CD25分子胞外段基因免疫應答中B淋巴細胞的變化及意義

1、    CD25分子胞外段基因免疫應答中B淋巴細胞的變化及意義作者：徐林1，張鳳2，周涯3，羅軍敏1，覃明1，姚新生1 作者單位：(1. 貴州省遵義醫(yī)學院免疫學教研室，貴州遵義563000;2. 復旦大學上海醫(yī)學院免疫學系，上海200032;3. 貴州省遵義醫(yī)學院醫(yī)學物理學教研室，貴州遵義563000)【摘要】 目的用鼠CD25分子胞外段基因疫苗免疫Balb/c小鼠，觀察其誘導的體液免疫應答中B淋巴細胞的變化并探討其意義。方法用pcDNA3.1-CD25胞外段真核表達質粒分別在第0天、第10天和第20天肌肉注射免疫同系Balb/c小鼠，酶聯(lián)免疫法(ELI

2、SA)檢測抗CD25胞外段的抗體水平及亞型，F(xiàn)ACS檢測脾細胞中B淋巴細胞的比例變化及細胞因子IL-4、IL-10和IFN-的表達變化。結果與對照組相比，CD25胞外段基因免疫組小鼠血清抗CD25抗體在免疫后逐漸升高，第30天達最高峰;抗CD25抗體主要以IgG1為主;免疫小鼠脾細胞中B細胞的比例變化不顯著(P>0.05)，但高分泌IL-4和IL-10(P<0.05)，而低分泌IFN-(P<0.05)。結論CD25胞外段蛋白基因免疫中B細胞功能變化顯著，這為后續(xù)深入研究體液免疫應答在T細胞疫苗中的作用提供了前期實驗基礎?！娟P鍵詞】 CD25分子胞外段;基因免疫;B淋巴細胞;T

3、細胞疫苗ABSTRACT: ObjectiveTo evaluate the change of B lymphocytes in humoral immune response induced by DNA vaccine encoding mouse CD25 extracellular domain (CD25e).MethodsBalb/c female mice were inoculated by intramuscular injection of pcDNA3.1-CD25e on day 0, day 10 and day 20, respectively. The tite

4、rs of antibody to CD25e, as well as the class and subclass of antibody, were assayed with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The percentage of B cells in splenocytes and IL-4, IL-10 andIFN- production of B cells were analyzed by FACS.ResultsCompared with that in control group, the t

5、iter of antibody specific to CD25e steadily increased and reached the peak on day 30. The antibody specific to CD25e mainly comprised IgG1. The percentage of B cells in splenocytes did not change significantly (P>0.05). IL-4 and IL-10 production of B cells in splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immun

6、ized mice was higher than that in control group (P<0.05). By contrast, IFN-production of B cells decreased significantly (P<0.05).ConclusionCD25e DNA vaccine effectively induces the change in B cell function and provides foundation for further research on the role of humoral immune response in

7、 T cell vaccine.KEY WORDS: CD25 extracellular domain; DNA vaccination; B lymphocyte; T cell vaccineT細胞疫苗(T cell vaccine, TCV)作為一種治療自身免疫病、病毒性疾病、器官移植排斥反應等的重要手段，目前在臨床上得到大量的應用1-3。已有的研究發(fā)現(xiàn)，調節(jié)性T細胞和工作型抗原(ergotope)在TCV作用機制中發(fā)揮了重要作用4-8。然而，在TCV的免疫調節(jié)效應中，其誘導體液免疫應答的相關國內外研究仍較少9。HERKEL等10發(fā)現(xiàn)TCV在Lewis大鼠體內可以誘導針對T細胞的IgG

8、抗體。該抗體可以有效抑制T細胞的增殖。陳永良等11進一步報道TCV誘導的抗體可以與T細胞膜上多種成分結合。我們在新近的研究中利用小鼠CD25分子胞外段(extracellular domain)的基因免疫成功誘導了針對自體CD25胞外段的抗體，并有效抑制了后續(xù)自身免疫性肝損傷的發(fā)生12。這些研究均提示在TCV誘導的免疫調節(jié)效應中，體液免疫反應也發(fā)揮了重要作用。因此，本研究中我們進一步觀察CD25分子胞外段基因免疫后體液免疫應答中B細胞的比例和功能的變化情況，為后續(xù)深入研究體液免疫反應在TCV中的作用及其機制和后續(xù)臨床推廣應用提供基礎。1材料與方法1.1材料pcDNA3.1-CD25胞外段質粒和

9、DH5為本實驗室保存;CD25胞外段蛋白由本室原核表達并純化;質粒純化試劑盒購自TaKaRa公司;HRP標記兔抗鼠IgG抗體購自上海未爾生物技術公司;HRP標記兔抗鼠IgA抗體、HRP標記兔抗鼠IgG1抗體和HRP標記兔抗鼠IgG2a抗體均購自上海未爾生物技術公司;PE標記的抗小鼠CD19抗體購自eBioscience公司;FITC標記的抗小鼠IL-4、IL-10和IFN-抗體購自eBioscience公司;細胞固定和穿膜試劑購自eBioscience公司;其他試劑均為分析純級。1.2實驗動物Balb/c小鼠，H-2d、46周齡、雌性，由重慶醫(yī)科大學實驗動物科學部提供，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境。1.

10、3pcDNA3.1-CD25胞外段疫苗肌注免疫小鼠將6周齡Balb/c小鼠分為PBS對照組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-CD25胞外段組，每組12只，均肌注免疫。每次質粒DNA劑量100g，注射體積100L，于0、10、20d免疫3次。免疫前收集小鼠血清，-70凍存。1.4ELISA法檢測血清IgA和IgG及其亞型以前期原核表達純化的10mg/L CD25胞外段蛋白包板，4過夜;以50g/L脫脂奶粉+PBS封閉，37孵育1h，用PBS洗滌3遍;加入100L 110稀釋血清，37 1h，洗3遍;加入100L 11000稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗小鼠IgA、HRP-羊抗小

11、鼠IgG1或HRP-羊抗小鼠IgG2，37 1h，洗5遍;加入100L OPD底物，避光顯色7min，加50L 1mol/L H2SO4終止顯色，測A450值。1.5流式細胞技術檢測B淋巴細胞的比例末次基因免疫后7d，常規(guī)處死實驗小鼠并收集脾細胞，PBS洗滌后以2×106細胞濃度重懸，取100L細胞懸液，加入PE標記的抗鼠CD19抗體，4共育30min，用PBS洗去游離的抗體重懸后用流式細胞儀檢測B淋巴細胞的比例變化。同時，加做抗體的同型對照。1.6流式細胞技術檢測B淋巴細胞的細胞因子末次基因免疫后7d，常規(guī)處死實驗小鼠并收集脾細胞，PBS洗滌后以2×106細胞濃度重懸，取

12、100L細胞懸液，加入PE標記的抗鼠CD19抗體，4共育30min，用PBS洗去游離的抗體重懸，經固定、穿膜和洗滌后，分別加入FITC標記的抗鼠IL-4抗體、IL-10抗體或IFN-抗體，4共育30min，PBS洗滌后用流式細胞儀檢測B淋巴細胞的細胞因子表達情況。未與抗體作用的淋巴細胞作為空白對照。1.7統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結果2.1CD25胞外段基因免疫小鼠血清抗體水平的變化用pcDNA3.1-CD25胞外段(記為pcDNA3.1-CD25)質粒基因免疫Balb/c小鼠，免疫后間隔10d常規(guī)眼

13、球采血，檢測血清中抗CD25胞外段抗體的水平。結果顯示，與對照組相比，CD25胞外段基因免疫組小鼠血清抗體水平顯著增加(P<0.05)，免疫30d后達到最高峰(P<0.05)，隨著時間的延長，抗體水平逐漸降低，免疫后80d，仍可以檢測到抗CD25胞外段的抗體(圖1)。圖1pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠血清中總Ig的水平Fig.1 The curve of serum antibody specific to CD25e in pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS注射對照組;pcDNA3.1：pcDNA3.1空載體注射組;pcDNA3

14、.1-CD25：pcDNA3.1-CD25e注射組;與對照組相比，*P<0.05。2.2CD25胞外段基因免疫小鼠血清抗體的類型在此基礎上，進一步檢測基因免疫30d后小鼠血清抗體的類別。pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠血清中抗CD25胞外段的抗體以IgG為主(P<0.05)，并且主要是IgG1亞類(P<0.05，圖2)。這提示pcDNA3.1-CD25胞外段基因主要誘發(fā)的是以Th2型為主的體液免疫應答。2.3CD25胞外段基因免疫小鼠脾細胞中B細胞的比例與pcDNA3.1對照組相比，pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠脾細胞中B細胞的比例變化不顯著，分別為

15、(35.71±2.89)%和(31.83±3.68)%(P>0.05，圖3)。圖2pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠血清中IgG和IgA的水平(A)和IgG亞類的水平(B)Fig.2 The serum level of IgG and IgA (A) and subclass of IgG (B) in pcDNA3.1-CD25e immunized miceA：IgG與IgA濃度的比較，*P<0.05;B：IgG1與IgG2a濃度的比較，*P<0.05。圖3CD25胞外段基因免疫小鼠脾細胞中B淋巴細胞的比例Fig.3 The percent

16、age of CD19+ B cells in splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS注射對照組;pcDNA3.1：pcDNA3.1空載體注射組;pcDNA3.1-CD25e：pcDNA3.1-CD25e注射組。2.4CD25胞外段基因免疫小鼠脾細胞中B細胞的細胞因子分泌進一步檢測了基因免疫后小鼠脾細胞中B細胞的細胞因子IL-4、IL-10和IFN-的表達情況。pcDNA3.1對照組中B細胞分泌細胞因子IL-4和IL-10的比例分別為(0.72±0.11)%和(3.67±0.45)%，而pcDNA3.1-C

17、D25胞外段基因免疫小鼠脾細胞中B細胞高分泌IL-4和IL-10，分別為(2.44±0.13)%和(5.37±1.35)%(P<0.05，圖4)。相反，pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠B細胞低表達IFN-，顯著低于pcDNA3.1免疫對照組，分別為(1.96±0.21)%和(3.57±0.49)%(P<0.05)。這進一步提示，CD25胞外段基因免疫主要誘導的是以Th2型體液免疫應答為主。3討論近年來，隨著TCV國內外相關研究的不斷深入，TCV已發(fā)展成為一種治療自身免疫病、病毒感染、移植排斥等臨床疾病的重要手段13。在TCV誘導的

18、免疫調節(jié)作用機制探討中，當前的研究主要圍繞其誘發(fā)的細胞免疫反應而展開14。已有的研究發(fā)現(xiàn)，抗獨特型T細胞和抗工作型T細胞這兩個特殊亞群的T細胞在TCV誘發(fā)的免疫應答中發(fā)揮了重要作用。近年來，特別是工作型抗原如CD25、HSP60分子等的發(fā)現(xiàn)，使得人們對TCV誘導的免疫應答機制及機體免疫調節(jié)機制有了更深入的認識和理解4,8。CD25分子作為自體抗原性分子，研究者們發(fā)現(xiàn)其可以有效誘發(fā)自體免疫應答。MOR等15發(fā)現(xiàn)CD25分子可以作為T細胞識別的靶分子，參與了TCV中T細胞與T細胞之間的調節(jié)過程。MIMRAN等7進一步用大鼠的CD25基因免疫同系大鼠，結果發(fā)現(xiàn)可以有效抑制后續(xù)類風濕關節(jié)炎的誘導，并認

19、為其機制與CD25分子作為工作型抗原激活抗工作型T細胞有關。圖4pcDNA3.1-CD25胞外段基因免疫小鼠脾細胞中B淋巴細胞的細胞因子分泌Fig.4 Production of IL-4, IL-10 and IFN- in B cells of splenocytes from pcDNA3.1-CD25e immunized micePBS：PBS注射對照組;pcDNA3.1：pcDNA3.1空載體注射組;pcDNA3.1-CD25：pcDNA3.1-CD25e注射組。然而，CD25分子這一類工作型抗原誘發(fā)機體免疫應答的具體機制仍不明。我們新近的研究表明，利用小鼠CD25分子胞外段成分的

20、基因免疫可以成功在同系小鼠體內誘發(fā)特異性抗體，并且能有效抑制后續(xù)自身免疫性肝損傷的誘導，減輕肝組織損傷12。這些研究提示我們，在T細胞疫苗誘發(fā)的免疫調節(jié)效應中，除抗工作型T細胞參與免疫調節(jié)以外，針對工作型抗原的體液免疫反應也在免疫抑制效應中發(fā)揮了重要作用。在本研究中我們的結果進一步顯示，CD25分子胞外段基因免疫誘發(fā)的特異性抗體以IgG為主，并主要為IgG1。這與我們前期的研究結果一致。在基因免疫30d后，抗體水平達峰值，以后逐漸降低。陳永良等11報道TCV誘導的體液免疫應答中，針對TCV的抗體主要以IgG為主。這與我們的結果是一致的。并且，我們還發(fā)現(xiàn)基因免疫小鼠脾細胞中B細胞的比例變化不明顯

21、，其分泌的細胞因子主要是以IL-4、IL-10為主，而分泌IFN-較少。提示CD25胞外段基因免疫主要誘導Th2型體液免疫應答為主。這與抗體亞類分析的結果是一致的?？傊ㄟ^本研究，我們發(fā)現(xiàn)CD25胞外段基因免疫可以有效誘導B淋巴細胞高分泌IgG1為主的抗體和IL-4、IL-10，表現(xiàn)為以Th2型為主的體液免疫應答。這為后續(xù)深入研究工作型抗原CD25分子誘導體液免疫應答的機制及其參與TCV誘導免疫調節(jié)中的作用提供了前期實驗結果。【參考文獻】1HELLINGS N, STINISSEN P. Tovaxin, radiation-attenuated, patient-specific T-ce

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