小鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸的體外微透析法測(cè)定

1、    小鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸的體外微透析法測(cè)定*        在動(dòng)物缺血缺氧性腦損傷的研究中，有關(guān)腦內(nèi)興奮性氨基酸毒性的研究近年來(lái)取得了很大進(jìn)展。許多證據(jù)表明，缺血缺氧可導(dǎo)致動(dòng)物腦內(nèi)興奮性氨基酸持續(xù)升高，細(xì)胞膜上離子通道病理性開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，最后造成急性期神經(jīng)元水腫和退變1，2。因此，對(duì)腦內(nèi)興奮性氨基酸含量的測(cè)定已成為目前研究缺血缺氧性腦損傷及內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的重要手段之一。為了深入研究缺血缺氧性腦損傷的機(jī)制，以及內(nèi)源性的缺血缺氧耐受機(jī)制，我們建立了小鼠腦內(nèi)興奮性氨

2、基酸的體外微透析-高效液相色譜(high performance liquid chromatograph, HPLC)快速測(cè)定方法，并應(yīng)用于急性重復(fù)缺氧小鼠研究中。 材料與方法(一)儀器：1050 A型液相色譜儀，美國(guó)惠普公司(Hewllet-Packard)產(chǎn)品。WZS-50型微量注射機(jī)(靈敏度：±5 L/h)浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。(二)試劑：氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde, OPA)、硼酸為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，巰基乙醇、甲醇、無(wú)水乙酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?三)樣品制備：1.急性重復(fù)缺氧動(dòng)物樣品的制備：將昆明小鼠(體重16.0022.

3、00 g)置于含有新鮮空氣，經(jīng)過(guò)標(biāo)定的125 mL廣口瓶中，以橡皮塞密閉，一出現(xiàn)喘呼吸立即取出，并隨即轉(zhuǎn)移到另一相似體積的、含有新鮮空氣的廣口瓶中，密閉。如此重復(fù)1次或4次后立即斷頭，將鼠頭迅速置于液氮罐中，隔夜取出。冰浴條件下取腦組織約400 mg，加入冰冷的超純水1.5 mL，勻漿。勻漿液立即置于4保存，4 h內(nèi)透析。2.空白對(duì)照樣品的制備：空白對(duì)照組動(dòng)物除不經(jīng)缺氧處理外其它處理同缺氧組。(四)微透析實(shí)驗(yàn)：1.微透析探頭：選用瑞典Camegie Medicine公司生產(chǎn)的CMA/10型同心圓微透析探頭，透析膜長(zhǎng)4 mm,外直徑0.5 mm。2.透析探頭體外回收率的測(cè)定：將透析探頭分別置于不

4、同濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液中，用微注射機(jī)以1.0 L/min速度向探頭內(nèi)灌流生理鹽水，在04條件下收集透析液，用HPLC法測(cè)定透析液中谷氨酸(glutamate, Glu)與天門(mén)冬氨酸(aspartate, Asp)含量，觀察探頭外氨基酸濃度對(duì)探頭回收率的影響。3.樣品的微量透析：制備好的小鼠腦勻漿液樣品置于冰盒內(nèi)，透析探頭置于樣品中，以1.0 L/min速度連續(xù)灌流生理鹽水，在04條件下收集到的透析液立即置于4保存。(五)樣品的HPLC法測(cè)定：1.氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和衍生化試劑的配制：用0.5 mol/L鹽酸溶液配制含22種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4保存。衍生化試劑：10 mg OPA溶于0.25 mL甲

5、醇中，再加入20 L -巰基乙醇和2 mL 0.2 mol/L硼酸緩沖液(pH 9.5)混勻，4保存，24 h后使用。每隔1 d補(bǔ)加10 L -巰基乙醇，1星期內(nèi)使用。2.色譜條件及衍生化反應(yīng)：柱：Nova Pak C18色譜柱(Waters)，150 mm×3.9 mm i.d.,粒徑4 m，柱溫：40，流速：0.8 mL/min，流動(dòng)相組成：A液為0.1 mol/L，乙酸鈉緩沖液(pH 6.95)內(nèi)含8%甲醇；B液為甲醇。樣品采用自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣程序及衍生化反應(yīng)為：(1)洗針，(2)吸取OPA 20 L， (3)吸取樣品20 L，(4)混和20次(時(shí)間60 s)，(5)進(jìn)

6、樣40 L。樣品采用下述梯度洗脫程序快速洗脫：07 min,100% A液；79 min，100% B液；910 min，100% A液。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)455 nm處檢測(cè)樣品中Glu與Asp的含量并以外標(biāo)法定量。結(jié)果(一)微透析探頭的體外回收率：以1.0 L/min速度灌流微透析探頭，隨著氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液濃度的增高，探頭回收率逐漸降低，在0.0110.00 mmol/L的溶液中，回收率可達(dá)30.0%(Glu)和33.4%(Asp)。(二)HPLC色譜：用本研究的HPLC法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混和液中Glu與Asp的含量，得到的色譜如1所示。(三)線性范圍與最小檢測(cè)濃度：用H

7、PLC法測(cè)定氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液，以測(cè)得的Glu與Asp峰面積為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，兩種物質(zhì)的線性范圍在0.0110.00 mmol/L之間，相關(guān)系數(shù)分別為Glur=0.996,Aspr=0.995,最小檢測(cè)濃度達(dá)0.001 mmol/L。Fig 1 Chromatograms of an amino acid standard mixture1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液色譜(四)精密度與重復(fù)性：動(dòng)物重復(fù)缺氧腦勻漿透析樣品，平行管測(cè)定其中Glu與Asp的日內(nèi)與日間變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)及樣品中兩種氨基酸含量，并按峰面積統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表1。(五)回收率

8、試驗(yàn)：本底(blank)：1 mL重復(fù)缺氧動(dòng)物腦勻漿液+1 mL超純水，混勻；標(biāo)準(zhǔn)(Std)：以1 mL 1.00 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液代替blank中腦勻漿液；標(biāo)準(zhǔn)加入(add)：以1 mL 1.00 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液代替blank中超純水，以上3種混合液均經(jīng)微透析處理，收集到的透析液分別進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果按下式計(jì)算：詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1所示。表1精密度、重復(fù)性與回收率Tab 1 Accuracy, repetition and recovery rateAminoacidIn the daytimeIn the daysRecovery rate±sCV(%)&

9、#177;sCV(%)(%)CluAsp±s;： mean of peak area (n=10). 討論國(guó)內(nèi)外對(duì)缺血缺氧期間小鼠腦內(nèi)Glu與Asp的測(cè)定多半采用腦勻漿液有機(jī)沉淀去蛋白、離心、過(guò)濾前處理后，再進(jìn)行化學(xué)測(cè)定3，其樣品的化學(xué)前處理不僅復(fù)雜而且樣品損失大。近幾年來(lái)，國(guó)外報(bào)道應(yīng)用一種新的生物化學(xué)樣品收集技術(shù)研究動(dòng)物腦缺血缺氧期間腦內(nèi)興奮性氨基酸的改變4，我們也已建立了家兔腦內(nèi)腺苷的微透析測(cè)定方法，并應(yīng)用于腦缺血研究中5，但目前這一技術(shù)多用于動(dòng)物的在體實(shí)驗(yàn)中，而用于缺氧小鼠體外研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究室開(kāi)展的小鼠自身密閉重復(fù)缺氧耐受實(shí)驗(yàn)中，由于采用的動(dòng)物模型個(gè)體太小，實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)

10、物劇烈翻滾，因此在體微透析技術(shù)無(wú)法直接應(yīng)用于檢測(cè)小鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸含量的改變，本研究將腦內(nèi)微透析技術(shù)加以擴(kuò)展，應(yīng)用于急性重復(fù)缺氧小鼠腦勻漿樣品處理中，在對(duì)樣品不進(jìn)行任何化學(xué)前處理的情況下，直接對(duì)樣品進(jìn)行體外的微量透析，收集的透析液，直接用本文的HPLC法進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果表明，在本HPLC色譜條件下，樣品中的Glu與Asp能很好地分離，峰形對(duì)稱(chēng)性好，保留時(shí)間恒定，檢出時(shí)間僅需7 min，雜質(zhì)峰可在檢測(cè)峰后38 min內(nèi)全部洗脫掉，其方法簡(jiǎn)單易行，并具較好的重現(xiàn)性與較高回收率，測(cè)得數(shù)據(jù)與我們用常規(guī)方法測(cè)定的結(jié)果基本一致。與其他HPLC方法相比，特別適合于Glu與Asp的快速檢測(cè)分離。此外，本研

11、究所獲得的微透析探頭對(duì)標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的體外回收率顯著高于國(guó)外類(lèi)似實(shí)驗(yàn)結(jié)果4。綜上所述，本方法較適合應(yīng)用于不易直接采用在體微透析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)及小型動(dòng)物中，對(duì)不具備大型冷凍超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室，也提供了一個(gè)新的樣品處理方法。* 國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No. 39670271)作者單位：首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系(北京100054)參考文獻(xiàn)1Rothman SM, Olney JW. Glutamate and the pathophysiology of hypoxic-ischemic brain damage. Ann Neurol, 1986,19(2):105.2肖衛(wèi)兵.缺血性腦損傷和谷氨酸.生理科學(xué)進(jìn)展，1994，25(4)：323.3朱劍琴，李春寶，王新昌.腦內(nèi)游離氨基酸的微量測(cè)定.生物化學(xué)學(xué)報(bào)，1981，5(1)：61.4Globus MY, Busto R, Dietrich WD, et al. Effect of ischemia on the in vivo release of striatal dopamine, glutamate, and -aminobutyric acid studied by intracerebral microdialysis. J Neurochem, 1988,51(5):