多肽GRGDS修飾的紫杉醇長循環(huán)靶向脂質(zhì)體的體外評價

1、多肽GRGDS修飾的紫杉醇長循環(huán)靶向脂質(zhì)體的體外評價趙 慧1, 2,王堅成1，羅春蕾1,孫啟時2,張 強1, 3（1北京大學藥學院藥劑學系，北京100083； 2沈陽藥科大學中藥學院，沈陽110016； 3北京大學天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室，北京100083)摘要目的：本研究以甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸（glycine-arginine-glycine-aspartic acid-serine，GRGDS）五肽修飾的脂質(zhì)體作為抗癌藥物-紫杉醇的載體，對其體外理化性質(zhì)和細胞毒作用進行評價。方法：采用化學偶聯(lián)合成 DSPE-PEG-GRGDS，以此作為導向性材料，采用薄膜分散法

2、制備載紫杉醇的PEG修飾長循環(huán)脂質(zhì)體（GRGDS-SSL-PTX ），并對脂質(zhì)SKOV-3細胞和人乳腺體的包封率、粒徑和體外釋放率等性質(zhì)進行了考察，同時采用人卵巢癌癌MCF-7細胞進行了體外細胞生長抑制的評價。結(jié)果：與普通紫杉醇長循環(huán)脂質(zhì)體（SSL-PTX）相比，本研究所制備紫杉醇主動靶向脂質(zhì)體（GRGDS-SSL-PTX ）的粒徑、包封率、載藥量、體外釋放及穩(wěn)定性等理化性質(zhì)無顯著差異，包封率約為95%,平均粒徑為（117.5 .3）nm。冰凍蝕刻透射電鏡觀察結(jié)果表明，脂質(zhì)體外觀基本圓整且均勻分明，12 h內(nèi)，分別有 67.9%和72.3%的PTX從SSL-PTX和GRGDS-SSL-PTX

3、中釋放。體外細散。體外釋放結(jié)果表胞毒實驗結(jié)果表明， GRGDS-SSL-PTX對人卵巢癌 SKOV-3細胞和人乳腺癌 MCF-7細胞的生長抑制作用均有增強，分別為SSL-PTX的1.42倍和2.12倍。結(jié)論：GRGDS五肽修飾的紫杉醇靶向脂質(zhì)體成功制備，將有利于體內(nèi)腫瘤的靶向治療效果。關(guān)鍵詞整合素；脂質(zhì)體；紫杉醇；靶向中圖分類號R943.42 ； R979.1文獻標識碼A文章編號1003-3734In vitro evaluation of GRGDS pep tide modified lipo somes containingP aclitaxelZHAO Hui 1,2，WANG Jia

4、n-cheng 1，LUO Chun-lei 勺，SUN Qi-shi2，ZHANG Qiang 1，3(1 Department of Pharmaceutics， School of Pharmaceutical Sciences， Peking University， Beijing100083， China ； 2 School of Traditional Chinese Medicine ， Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China ； 3 The State Key Laboratory of Natural

5、 and Biomimetic Drugs ，PekingUniversity， Beijing 100083，China)基金項目國家自然科學基金（30572261）;國家重大基礎(chǔ)研究計劃（973）項目（2007CB935801）作者簡介趙慧，女，博士研究生。聯(lián)系電話：（010） 82802684，E-mail : joaanazhao。通訊作者王堅成（1974-），男，博士，副教授，主要從事藥物新劑型研究。聯(lián)系電話：（010） 82802683,E-mail : wang-jc。Abstract Objective ： To investigate the glycine-argine-g

6、lycine-aspartic acid-serine (GRGDS)modified liposomes as the carriers of anticancer drug-paclitaxel. Methods ：The DSPE-PEG-GRGDSsynthesized by DSPE-PEG-NHS and GRGDS was used as liposomes materials to obtain the paclitaxelloaded modified paclitaxel liposomes (GRGDS-SSL-PTX). The encapsulation effici

7、ency ，drugloading ， particle size and in vitro release and cytotoxicity were performed. Results ：Theencapsulation efficiencies of t he liposomes were above 95% and the modification of GRGDS didnaffect the physicochemical characters， such as particle size， encapsulation efficiency and invitrorelease.

8、 The average size of SSL-PTX and GRGDS-SSL-PTX were ( 115.5 2.2 ) nm and117.5 1.3) nm respectively. There was no obviously difference in vitro release of paclitaxelreleased from the SSL-PTX and GRGDS-SSL-PTX. Compared to SSL-PTX ，1.42 fold to SKOV3and 2.12 fold to MCF-7 were found in vitro cytotoxic

9、ities. Conclusion： GRGDS-SSL-PTX might bea potential formulation for targeting cancer therapy in patients.Key words integrin ； liposome； paclitaxel ； target紫杉醇 (paclitaxel) ，是近 20年來研究熱門的代表性的紫杉烷類抗癌藥物之一，它能促進微管聚合，抑制微管降解，使細胞分裂阻滯在 G2/M 期，最終誘導細胞凋亡。由于其獨特的抗腫瘤作用機制，是臨床治療卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌的一線藥物，同時對轉(zhuǎn)移性食管癌、肝癌、鼻咽癌、晚期

10、胃癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌及對順鉑、阿霉素耐藥的癌細胞也有治療效果。目前，國內(nèi)外對其制劑的研究也非常廣泛，其中，Taxol 和白蛋白納米粒 ABRAXANE 已經(jīng)上市。近年來，主動靶向制劑引起了研究者的廣泛關(guān)注。長循環(huán)脂質(zhì)體作為靶向給藥系統(tǒng)的載 體，能夠減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) (reticuloendothelial system， RES) 對載藥顆粒的識別攝取，以延長 體內(nèi)循環(huán)時間，具有延緩藥物代謝和增強靶向的作用。為了進一步提高藥物的療效，降低毒副作用，研究者們采用很多方法，其中，就PEG鏈末端偶聯(lián)抗體或配體，制備主動靶向脂質(zhì)體開 展了很多研究工作 1 。整合素( integrin )作為細胞

11、膜受體，是一組二價離子依賴性細胞表面糖蛋白，能夠介導細胞與細胞外基質(zhì)( Extracellular Matrix ，ECM )以及細胞與細胞之間的粘附反應3。2 ，并且對腫瘤 細胞的信號傳遞、基因表達、細胞增值、調(diào)亡、侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管生長都起到重要作用 整合素在大部分惡性腫瘤中表達比較高，而在正常組織和細胞中表達較低或基本無表達。以整 合素為靶向的藥物傳遞系統(tǒng)，尤其是整合素配體介導的抗癌藥物靶向傳遞給藥系統(tǒng)近年來受到 了廣泛的關(guān)注。 RGD 配體作為整合素的識別位點，以其相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定、易于制備，且 無免疫原性等優(yōu)點受到了研究者們的親睞。3.1 脂質(zhì)體的粒徑和外部形態(tài)分別取上述靶向長循

12、環(huán)脂質(zhì)體溶液（SSL-PTX和GRGDS-SSL-本實驗中，我們成功制備了含 RGD序列的配體GRGDS修飾的紫杉醇長循環(huán)脂質(zhì)體，并對脂質(zhì)體的體外理化性質(zhì)進行了考察，并評價其對人卵巢癌細胞SKOV-3和乳腺癌細胞MCF-7的體外靶向性。材料RE52CS2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；RJ-TGL 16G臺式高速離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；Mini Extruder （美國Avanti Polar Lipids ）; BAF 400D高真空冷凍蝕刻儀（美國 BALZERS 公司）； Tecnai 20透射電子顯微鏡（ FEI-Philips 公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國 Therm

13、o Forma Series II ）；酶標儀（美國 BIO-RAD Model 680 ）。甘氨酸 - 精氨酸 - 甘氨酸 -天冬氨酸 -絲氨酸（ Glycine-arginine-glycine-asparticacid-serine，GRGDS ）五肽（純度 98%，上海再創(chuàng)生物科技有限公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 醇（2000）-N-羥基琥珀酰亞胺（DSPE-P EG（2000）-NHS , NOF ,日本）；EPC-聚乙二德 國 LipoidGmbH公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000 , NOF，日本）；膽固醇和HEPES緩沖鹽均購自美國Sigma公司；

14、紫杉醇購自云南漢德生物技術(shù)有限公司；小牛血清（英國Gibco公司）；細胞培養(yǎng)基（RPMI 1640，北京天潤善達公司）；人卵巢癌細胞SKOV-3，人乳腺癌細胞 MCF-7 （北京大學藥學院藥理系提供）；其它試劑均為市售分析純。1 GRGDS 與 DSPE-PEG-NHS 的連接 4精密稱取 GRGDS和DSPE-PEG-NHS適量,-1分別溶于適量的HEPES緩沖液0.01mol mL-,pH=7.5 ），然后在4 C條件下攪拌，將 DSPE-PEG-NHS的溶液加入含 GRGDS的HEPES溶液中 （DSPE-PEG-NHS : GRGDS =2 : 1，物質(zhì)的量比），繼續(xù)緩慢攪拌 8h，用

15、TLC跟蹤反應，直至GRGDS完全消失，再繼續(xù)反應 4h后加甘氨酸終止反應。將反應液置透析袋中用蒸餾水透析, 冷凍干燥，即得 DSPE-PEG-GRGDS ，并使用 MALDI-TOF-MS 鑒定反應生成物。2 紫杉醇長循環(huán)靶向脂質(zhì)體的制備將紫杉醇、EPC和膽固醇按0.4 : 19 : 1混合，溶于氯仿中，置于 37C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中揮5葡萄糖溶液水化，干氯仿至瓶內(nèi)壁上形成一層脂質(zhì)薄膜，置真空干燥器內(nèi)干燥過夜，加入DSPE-PEG用Mini-Extruder過0.1 g聚碳酸酯膜10次。將得到的普通納米脂質(zhì)體分別與適量的或DSPE-PEG-GRGDS （5%摩爾百分含量）混合，37C緩慢攪拌，

16、避光孵育 2h,即得SSL-PTX3 脂質(zhì)體的體外性質(zhì)評價PTX） 100譏用5 %葡萄糖溶液稀釋到2mL，混合均勻，采用激光散射粒徑測定儀（ZetasizerNano , Malvern , UK）對其粒徑分布進行分析。采用冰凍蝕刻方法制作脂質(zhì)體樣品，通過透射 電子顯微鏡觀察紫杉醇脂質(zhì)體的外觀形態(tài)。3.2 脂質(zhì)體的包封率和載藥量的測定分別取制備得到的脂質(zhì)體適量，15000r Ln-1離心15min（在該條件下，游離的紫杉醇結(jié)晶析出，沉淀，而脂質(zhì)體不會沉淀），取上清液10 L,加流動相至1mL,渦旋，10000r mi n-1離心5min，取上清液用0.45Am濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品 溶

17、液。采用HPLC分析方法測定溶液中紫杉醇藥物濃度。檢測波長為 214nm ；phenomenex Corp.,50卩g紫杉醇脂質(zhì)體液相色譜條件：流動相為乙腈-水（60 : 40）;流速為1mL- min-1;柱溫為 35C；色譜柱為 Luna C18 柱（250 mm X 4.6 mm, 5 km,Torrenee, CA , USA ）;進樣量為 20 譏3.3脂質(zhì)體的體外釋放參考Koziara等人報道的方法，分別精密吸取含（SSL-PTX和GRGDS-SSL-PTX ）加入透析袋（Mw. 800015000 ）內(nèi)，兩端夾緊后分別置于50mL PBS （含0.1%聚山梨酯80 , pH7.4

18、 ）中，于37 C恒溫搖床中以 100r min-1的速率持續(xù)振搖。Taxol溶液作為陽性對照。在指定時間點（0, 0.25, 0.5 , 1, 2, 4, 6, 8, 12 , 24h）取F/% = （A t/A加）X100。其中F為釋放度，At為累計釋放的PTX的量，A加為加入透析袋中紫杉醇的總量。200卩L透析液，同時補充相同體積同溫度的釋放介質(zhì)。將樣品進液相分析，液相條件同前，計 算紫杉醇釋放百分率。釋放度的計算公式如下：3.4脂質(zhì)體載藥穩(wěn)定性考察紫杉醇脂質(zhì)體制備完成后，分散在含5%葡萄糖的溶液中，置4C 冰箱儲存，觀察脂質(zhì)體外觀并測定其載藥量的變化，以考察脂質(zhì)體載藥穩(wěn)定性情況。3.5

19、 細胞生長抑制實驗選取處于指數(shù)生長期的人卵巢癌細胞株SKOV-3，進行細胞消化，用含10%小牛血清的RPM I1640配成混懸液。將細胞分到 96孔板中，每孔含10000個細胞，在37 C, 5% CO 2中培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，以不含血清培養(yǎng)基分別稀釋SSL-PTX和RGD-SSL-PTX濃度至 1, 4, 8, 10, 15, 20, 30, 50, 100nmol L-1，每個濃度 3孔，每孔 200 訂 加入 96 孔板，在37C, 5% CO2中培養(yǎng)72 h。然后用4C預冷的三氯醋酸固定，將細胞培養(yǎng)板于 4C放 置1 h,蒸餾水洗5次除去三氯醋酸、培養(yǎng)液、低相對分子質(zhì)量代謝物以及血

20、清蛋白，空氣干燥1 1后，力P 4 g L- SRB染色15min，用1 %醋酸洗滌5遍，干燥后，加入 10mmol L- Tris液150 溶解，使用酶標檢測儀于波長540nm處測定吸收度（A）值，計算IC50。人乳腺癌細胞MCF-7試 驗同法操作。1 GRGDS 與 DSPE-PEG-NHS 的連接DSPE-PEG-NHS的PEG鏈末端連接活潑酯，GRGDS的氨基為親核基團，在適當?shù)膒H值條件下，二者之間易發(fā)生親核取代反應。GRGDS與DSPE-PEG-NHS反應的過程見圖 1。用2所示,TLC跟蹤GRGDS與DSPE-PEG-NHS之間的連接。凍干后的反應產(chǎn)物的質(zhì)譜圖如圖平均相對分子質(zhì)量

21、為3462，而 DSPE-PEG-NHS , GRGDS和NHS的相對分子質(zhì)量分別為2997 , 490和115,根據(jù)化學反應式計算，反應生成物DSPE-PEG-GRGDS的相對分子質(zhì)量應 為2997 （DSPE-PEG-NHS相對分子質(zhì)量）+ 490（ GRGDS的相對分子質(zhì)量）-115 （NHS的相對分子質(zhì)量） 44n （n代表CH2CH2O-片段的相對分子質(zhì)量），結(jié)果與 MALDI-TOF-MS 譜圖的結(jié)果一致，證明了反應發(fā)生，且反應物按1 :1進行反應。由以上結(jié)果可見,當反應條件為4C,反應時間為8h以上，DSPE-PEG-NHS與GRGDS的物質(zhì)的量比為時，反應能夠進行得較完全。H2

22、 NNHDSPE-PEGDSPE-PEGO-OHOODSPE-PEGOH 2NO+ HnXNH2 JOOODSPE-PEG、OOHNOON5nHO-圖1 GRGDS和DSPE-PEG-NHS偶聯(lián)的反應式Kraire PC Awma CFPcJus V2.4-1. Mod? Un&sr. Pwrar. 100, ENiked. P 曰. 1500 bn flnVliurn- 154i rnV Frahies 1-7? Smwtfi 加 弓日Ee 30%lnt- .- - .- - 1D0SO-GOTO-&Q-M-40-30-10-ft20002脂質(zhì)體的體外性質(zhì)評價2.1脂質(zhì)體的粒徑和外部形態(tài)II

23、I3000320034003 KOJSW4M042fl04如DSPE-PEG-GRGDS 的 MALDI-TOF 質(zhì)譜圖粒度測定結(jié)杲如下：SSL-PTX和GRGDS-SSL-PTX的平均粒徑分別為(115.5 .2) nm ( PDI: 0.14 .02)和(117.5 .3) nm (PDI : 0.10 .02)。各處方脂質(zhì)體粒徑分布測定結(jié)杲如圖 3所示，不同脂質(zhì)體的粒徑分布成正態(tài)分布，分布范圍窄，有90%以上粒子粒徑V 200 nm。透射電子顯微鏡下觀察制備所得脂質(zhì)體，結(jié)果如圖4所示，上述脂質(zhì)體均為圓形或類圓形粒子，其外觀無明顯差異。由此判斷,2種脂質(zhì)體的外觀形態(tài)及粒徑分布100010S

24、SL-PTXGRGDS-SSL-P TX無顯著差異。100DumBlerA15JI亠二蓋匸上三10IMMe血仙1H0圖3紫杉醇脂質(zhì)體的粒度分布圖-E壯;TV ：，環(huán)-I1 -.-n、 V KT MASSL-PTXGRGDS-SS L-PTX圖4紫杉醇脂質(zhì)體的外觀形態(tài)2.2脂質(zhì)體的包封率和載藥量2種長循環(huán)脂質(zhì)體SSL-PTX和GRGDS-SSL-PTX的包封率測定結(jié)果分別為(100.14芳.44)% 和(96.97 1.25)%，載藥量 分別為(1.87 .32)% 和(1.81 .21)%。脂質(zhì)體的包封率均在 95%以上，該制備方法包封率高。2.3 脂質(zhì)體的體外釋放長循環(huán)脂質(zhì)體在含0.1%聚山

25、梨酯80的PBS (pH7.4 )中的釋放結(jié)果見圖5, SSL-PTX和GRGDS-SSL-PTX釋放情況基本一致，12h釋放率分別為67.9%和72.3%。而對照組Taxol?溶液中紫杉醇釋放速度相對較快，在15min時就有60%的紫杉醇藥物釋放。這一結(jié)果表明，脂質(zhì)體的包裹可顯著延緩紫杉醇的釋放。)%量放釋積累的醇杉紫0102030時間(小時)Taxol () SSL-PTX ( , GRGDS-SSL-PTX()圖5紫杉醇制劑的體外釋放情況(100r min-1, 37C)02.4脂質(zhì)體的穩(wěn)定性試驗將制備得到的紫杉醇長循環(huán)脂質(zhì)體于4 C條件下避光冷藏，在10d內(nèi)觀察其分散溶液的外觀。結(jié)果發(fā)

26、現(xiàn)，在4C保存條件下，1周內(nèi)溶液外觀均無明顯改變，均為淡乳白色溶液，有藍色乳光，稀釋后為透明溶液，無沉淀物產(chǎn)生，且粒徑無明顯變化；但繼續(xù)放置至10d后，溶液透光性變差，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)有大量針狀結(jié)晶生成，粒徑顯著增大。脂質(zhì)體現(xiàn)象類似，無明顯差異。含量測定結(jié)果見表1,說明脂質(zhì)體中PTX含量在1周內(nèi)保持在90%以上，至10d時，脂質(zhì)體中PTX含量大幅度下降。制劑紫杉醇脂質(zhì)體的包封率/%0d1d3d5d7d10dSSL-PTX100.1 .398.5 2.198.3 0.595.9 0.597.2 2.474.4 0.9GRGDS-SSL-PTX96.9 2;496.1 0.697.4 296.1

27、3.089.9 6.084.6 2.1表1紫杉醇脂質(zhì)體4C冰箱冷藏的穩(wěn)定性2.5細胞生長抑制 采用SRB （sulforhodamine B ）法考察紫杉醇脂質(zhì)體的細胞毒活性，測定各種紫杉醇脂質(zhì)體對人卵巢癌細胞SKOV-3和人乳腺癌細胞MCF-7的細胞毒作用。結(jié)果如表 2所示，對于 人卵巢 癌細胞 SKOV-3 , GRGDS-SSL-PTX 的 IC50 為 54.0nmol L-1 ,而 SSL-PTX 為74.5nmol L-1, GRGDS-SSL-PTX的細胞毒作用是 SSL-PTX的1.42倍。對人乳腺癌細胞 MCF-7 , GRGDS-SSL-PTX 的 IC50為47.8 nm

28、0I L-1，而 SSL-PTX 為 22.5nmol L-1, GRGDS-SSL-PTX 的細胞毒作用是SSL-PTX的2.12倍（P V 0.05）。各空白脂質(zhì)體輔料均無細胞毒，對測定無干擾。表2 2種紫杉醇脂質(zhì)體對人卵巢癌 SKOV-3和乳腺癌MCF-7細胞的細胞毒（IC50）作用制劑IC50/nmol L-SKOV-3MCF-7SSL-PTX76.5 土.147.8 3.3GRGDS-SS L-PTXa54.0 0.322.5 5.5a與 SSL- PTX 相比，a：討P V 0.05。論近年來，脂質(zhì)體與抗體或配體結(jié)合的方法已被廣泛應用于長循環(huán)脂質(zhì)體1，7，本研究采用GRGDS與DS

29、PE-PEG末端的活性酯 NHS反應，偶聯(lián)到 PEG的末端。含種整合素的識別位點，可用于抗癌藥物靶向傳遞系統(tǒng)的設計。例如,RGD序列的多肽是多Xiong等8人制備了GRGDS為導向化合物的膠束，并在B16-F10細胞實驗的基礎(chǔ)上證明，在膠束表面偶聯(lián)GRGDS可以增加疏水性藥物向腫瘤細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。由于人卵巢癌細胞 SK0V-3表面高表達整合素受體a v B和a v閉5，人乳腺癌細胞 MCF-7表面不表達 a vB，但表達 a v B叩，本實驗選用了上述2種細胞進行脂質(zhì)體的體外細胞毒評價。實驗結(jié)果表明，與 SSL-PTX 相比， GRGDS 修飾的 PTX 脂質(zhì)體 GRGDS-SSL-PTX 對

30、2 種細胞株的生長抑制作用均有顯著程度的增強。這一結(jié)果提示，整合素配體RGD 修飾的脂質(zhì)體可以用作抗癌藥物的載體靶向腫瘤細胞，但不同細胞對受體的親合性和細胞表面表達的受體的種類及量的多少密切相關(guān)，同種配體對不同細胞的靶向能力不同，具體的靶向性需要實驗進步證實?？傊?，本實驗成功制備了GRGDS-SSL-PTX。體外實驗表明， GRGDS對SSL-PTX的修飾并不影響脂質(zhì)體的理化特征，但卻增加了紫杉醇脂質(zhì)體對腫瘤細胞的靶向性，進而增加了細胞毒性，為腫瘤的靶向治療提供新的思路。在后繼的研究中，作者將對其是否可以增加荷瘤動物的體內(nèi)抗腫瘤作用加以探討。參考文獻 1SAPRA P， ALLEN T M.

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