祛痰散瘀軟堅(jiān)中藥對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)及HYP含量的影響(1)

1、祛痰散瘀軟堅(jiān)中藥對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)及HYP含量的影響(1)】 目的觀察祛痰散瘀軟堅(jiān)中藥對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)及HYP（羥脯氨酸）含量的影響。方法大鼠氣管內(nèi)注入博萊霉素建立肺纖維化模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組和強(qiáng)的松組。造模次日每天按劑量給藥，分別在第7、28天分批次處死動(dòng)物，制作病理標(biāo)本，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化及計(jì)算肺組織HYP含量。結(jié)果模型組7d時(shí)肺泡腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞，I型細(xì)胞受損，II型細(xì)胞明顯增生；28d時(shí)肺泡炎減輕，肺間質(zhì)和胸膜層膠原纖維明顯增多。各治療組7d時(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組少，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，

2、28d時(shí)肺泡間隔增厚及間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖較模型組減輕，電鏡下觀察亦如此。28d時(shí)各治療組的肺組織HYP含量均低于模型組（P0.01或P0.05）。結(jié)論除痰散瘀軟堅(jiān)中藥能有效抑制博萊霉素引起的肺纖維化形成。 【關(guān)鍵詞】 肺纖維化 羥脯氨酸 祛痰 散瘀 軟堅(jiān)肺纖維化是一種以兩肺間質(zhì)纖維化伴蜂窩狀改變?yōu)樘卣鞯募膊?。近年?lái)中藥防治肺纖維化的研究成為肺科學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)，以期尋找更安全、有效的藥物治療本病。本研究采用博萊霉素A5(BLMA5)建立大鼠肺纖維化模型，觀察祛痰、散瘀軟堅(jiān)中藥對(duì)肺纖維化大鼠病理形態(tài)學(xué)和肺組織羥脯氨酸(HYP)含量的影響，探討其對(duì)肺纖維化的治療作用。1 材料與方法1.1 動(dòng)物、藥

3、品及主試劑 SD大鼠80只，體重，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。批號(hào)：ScxK（滬）20040003。復(fù)方中藥由蘇木12g，皂角刺9g，鬼見(jiàn)羽15g等組成，按比例常規(guī)水煎，60%醇沉后濃縮為含生藥1.82g/ml。所用中藥購(gòu)于浙江省中醫(yī)院中藥房，由中藥制劑室制備。博萊霉素A5由天津太和制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 040310。強(qiáng)的松（潑尼松）片劑由浙江仙居制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)040406。對(duì)二氨基苯甲酸由天津化學(xué)試劑研究所提供，批號(hào)020801。 L羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)廠提供，批號(hào)011207。1.2 動(dòng)物造模 80只健康SD大鼠，隨機(jī)選取16只為正常對(duì)照組（組），余64只為模型

4、動(dòng)物，參照文獻(xiàn)方法2將所有大鼠用硫噴妥鈉（劑量為3mg/100g體重）腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露喉頭，額鏡直視下趁動(dòng)物吸氣瞬間，將與注射器相連的7號(hào)鈍頭腰穿針插入氣管內(nèi)，模型動(dòng)物注入BLMA5（劑量為2ml/kg體重），并注入0.2ml空氣，完畢后迅速將動(dòng)物直立、順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，動(dòng)物清醒后隨意進(jìn)食。1.3 分組與給藥 造模結(jié)束后，隨機(jī)將64只模型動(dòng)物分為模型組、中藥高劑量組（組）、中藥低劑量組、強(qiáng)的松組，每組各16只。正常對(duì)照組與模型組每天灌服無(wú)菌生理鹽水1ml/100g體重，1日2次；強(qiáng)的松組每天給予強(qiáng)的松0.6mg/100g體重灌胃（使用時(shí)將強(qiáng)的松片劑碾碎，加2ml無(wú)菌生理鹽水稀釋

5、），1日1次，頓服；中藥高劑量組每天給予中藥1.1ml/100g體重灌胃，1日2次；低劑量組每天給予中藥0.55ml/100g體重灌胃，灌胃時(shí)加適量生理鹽水，稀釋至與高劑量組相同的灌胃量，1日2次；以上均喂服28d。1.4 標(biāo)本采集 分別于第7、28天放血，分批處死動(dòng)物（每批每組8只）后，迅速開(kāi)胸，取出心肺，制作病理標(biāo)本和進(jìn)行生化檢查。分離出肺，夾閉右主支氣管，10%福爾馬林溶液經(jīng)左支氣管灌注固定30min后，投入10%福爾馬林溶液中固定24h，石蠟包埋，常規(guī)切片，分別行HE及Masson染色，觀察肺泡炎及肺纖維化程序。迅速?gòu)挠曳吻?mm1mm1mm組織兩塊，以冷卻2.5%戊二醛進(jìn)行固定8h后

6、，PBS（PH7.4、0.2mol/L磷酸緩沖液）沖洗，釕紅水固定24h，常規(guī)切片，進(jìn)行電鏡觀察。1.5 形態(tài)學(xué)分級(jí) 根據(jù)Szapiel3等方法確定肺泡炎及肺纖維化的程度。利用HE染色的病理切片將肺泡炎分為4級(jí)：0級(jí)：無(wú)肺泡炎（）；1級(jí)：輕度肺泡炎（ ），肺泡膈因細(xì)胞浸潤(rùn)增寬，病變范圍局限在全肺的20%以下；2級(jí)：中度肺泡炎（ ），病變范圍占全肺的20%50%；3級(jí)：重度肺泡炎（ ），呈彌漫性分布，病變范圍大于50%。利用Masson染色的切片將肺間質(zhì)纖維化分為4級(jí)：0級(jí)：無(wú)間質(zhì)纖維化（）；1級(jí)：輕度間質(zhì)纖維化（ ），病變范圍局限在全肺的20%以下；2級(jí)；中度肺間質(zhì)纖維化（ ），病變范圍占全肺

7、的20%50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂；3級(jí)：重度肺間質(zhì)纖維化（ ），病變范圍大于50%，肺泡融合，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。1.6 HYP含量測(cè)定 余右肺，稱重后剪碎，每克肺組織加無(wú)菌生理鹽水4ml研磨，以3000r/min離心10min，過(guò)濾，得上清液，采用酸水解法測(cè)定41.7 統(tǒng)計(jì)方法 計(jì)量資料以xs表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方分析。2 結(jié)果2.1 肺組織形態(tài)學(xué)改變2.1.1 肺組織整體外觀觀察 正常對(duì)照組肺外觀無(wú)明顯異常，呈粉紅色，表面光滑；模型組7d時(shí)，雙肺有散在灶狀出血點(diǎn)，28d時(shí)部分肺葉呈暗紅色，部分肺葉呈灰白色，有大小不等的白色小結(jié)節(jié)，部分體

8、積縮小，硬度增加。中藥高劑量組第7d時(shí)，肉眼觀察肺表面出血點(diǎn)較模型組明顯少，28d時(shí)肉眼觀察肺臟表面較模型組光滑，瘢痕及陳舊出血點(diǎn)明顯減少；低劑量組和強(qiáng)的松組7d時(shí)，肺臟外觀與中藥高劑量組相近，但28d時(shí)，部分肺葉呈暗紅色，有少量大小不等的白色小結(jié)節(jié)。2.1.2 肺組織切片光鏡觀察 正常對(duì)照組肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無(wú)分泌物，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔無(wú)無(wú)增寬，無(wú)肺萎陷及血管壁增厚；模型組7d時(shí)可見(jiàn)肺泡腔內(nèi)滲出物增多，肺泡腔及肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?？梢?jiàn)少量成纖維細(xì)胞，局部肺萎陷；28d時(shí)，肺泡炎減輕，肺泡壁顯著增厚，一部分肺泡腔消失，由膠原纖維、成纖維細(xì)胞占據(jù)，肺間質(zhì)和胸膜層膠原纖維顯著增多

9、；中藥高劑量組7d時(shí)肺間質(zhì)炎性細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組少，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，28d時(shí)肺泡間隔增厚及間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖較模型組減輕，低劑量組和強(qiáng)的松組7d時(shí)肺臟組織學(xué)病理與高劑量組相近，28 d時(shí)肺泡間隔增厚及間質(zhì)內(nèi)成纖維增殖亦較模型組減輕，各治療組間無(wú)明顯差別。各組大鼠肺泡炎和肺纖維化分級(jí)，經(jīng)卡方分析可得同一時(shí)間段的不同組別肺泡炎和肺纖維化程度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2.1.3 肺組織切片電鏡觀察 正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常，肺泡腔開(kāi)放，肺泡壁由型上皮細(xì)胞襯復(fù)，其間可見(jiàn)少量型肺泡上皮，兩型上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。模型組7d時(shí)可見(jiàn)型細(xì)胞受損，上皮基底膜水腫、裸露，甚至斷裂；

10、型上皮細(xì)胞明顯增生腫脹，核增多，胞質(zhì)內(nèi)含大量板層小體，并含有豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；28d時(shí)型細(xì)胞數(shù)目較前減少，僅輕度增生，但血管腔與上皮細(xì)胞間基膜明顯增厚、疏松，間質(zhì)中膠原纖維及彈力纖維增生明顯。各治療組7d時(shí)，病變均較模型組輕，28d時(shí)，雖血管基底膜厚薄不均，但間質(zhì)中膠原纖維的增生都較模型組少，各治療組間形態(tài)學(xué)變化無(wú)明顯差異。 營(yíng)生網(wǎng)-關(guān)注您的營(yíng)生【摘】 目的觀察祛痰散瘀軟堅(jiān)中藥對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)及HYP（羥脯氨酸）含量的影響。方法大鼠氣管內(nèi)注入博萊霉素建立肺纖維化模型。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑 . 本篇論文由網(wǎng)友投稿，3COME文檔只給大家提供一個(gè)交流平臺(tái)，

11、請(qǐng)大家參考，如有版權(quán)問(wèn)題請(qǐng)聯(lián)系我們盡快處理。（各組電鏡照片見(jiàn)下圖16）圖1 正常組肺組織6200（略）圖2 模型組7d12500（略）圖3 模型組28d12500（略）圖4 中藥高劑量組28d12500（略）圖5 中藥低劑量組28d12500（略）圖6 強(qiáng)的松組28d12500（略）2.2 肺組織HYP含量的變化 造模后7d，模型組和各治療組的羥脯氨酸含量與正常對(duì)照組相比無(wú)差異，各組羥脯氨酸含量比較無(wú)差異；造模28d，模型組羥脯氨酸含量明顯高于正常對(duì)照組（P0.01），中藥高劑量組和強(qiáng)的松組羥脯氨酸含量明顯低于模型組（P0.01），與正常對(duì)照組比較無(wú)差異；中藥低劑量組羥脯氨酸含量雖高于正常組但

12、仍低于模型組，各治療組間無(wú)明顯差異。各組含量見(jiàn)表1。表1 各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定（略）3 討論 本病為痰、瘀互結(jié)，氣血失調(diào)，正氣虛弱，五臟陰陽(yáng)失衡的重疑之病，呈痰濁、瘀血及氣與陰津相合致病，連鎖推進(jìn)的錯(cuò)綜交互、纏綿難愈的病理效應(yīng)，尤以瘀血痰濁、痰瘀交阻的內(nèi)傷實(shí)邪更為突出。所以臨診多以除痰行氣、散瘀軟堅(jiān)之品治療本病。本研究選取除痰散瘀軟堅(jiān)之蘇木、皂角刺、鬼見(jiàn)羽組成中藥復(fù)方，其中蘇木味甘、咸，性涼，有入血行血，辛咸消散，亦兼有軟堅(jiān)潤(rùn)下之功，能祛一切凝滯留結(jié)之血5；鬼箭羽，味苦，性辛寒，歸肝肺經(jīng)，有清熱解毒、活血祛瘀、軟堅(jiān)消癰的作用5；皂角刺，辛溫，歸肺、肝經(jīng)，有化痰、透膿、活血消腫的功效，

13、是搜痰藥，能祛聚于胸膈之上的膠固稠濁之痰5。三藥合用，共奏清熱祛痰、活血化瘀生新之效。 肺間質(zhì)纖維化病理過(guò)程可分為早期的肺泡炎階段和肺間質(zhì)纖維化的形成階段。肺纖維化以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、膠原形成并伴有炎癥和損傷所致組織結(jié)構(gòu)破壞為特征6。膠原蛋白的合成與沉積是肺纖維化的基礎(chǔ)，膠原的含量可反映肺纖維化的程度。羥脯氨酸（HYP）是膠原蛋白的重組成部分，是膠原特有的氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的含量可反映細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白的功能，因此作為肺纖維化的指標(biāo)，可以判斷肺纖維化的程度78對(duì)肺纖維化的進(jìn)展有重意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模7d后，模型組大鼠肺組織切片可見(jiàn)肺泡腔內(nèi)滲出物增多，肺泡腔及

14、肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?？梢?jiàn)少量成纖維細(xì)胞，局部肺萎陷，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞；到28d時(shí)，肺泡炎減輕，肺泡壁顯著增厚，一部分肺泡腔消失，由膠原纖維、成纖維細(xì)胞占據(jù)，肺間質(zhì)和胸膜層膠原纖維顯著增多，小血管壁增厚明顯；電鏡觀察亦如此，此病理改變符合肺纖維化的病理形態(tài)變化，而正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)正常無(wú)類似改變，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)復(fù)制肺纖維化模型是成功的，是符合實(shí)驗(yàn)求的。而中藥高劑量組、低劑量組7d時(shí)肺間質(zhì)炎性細(xì)胞滲出和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)均較模型組少，肺組織結(jié)構(gòu)較模型組完整，28d時(shí)肺泡間隔增厚及間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖亦較模型組減輕，和強(qiáng)的松組7d、28d時(shí)肺臟組織學(xué)病理改變相近。造模7d后，各組肺羥脯氨酸含量無(wú)明顯變

15、化，這也符合肺纖維化早期以肺泡炎為主的病理變化，而造模28d后，模型組肺羥脯氨酸含量顯著升高，高于正常對(duì)照組（P0.05），經(jīng)中藥或潑尼松治療后，肺羥脯氨酸含量明顯下降，與同期模型組比較有顯著差異，中醫(yī)治療組作用與強(qiáng)的松組相仿，各治療組間無(wú)顯著差異。表明此祛痰散瘀軟堅(jiān)中藥能有效改善肺纖維化大鼠肺組織病理，顯著降低肺組織中羥脯氨酸含量，有抗肺纖維化的作用，與西藥強(qiáng)的松相當(dāng)。這一實(shí)驗(yàn)將為祛痰散瘀軟堅(jiān)中藥的臨床推廣運(yùn)用和進(jìn)一步探索其對(duì)肺纖維化的防治作用和作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 陳灝珠.實(shí)用內(nèi)科學(xué)M.第12版.北京，人民衛(wèi)生出版社，2005：17301732.2 褚宏偉.纖維連接蛋白和

16、層粘連蛋白在大鼠肺間質(zhì)纖維化中的變化J.中華醫(yī)學(xué)雜志，1991，71（2）：87.3 Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD, et al. Bleomycininduced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouseJ. Am Rev Respir Dis,1979,120:893899.4 楊陟華J.大鼠肺羥脯氨酸的測(cè)定方法及應(yīng)用J.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,1995,19(1):4446.5 南京中醫(yī)藥大學(xué)編著.中藥大辭典M.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：23692371.6 孔琪.肺纖維化的發(fā)病機(jī)制及關(guān)鍵靶點(diǎn)J.國(guó)外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，2005，25（5）：331333.