(shù)的差別而進(jìn)行分離的色譜 法。渦流擴(kuò)散：在填充色譜柱中，由于填料粒徑大小不等，填充不均勻，使同一個(gè)組分的分 子經(jīng)過多個(gè)不同長(zhǎng)度的途徑流出色譜柱，使色譜峰展寬的現(xiàn)象。縱向擴(kuò)散：由于濃度梯度的存在，組分將向區(qū)帶前、后擴(kuò)散，造成區(qū)帶展寬的現(xiàn)象

11、。傳質(zhì)阻抗：組分在溶解、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的傳質(zhì)過程中所受到的阻力稱為傳質(zhì)阻抗。保留指數(shù)I:在氣相色譜法中，常把組分的保留行為換算成相當(dāng)于正構(gòu)烷烴的保留行為， 也就是以正構(gòu)烷烴系列為組分相對(duì)保留值的標(biāo)準(zhǔn)，即用兩個(gè)保留時(shí)間緊鄰待測(cè)組分的基準(zhǔn)物 質(zhì)來標(biāo)定組分的保留，這個(gè)相對(duì)值稱為保留指數(shù)，又稱Kovats指數(shù)。保留體積VR：是從進(jìn)樣開始到某組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)，所需通過色譜柱的流動(dòng)相 體積。 6 / 21 調(diào)整保留體積VR'：是由保留體積扣除死體積后的體積。保留比R':設(shè)流動(dòng)相的線速度為 u，組分的移行速度為v，將二者之比稱為保留比。2 .基本理論(1 )色譜分離的原理：組分在固定相和

12、流動(dòng)相間進(jìn)行反復(fù)多次的“分配”，由于分配系數(shù)K(或容量因子k)的不同而實(shí)現(xiàn)分離。各種色譜法的分離機(jī)制不同。(2) 塔板理論：塔板理論描述組分在色譜柱中的分配和轉(zhuǎn)移行為，由塔板理論導(dǎo)出的流出曲線方程為：塔板理論有如下基本假設(shè)： 在色譜柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度即一個(gè)塔板高度H內(nèi)，組分可以在兩相中瞬間達(dá)到分配平衡。 分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。 試樣和新鮮流動(dòng)相都加在第 0號(hào)塔板上。 流動(dòng)相不是連續(xù)地而是間歇式地進(jìn)入色譜柱，且每次只進(jìn)入一個(gè)塔板體積。 試樣在柱內(nèi)的縱向擴(kuò)散可以忽略。塔板理論在解釋流出曲線的形狀和位置、組分的分離及評(píng)價(jià)柱效等方面是成功的。(3) 速率理論：速率理論解釋了影響塔板高度或使色譜峰展寬的

13、各種因素，包括渦流擴(kuò)散、縱向擴(kuò)散、傳質(zhì)阻抗和流動(dòng)相線速度。其表達(dá)式為：H=A+B/u+CuA為渦流擴(kuò)散系數(shù)：A=2ldpB為縱向擴(kuò)散系數(shù)：B=2gDmC為傳質(zhì)阻抗：包括固定相傳質(zhì)阻抗 Cs和流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm3 基本計(jì)算(1 )保留值：tR'=t R-t 0, VR'=V R-Vo, 2,i=t Ri'/t R2'=V R1'/V R2'.=100rfn塩氐如一尊伽K亠"竺十工(2 )分配系數(shù)和保留因子：J，叫, tR=t o(1+KVs/Vm)=t o(1+k) , k=t R'/t o(3 )峰寬度： Wi/2 =2.355

14、 d , W=4 c=1.699W 1/2(4 )柱效：” -LW Hf Wfi/坤；山廠-】石(嶺/附F=LfH =(t'R 討=5.54(/b= 16GR/W9a(5 )分離度：硏"陣二、重點(diǎn)和難點(diǎn)本章主要學(xué)習(xí)色譜過程和分離原理、各類色譜的分離機(jī)制。尤其是色譜法的有關(guān)概念和色譜基本理論，是學(xué)習(xí)其后各章色譜分析方法的基礎(chǔ)。1色譜過程色譜過程是組分的分子在流動(dòng)相和固定相間多次分配的過程。若兩組分的分配系數(shù)存在微小的差異，經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使微小的差異積累起來，其結(jié)果就使分配系數(shù)小的組分被先洗脫，從而使兩組分得到分離。色譜分離的前提是分配系數(shù)或保留因子不等。2 有關(guān)概念及

15、計(jì)算公式這是本章的重點(diǎn)，一定要深入理解，牢固掌握。3 基本類型色譜方法及其分離機(jī)制(1 )分配色譜法：利用被分離組分在固定相或(和)流動(dòng)相中的溶解度差別，即分配 系數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離。包括氣液分配色譜法和液液分配色譜法。(2 )吸附色譜法：利用被分離組分對(duì)固定相表面吸附中心吸附能力的差別，即吸附系 數(shù)的差別而實(shí)現(xiàn)分離。包括氣固吸附色譜法和液固吸附色譜法。在硅膠液固吸附色譜中，極性強(qiáng)的組分吸附力強(qiáng)。常見化合物的吸附能力有下列順序：烷烴V烯烴V鹵代烴V醚V硝基化合物V叔胺V酯V酮V醛V酰胺V醇V酚V伯胺V羧 酸。(3)離子交換色譜法：禾U用被分離組分離子交換能力的差別即選擇性系數(shù)的差別而實(shí) 現(xiàn)分離

16、。按可交換離子的電荷符號(hào)又可分為陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。(4 )分子排阻色譜法：根據(jù)被分離組分分子的線團(tuán)尺寸，即滲透系數(shù)的差別而進(jìn)行分 離。分配色譜法是基礎(chǔ)，而且在 GC和HPLC中都還會(huì)有討論。在 TLC一章重點(diǎn)討論吸附色譜 法。后兩種方法只存在于液相色譜法中，但在后續(xù)章中都沒有專門討論，故在本章加以介紹。值得注意的是在實(shí)際色譜過程中各種分離機(jī)制極少單獨(dú)發(fā)生，常常是幾種機(jī)制同時(shí)發(fā)生， 只是某種機(jī)制起主導(dǎo)作用而已。4 .塔板理論塔板理論沿用分餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為。認(rèn)為在每個(gè)塔板 的間隔內(nèi)，試樣組分在兩相中達(dá)到分配平衡，經(jīng)過多次的分配平衡后，分配系數(shù)小的組分先

17、 流出色譜柱。同時(shí)還引入塔板數(shù)作為衡量柱效的指標(biāo)。而理論塔板數(shù)n可理解為在色譜柱內(nèi)溶質(zhì)平衡的次數(shù)(n=L/H),平衡的次數(shù)越多，柱效越高，組分間分離的可能性越大。塔板理論實(shí) 際上是把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程，分解為間歇的在單個(gè)塔板中的分配平衡過程。重點(diǎn)是要搞清溶質(zhì)在色譜柱內(nèi)的質(zhì)量分配和轉(zhuǎn)移。在色譜柱各塔板內(nèi)組分的質(zhì)量分布符 合二項(xiàng)式(ms+m m)N的展開式。Nmr是組分在色譜需要注意的是，在討論二項(xiàng)式分布時(shí)，用二項(xiàng)式展開式或通式求得的柱中各塔板內(nèi)的溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。當(dāng)轉(zhuǎn)移次數(shù)N=n （塔板數(shù)）時(shí)，柱出口開始能檢測(cè)到溶質(zhì)。流出曲線的縱坐標(biāo)是柱出口處的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該曲線也符合二項(xiàng)式分布曲線。當(dāng)塔板數(shù)

18、很大時(shí)流出曲線趨于正態(tài)分布曲線。5.速率理論Van Deemter 方程式為：H=A+B/u+Cu速率理論的塔板高度 H與塔板理論中的塔板高度有所不同，是色譜峰展寬的指標(biāo)，但兩者均是柱效的的度量。 B及C分別代表渦流擴(kuò)散系數(shù)、縱向擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)阻抗系數(shù)，其 單位分別為cm、cm2/s及s。三者均與色譜動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)。重點(diǎn)是要理解這些影響柱效的 因素的物理含義。渦流擴(kuò)散：也稱為多徑擴(kuò)散，與填充不規(guī)則因子I和填料（固定相）顆粒的平均直徑dp有關(guān)：A=2ldp縱向擴(kuò)散：縱向擴(kuò)散系數(shù) B與彎曲因子g和組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù) Dm有關(guān)：B=2gDm傳質(zhì)阻抗：影響組分溶解、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移的阻力，包括固定相傳

19、質(zhì)阻抗Csu和流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cmu 。流動(dòng)相線速度對(duì)塔板高度的影響：在較低線速度時(shí)，縱向擴(kuò)散項(xiàng)起主要作用，線速度升高，塔板高度降低，柱效升高；在較高線速度時(shí)，傳質(zhì)阻抗起主要作用，線速度升高，塔 板高度增高，柱效降低。速率理論研究影響柱效（或峰展寬即組分離散）的各種動(dòng)力學(xué)因素，用于指導(dǎo)色譜實(shí)驗(yàn)條件的選擇。Van Deemter 方程在GC、HPLC和CE中的具體形式和應(yīng)用將在相應(yīng)章節(jié)討論。根據(jù)此方程還可以求出流動(dòng)相的最佳流速其等于0時(shí)，H有極值，于是-Buuop。以 H=A+B/u+Cu對(duì) u 微分，得 H'=-Bu-2+C，當(dāng)-2+C=0，因此，此時(shí)塔板高度為月5 -A+BfjBfCA

20、 + 2JBC氣相色譜法-章節(jié)小結(jié)1.基本概念固定液相對(duì)極性，麥?zhǔn)铣?shù)，程序升溫，噪聲，漂移，分流比，檢測(cè)器靈敏度，檢測(cè)限等。2 .基本理論(1 )差速遷移：在色譜分析中，分配系數(shù)不同是組分分離的前提條件。氣相色譜法中，載氣種類少，可選余地小，要改變組分之間分配系數(shù)的或大小或比例，主要通過選擇合適的固定液。(2) GC中的速率理論：速率理論是從色譜動(dòng)力學(xué)的角度闡述影響柱效的因素，以VnDeemter方程式表示，在填充柱中，速率方程為：2k療 H=A+B/u+Cu =2 入dp+刃十上)，D*2gDg/u+在開管柱中，A = 0,此時(shí)速率方程為：r2(l + 6 +I1A11)2 匕療H=B/u

21、+Cgu+Clu叫“廳 u +最小板高對(duì)應(yīng)的載氣線速度稱為最佳線速度，為了減少分析時(shí)間，常用的最佳實(shí)用線速度大于最佳線速度。在學(xué)習(xí)速率理論時(shí)，應(yīng)熟悉速率方程式中各項(xiàng)和各符號(hào)的含義，即這些因素是如何影響柱效的，從而理解分離條件的選擇。(3) 色譜柱分填充柱及毛細(xì)管柱兩類，填充柱又分氣-固色譜柱及氣-液色譜柱。固定液按極性分類可分成非極性、中等極性、極性以及氫鍵型固定液。固定液的選擇按相似性原則。常用硅藻土載體分為紅色載體和白色載體，紅色載體常用于涂漬非極性固定液，白色載體常用于涂漬極性固定液。硅藻土載體常需進(jìn)行鈍化，其目的是為了減小載體表面的活性。載體 111 21 鈍化的方法有酸洗（AW ）、

22、堿洗（BW ）和硅烷化，這些鈍化方法分別除去堿性氧化物（主要 是氧化鐵）、酸性氧化物（氧化鋁）和覆蓋硅羥基。PLOT )毛細(xì)管柱可分為涂壁毛細(xì)管柱（ WCOT ）、載體涂層毛細(xì)管柱（SCOT）、多孔層毛細(xì)管柱（ 和填充毛細(xì)管柱。檢測(cè)器分濃度型及質(zhì)量型兩類。氫焰檢測(cè)器是質(zhì)量型檢測(cè)器，具有靈敏度高，檢測(cè)限小，死 體積小等優(yōu)點(diǎn)。熱導(dǎo)檢測(cè)器是濃度型檢測(cè)器，組分與載氣的熱導(dǎo)率有差別即能檢測(cè)。電子捕獲檢測(cè)器也是一種濃度型檢測(cè)器，檢測(cè)含有強(qiáng)電負(fù)性基團(tuán)的物質(zhì)，具有高選擇性和高靈敏度。為保護(hù)檢測(cè)器和色譜柱，開氣相色譜儀時(shí)，必須先開載氣，后開電源，加熱。關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān) 電源，最后關(guān)載氣。（4 ）柱溫的選擇原則為：在

23、使最難分離的組分有盡可能好的分離度的前提下，要盡可能采 用較低的柱溫，但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。對(duì)寬沸程樣品，采用程序升溫方式。（5 ）定性與定量：定性方法有已知物對(duì)照法，相對(duì)保留值，保留指數(shù)，利用化學(xué)方法配合， 兩譜聯(lián)用定性。定量方法常用歸一化法和內(nèi)標(biāo)法，在沒有校正因子情況下，使用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法較好。3 .基本計(jì)算固定液的相對(duì)極性縱-僉相對(duì)重量校正因子歸一化法Ci%=MAX卜旦盅+ 4忑+兔人X100外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 mi=fiAi ms=fsAs mi=Ci%=內(nèi)標(biāo)對(duì)比法高效液相色譜法-章節(jié)小結(jié)r 1 1 jr l i i injrjn i n一、主要內(nèi)容1 .基本概念(1) 化學(xué)鍵合相：利用

24、化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)基團(tuán)鍵合在載體表面形成的固定相。(2) 化學(xué)鍵合相色譜法：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法。(3) 正(反)相色譜法：流動(dòng)相極性小(大)于固定相極性的液相色譜法。(4) 抑制型(雙柱)離子色譜法：用抑制柱消除流動(dòng)相的高電導(dǎo)本底，以電導(dǎo)為檢測(cè)器的離子交換色譜法。(5) 手性色譜法：利用手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑分離分析手性化合物的對(duì)映異構(gòu)體的色譜法。(6) 親合色譜法：利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從復(fù)雜生物試樣中分離和分析特殊物質(zhì)的色譜方法，是基于組分與固定在載體上的配基之間的專一性親和作用而實(shí)現(xiàn)分離的色譜法。(7) 梯度洗脫：在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制改變流動(dòng)相的組成，如溶劑

25、的極性、離子強(qiáng)度和pH值等。(8) 靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗 Csm :由于組分的部分分子進(jìn)入滯留在固定相微孔內(nèi)的靜態(tài)流動(dòng)相中，因而相對(duì)晚回到流路中，弓I起的峰展寬。(9) 鍵合相的含碳量：鍵合相碳的百分?jǐn)?shù)，可通過對(duì)鍵合硅膠進(jìn)行元素分析測(cè)定。(10 )鍵合相的覆蓋度：參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。(11 )封尾：在鍵合反應(yīng)后，用三甲基氯硅烷等對(duì)鍵合相進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅醇基，即封尾。(12 )溶劑的極性參數(shù) P':表示溶劑與三種極性物質(zhì)乙醇(質(zhì)子給予體)、二氧六環(huán)(質(zhì)子受體P')和硝基甲烷(強(qiáng)偶極體)相互作用的強(qiáng)度。用于度量分配色譜的溶劑強(qiáng)度。P'越大，

26、溶劑的極性越強(qiáng)，在正相分配色譜中的洗脫能力越強(qiáng)。(13 )溶劑的強(qiáng)度因子S:常為反相鍵合相色譜的溶劑洗脫能力的度量。(14 )三維光譜-色譜圖：用 DAD檢測(cè)器檢測(cè)，經(jīng)過計(jì)算機(jī)處理，將每個(gè)組分的吸收光譜和試樣的色譜圖結(jié)合在一張三維坐標(biāo)圖上，即獲得三維光譜-色譜圖。2 .基本理論(1 )速率理論在 HPLC中表達(dá)式為：H=A+C mu+C smu用于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)條件的選擇。A、Cm和Csm均隨固定相粒度dp變小而變小，因此保證 HPLC高柱效的主要措施是使用小粒度的固定相。此外，要求粒度和柱填充均勻、使用低粘度流動(dòng)相、適當(dāng)?shù)牧魉俸椭鶞亍?2 )反相鍵合相色譜法保留機(jī)制：可用“疏溶劑理論”說明，即溶質(zhì)

27、的保留是其分子受到溶劑的斥力，而與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合的結(jié)果。反相鍵合相色譜法的k受下列因素影響： 溶質(zhì)的極性越強(qiáng)，k越?。?4 / 21 流動(dòng)相的含水量越高，使組分的 k越大; 流動(dòng)相的pH (離子抑制作用)和離子強(qiáng)度都影響k;鍵合相的烴基越長(zhǎng)，使溶質(zhì)k增大。(3)正相鍵合相色譜法：以氨基、氰基等極性鍵合相為固定相，以烷烴加少量極性調(diào)節(jié)劑 為流動(dòng)相，極性強(qiáng)的組分 k大。(4 )反相離子對(duì)色譜法：組分的離子與加入到流動(dòng)相中的離子對(duì)試劑的反離子生成中性離子對(duì)，增加在反相固定相上的保留。保留因子受離子對(duì)試劑的種類和濃度、流動(dòng)相的pH等影響。3 .基本計(jì)算(1 )混合溶劑的強(qiáng)度以下式計(jì)算:式中P

28、'為混合溶劑的極性參數(shù)，P'和ji為純?nèi)軇?啲極性參數(shù)及該溶齊恠混合溶劑中 的體積分?jǐn)?shù)。S混為混合溶劑的強(qiáng)度因子,Si和ji為純?nèi)軇﹊的強(qiáng)度因子及該溶劑在混合溶劑中的體積分?jǐn)?shù)。(2 ) HPLC的定量分析計(jì)算：與 GC相同。4 . HPLC儀器(1 )輸液泵(2 )檢測(cè)器：有紫外、熒光、電化學(xué)和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等。紫外檢測(cè)器：原理是朗伯比爾(Lambert-Beer )定律；適用于有紫外吸收的組分。二極管陣列檢測(cè)器：可獲得三維光譜-色譜圖，同時(shí)提供定性定量信息。熒光檢測(cè)器：原理是熒光強(qiáng)度與組分的濃度成線性關(guān)系。電化學(xué)檢測(cè)器：原理是當(dāng)組分經(jīng)過電極表面時(shí)，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電量

29、（Q ）的大小符合法拉第定律：Q=nFN ;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：散射光的強(qiáng)度（I）與氣溶膠中組分的質(zhì)量（m ）有下述關(guān)系：l=kmb 或 lgl=blgm+lgk二、重點(diǎn)和難點(diǎn)由于HPLC中的常用術(shù)語、色譜參數(shù)和色譜基本理論等都已在第16章中作了詳細(xì)的闡述，定性、定量分析方法又與 GC相同，因此，本章只討論高效液相色譜的各種具體方法，重點(diǎn) 是反相鍵合相色譜法。1 .正相鍵合相色譜法以極性鍵合相為固定相，如氰基（ CN ）、氨基（NH2）或二羥基鍵合相等，以非 極性或弱極性溶劑，如烷烴，加適量極性調(diào)整劑，如醇類作流動(dòng)相。正相鍵合相色譜主要用 于分離溶于有機(jī)溶劑的中等極性的分子型化合物。分離選擇性決

30、定于鍵合相的種類、流動(dòng)相 的強(qiáng)度和試樣的性質(zhì)。主要是理解其一般規(guī)律：極性強(qiáng)的組分的保留因子k大，后洗脫出柱。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。溶質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的作用力，如氫鍵、誘導(dǎo)或靜電作用等，是決定色譜保留和分離 選擇性的首要因素。流動(dòng)相的選擇性是通過其與試樣分子間的相互作用來實(shí)現(xiàn)的，分子間作 用力不同，則分離的選擇性不同。同系物，如甲醇與丙醇，作用力類型相同，其色譜分離的 選擇性相似，如果換成高偶極矩溶劑二氯甲烷，則選擇性將發(fā)生變化。2 .反相鍵合相色譜法在現(xiàn)代色譜學(xué)中，反相鍵合相色譜法一般就稱為反相色譜法。這是本章要掌握的重點(diǎn)。反相色譜法通常以非極性鍵合相為固定

31、相，以極性溶齊U及其混合物為流動(dòng)相，固定相的極性比流動(dòng)相的極性弱；能分離極性范圍很寬的試樣。鍵合相的烷基鏈長(zhǎng)和含碳量是影響溶質(zhì)的保留因子（及柱效）、選擇性和載樣量的重要因素。保留行為的主要影響因素: 溶質(zhì)的極性越弱，其疏水（疏溶劑）性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。 增加流動(dòng)相中水的含量，則溶劑強(qiáng)度降低，使溶質(zhì)的k增大。 流動(dòng)相的pH變化會(huì)改變?nèi)苜|(zhì)的離解程度，溶質(zhì)的離解程度越高，k值越小。因此，常加入少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿的離解，增加它與固定相的疏水締合作用，以達(dá)到分離的目的。這種色譜方法又稱為離子抑制色譜法。 固定相鍵合烷基的碳鏈延長(zhǎng)，硅膠表面鍵合烷基的濃度

32、越大，溶質(zhì)的k越大。3 .反相離子對(duì)色譜法把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，與組分離子生成中性離子對(duì)，從而增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使分配系數(shù)增加，改善分離效果。用于分離可離子化或離子型的有機(jī)酸、 堿、鹽等。影響容量因子的因素有離子對(duì)試劑的種類和濃度、流動(dòng)相的pH和流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的種類和比例等。4 .鍵合相的特點(diǎn)鍵合相有如下優(yōu)點(diǎn)： 使用過程中不流失； 化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣 量大。使用一般化學(xué)鍵合相時(shí)流動(dòng)相中水相的pH應(yīng)維持在28，以免引起硅膠溶解，但目前已有許多鍵合相能夠承受更寬的pH范圍。5鍵合相色譜法中流動(dòng)相對(duì)分離的影響根據(jù)分離方程式:n由固定相及色譜柱填充質(zhì)量決定,a （

33、即選擇性）主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。溶劑的選擇性：斯奈德（Snyder ）根據(jù)溶劑的質(zhì)子接受能力（ Xe）、質(zhì)子給予能力（Xd ） 和偶極作用力（Xn ），將選擇性參數(shù)定義為：? 1 ?根據(jù)Xe、Xd、Xn的相似性，將常用溶劑分為 8組（教材表），并得到溶劑選擇性分類三 角形。處于同一組中的各溶劑的作用力類型相同，在色譜分離中具有相似的選擇性，而處于 不同組別的溶劑，其選擇性差別較大。溶劑極性參數(shù)：產(chǎn)=+ 匕L +lg匕）*溶劑的極性和強(qiáng)度：溶劑的洗脫能力即溶劑強(qiáng)度直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑極性參數(shù)P'值越大，則溶劑的極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)。反相鍵合相色譜法

34、的溶劑強(qiáng)度常用強(qiáng)度因子S表示。極性弱的溶劑 S大，洗脫能力強(qiáng)?；旌先軇┑膹?qiáng)度：5.高效液相色譜中的速率理論高效液相色譜的流動(dòng)相是液體，液體與氣體性質(zhì)的差異是導(dǎo)致高效液相色譜的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程對(duì)柱效的影響與氣相色譜有差別的主要原因。（1 ）縱向擴(kuò)散可忽略：縱向擴(kuò)散系數(shù) 3=2 YDm，在HPLC中，液體流動(dòng)相粘度大，使 Dm 很小。因此只有在流速很低時(shí)才能觀察到縱向擴(kuò)散對(duì)柱效的影響。在常用色譜條件下， 縱向擴(kuò)散可以忽略，故流速升高，H總是升高。但升高速率比 GC中慢，因此，為了快速分析，一般仍選擇大于最佳流速的條件。（2 ）傳質(zhì)阻抗：化學(xué)鍵合相色譜法中，df可忽略，故固定相傳質(zhì)阻抗 Cs可忽略。流

35、動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm= wmdp/Dm 中的wm 與柱內(nèi)徑、形狀、填料性質(zhì)等有關(guān)，但至今仍沒確切的2數(shù)值或關(guān)系。與GC中的Cs不同，Cm與保留因子無關(guān)。HPLC中還有一項(xiàng)靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻 抗Csm，而且Cm和Csm都與固定相的粒度dp有關(guān)。（3 ）渦流擴(kuò)散?。盒☆w粒球形固定相，勻漿高壓填充，降低渦流擴(kuò)散。（4）HPLC中的范第姆特方程為：H=A+C mu+Csmu（5 ）固定相粒度對(duì)塔板高度的影響：dp變小，A、Cm和Csm均變小，而且塔板高度受流動(dòng)相線速度的影響也越小?？梢娦×６鹊奶盍媳仍贕C中更為重要。根據(jù)速率理論，HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是： 小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相； 低粘度流動(dòng)相，流速

36、不宜快； 柱溫適當(dāng)。6 反相鍵合相色譜實(shí)驗(yàn)條件的選擇在反相鍵合相色譜中，常選用非極性鍵合相。非極性鍵合相可用于分離分子型化合物，也可用于分離離子型或可離子化的化合物。ODS是應(yīng)用最廣泛的非極性固定相。對(duì)于各種類型的化合物都有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物的分離，苯基鍵合相適 用于分離芳香化合物以及多羥基化合物如黃酮苷類等。反相鍵合相色譜法中，流動(dòng)相一般以極性最強(qiáng)的水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑。極性調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)以及其與水的混合比例對(duì)溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下，甲醇-水已能滿足多數(shù)試樣的分離要求，且粘度小、價(jià)格低，是反相鍵合相色譜法最常用的流動(dòng)相。乙腈的溶劑強(qiáng)度較高，且粘度較小，其截止