乙型肝炎病毒基因型檢測(cè)及其與肝功能的關(guān)系

1、乙型肝炎病毒基因型檢測(cè)及其與肝功能的關(guān)系 11-01-07 10:15:00 編輯：studa20 作者：朱鳳群，霍康，李春姬，狄鵬超【摘要】 目的 探討乙型肝炎病毒基因型與肝功能的關(guān)系。方法 采用微板核酸分子雜交ELISA法檢測(cè)93例不同臨床類型的乙型肝炎患者的基因型并同時(shí)測(cè)定肝功能。結(jié)果 93例不同臨床類型乙型病毒性肝炎患者中，B型24例(25.81%)，C型59例(63.44%)，D型5例(5.38%)，混合型5例(B/D 3例，C/D 2例，占5.38%)。93例不同臨床類型的乙型肝炎患者中，以C基因型為主，其次為B基因型，部分以D型和混合型存在，無(wú)A、E、F型。按照慢性乙型肝炎、亞急

2、性重型肝炎、肝硬化的順序，C基因型的檢出率逐漸增多，B基因型的檢出率逐漸減少。肝癌患者C基因型的檢出率沒(méi)有依次增高。C基因型各型乙型肝炎患者的ALT、AST、TBIL均高于B型，ALB低于B型，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 西安地區(qū)病毒性肝炎以C基因型為主，部分以B、D及混合型存在，未發(fā)現(xiàn)A、E、F型。除肝癌外，C型的檢出率隨臨床類型的加重而增多。 【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；基因型；微板核酸分子雜交；肝功能ABSTRACT: Objective To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV) genotype and

3、liver function. Methods The method of microboard nucleate molecular hybridization was employed to detect the genotype in 93 HBV patients of different clinical types and the function of liver. Results Among the 93 HBV patients of different clinical types, there were 24 cases of genotype B (25.81%), 5

4、9 cases of genotype C (63.44%), 5 cases of genotype D (5.38%), and 5 cases of mixed type (3 cases of B/D, 2 cases of C/D, 5.38%). Therefore, genotype C took up the largest proportion, followed by genotype B, and then D and mixed genotypes, but there was no genotype A, E or F. The detection rate of g

5、enotype C increased according to the sequence of chronic hepatitis B, subacute severe hepatitis and hepatocirrhosis while the detection rate of genotype B decreased gradually. However, the detection rate of genotype C in hepatocellar carcinoma did not rise correspondingly. The levels of ALT, AST and

6、 TBIL of genotype C were higher than those of genotype B, but the level of ALB in genotype C was lower than that of genotype B. None of the differences had significance. Conclusion Most of HBV genotypes in Xian were C, some of them were B, D and mixed genotypes, but no genotype A, E or F was detecte

7、d. Except hepatocellar carcinoma, the detection rate of genotype C rose according to the severity of clinical type.KEY WORDS: hepatitis B virus; genotype; microboard nucleate molecular hybridization; function of liver乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的臨床過(guò)程多種多樣,除了與宿主的免疫狀況、感染方式等有關(guān),與感染病毒株的基因型種類也關(guān)系密切。不同基

8、因型的HBV代表著在生物學(xué)特性方面的差異，HBV基因分型有助于對(duì)病情、治療及預(yù)后的評(píng)價(jià)。目前各地區(qū)的檢測(cè)方法不同，研究的結(jié)論不盡相同。我們采用微板核酸雜交ELISA技術(shù)進(jìn)行基因分型，并同時(shí)測(cè)定肝功能，評(píng)價(jià)其對(duì)肝功能的影響。1 材料與方法1.1 臨床資料93例患者均來(lái)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染科2005年6月2005年11月住院患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年修訂的病毒性肝炎防治方案，所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒混和感染及其他原因引起的肝炎，既往未曾進(jìn)行抗病毒治療。其中亞急性重型肝炎4例，慢性乙型肝炎中度25例，重度24例，乙肝肝硬化28例，肝癌12例，男70例，女23例，年齡1

9、968歲，平均年齡42.40歲。所有血液標(biāo)本均新鮮分離血清，-25保存，待整批檢測(cè)。1.2 試劑和儀器 HBV基因分型PCR微板核酸分子雜交ELISA試劑盒由第一軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物醫(yī)學(xué)診斷研究中心提供。DG3022A型酶標(biāo)儀為國(guó)營(yíng)華東電子管廠生產(chǎn)。9700型基因擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司生產(chǎn)。1.3 檢測(cè)方法1.3.1 采用微板核酸雜交ELISA技術(shù)進(jìn)行基因分型 引物及探針：根據(jù)HBV 6個(gè)基因型的特異基因序列，選擇前C區(qū)的不同序列作為PCR引物和核酸雜交探針，6個(gè)基因型通用的序列作為PCR的引物和通用包被探針，而同一部位的不同序列作為各型的顯色探針，并采用Primer軟件設(shè)計(jì)引物和探針。顯色探針5

10、標(biāo)記Biotin由上海生物工程有限公司合成。序列為：引物W1：CCCTTCTTCGTCTCGCGGTTCC(nt 14901510)；引物W2：ACCAATTTATGCCTACAGCCTC(nt 17981777)。 11-01-07 10:15:00 編輯：studa20 HBVDNA的提取及擴(kuò)增：取處理液100L于0.5mL離心管內(nèi)，加待測(cè)血清100L，混勻，100煮沸15min，12000r/min離心5min，取上清液作為擴(kuò)增模板。取上清液12L于反應(yīng)液管內(nèi)，彈勻，10000r/min離心10s，上機(jī)循環(huán)，預(yù)變性94 2min，循環(huán)條件：94 50s、55 50s、72 65s，共循環(huán)

11、38次，最后72延伸3min。 微板雜交及酶聯(lián)顯色：將擴(kuò)增產(chǎn)物98變性10min，迅速冰浴10min。各取雜交液90L，各型顯色探針25L，已變性產(chǎn)物20L，分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，輕輕混勻，50水浴60min。輕輕棄去上清液后加入200L雜交洗液，50洗滌35min，共3次。每孔中加入100L酶抗體，37孵育30min后，輕輕棄去上清液，加入200L酶洗液，置37 35min，再重復(fù)洗2次。每孔加顯色劑A、B各1滴，避光，置37 10min后加入終止液1滴，在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A值。 結(jié)果判斷：P/N3.0為HBVDNA陽(yáng)性，P/N3.0為陰性(陰性對(duì)照A值小于0.05，按0.05計(jì)算：P/N比

12、值=標(biāo)本A值/陰性對(duì)照A值)。 1.3.2 肝功能的檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)白蛋白、球蛋白、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)等。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 不同臨床類型乙肝患者HBV基因型分布特點(diǎn)結(jié)果見(jiàn)表1。93例不同臨床類型乙型病毒性肝炎患者中，B型24例(25.81%)，C型59例(63.44%)，D型5例(5.38%)，混合型5例(B/D 3例，C/D 2例，占5.38%)。結(jié)果顯示，93例乙型肝炎

13、病毒患者以C型為主，其次為B型，部分以D型和混合型存在，無(wú)A、E、F型。表1 不同臨床類型乙肝患者HBV基因型分布的特點(diǎn)（略）2.2 不同臨床類型乙肝患者HBV基因型與肝功能的關(guān)系C型乙肝患者的ALT、AST、TBIL、TP均高于B型,而ALB低于B型,但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)，D型共5例，混合型共5例，因例數(shù)較少未統(tǒng)計(jì)在內(nèi)。表2 不同臨床類型乙肝患者HBV基因型與肝功能的關(guān)系（略）3 討 論 研究表明，HBV的基因型是決定慢性HBV感染者臨床預(yù)后的一個(gè)重要因素。我國(guó)HBV基因分型以B、C型最常見(jiàn)，其中北方以B型多見(jiàn)，南方以C型為主，但各地HBV流行的優(yōu)勢(shì)基因型也不盡相同。有些省的優(yōu)勢(shì)基因型

14、為B型23，夏國(guó)良等4對(duì)我國(guó)8個(gè)城市乙肝患者用測(cè)序法進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春、蘭州、寧夏、陜西等地的優(yōu)勢(shì)基因型主要為C型。我們采用PCR微板核酸雜交ELISA技術(shù)對(duì)西安地區(qū)93例不同臨床類型的乙肝患者進(jìn)行了HBV基因分型，發(fā)現(xiàn)以C型為主(63.44%)，部分為B型(25.81%)，亦有D型(5%)和混合型(5%)，未發(fā)現(xiàn)A、E和F型。 HBV基因型不同與感染HBV后的臨床類型密切相關(guān)。DING等5的研究認(rèn)為，按照慢性攜帶者(ASC)慢性肝炎(CH)肝纖維化(LC)肝癌(HCC)的順序。C型逐漸增多，而B(niǎo)型逐漸減少。KAO等6對(duì)臺(tái)灣HBV基因型分析也支持上述觀點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，按照亞急性重型肝炎

15、、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化的順序，C基因型的檢出率逐漸增多，B型的檢出率逐漸減少，而肝癌患者的C型檢出率沒(méi)有依次增高。這與以上研究結(jié)果略不同，可能與肝癌樣本量較少有關(guān)。觀察B、C基因型的乙肝患者與肝功能的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)C型乙肝患者的ALT、AST、TBIL、TP均高于B型,而ALB低于B型,但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALT及AST較高，提示肝臟炎癥活動(dòng)程度較高，與較嚴(yán)重的肝病有關(guān)。ALB低提示肝臟的合成ALB的功能低下。與基因型相比,基因型的肝功能異常更為常見(jiàn)。 陳公英等7分析了浙江省乙型肝炎病毒B、C基因型感染者臨床和肝組織病理情況，表明基因型引起的臨床表現(xiàn)及組織學(xué)損傷更嚴(yán)重，其結(jié)果和本研究的結(jié)果一致

16、。本研究根據(jù)不同基因型乙肝的預(yù)后判斷及采取不同的治療辦法可能對(duì)臨床具有一定的指導(dǎo)意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1ARAUZRUIZ P, NORDER H, ROBERTSON BH, et al. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America J. J Gen Virol, 2002, 83(8):20592073.2鄒祺，張善鋒，毛紅麗. 河南省2型肝炎病毒基因型的分布 J. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006, 41(5):941942.3劉映霞，胡國(guó)令，譚德明. 湖南省乙肝病毒基因型分布及臨床意義 J. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 27(1):2931.4夏國(guó)良，賈志遠(yuǎn)，劉洪斌，等. 乙肝病毒基因型和血清亞型在我國(guó)部分地區(qū)的分布及其特點(diǎn) J. 中華流行病學(xué)雜志, 2001, 22(5):348351.5DING X, MIZOKAMI M, YAO G, et al. Hepatitis B virus genotype distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai J. China Inter