實時熒光定量PCR檢測限統(tǒng)計推斷

1、實時熒光定量PCR檢測限統(tǒng)計推斷    作者：王文清，王昌富，袁琳，彭長華，常武    【摘要】  檢測限是檢測方法的重要性能指標(biāo)，用Poisson分布的概率函數(shù)分式計算一次抽樣檢測出現(xiàn)的結(jié)果推論總體出現(xiàn)該結(jié)果的概率。以實時熒光定量PCR(FQPCR)檢測乙型肝炎病毒DNA結(jié)果為例，計算可知，一次抽樣反應(yīng)管的檢測結(jié)果4時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而檢測血清中病原體時擴(kuò)增反應(yīng)管中的檢測限是4拷貝/ul計算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結(jié)果為0的概率可達(dá)0.368，結(jié)

2、果在0拷貝/ul4拷貝/ul的概率為0.996，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0。結(jié)果在905拷貝/ml1 095拷貝/ml的概率為0.997；而100 000拷貝/L表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/L1 003 000拷貝/L的概率為0.997。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。 【關(guān)鍵詞】  實時熒光定量PCR；檢測限；統(tǒng)計推斷 Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR Abstract:Limit of quant

3、iation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only w

4、hen sample drawing results4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L den

5、oting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L. Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation; Statistical conclusion 檢測限是檢測方法的重要性能指標(biāo)，只有在檢測報告中明確表達(dá)了檢測方法的檢測限，該檢測報告在各實驗間及同一項目的各種檢

6、測方法間才可進(jìn)行比較。能檢測到的最低分析物濃度為檢測系統(tǒng)的檢測限。當(dāng)前，檢測限術(shù)語混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等1。每個詞語的實際含義中包含有各自的實驗方式、數(shù)據(jù)處理方式及由數(shù)據(jù)作出的推論等。我們采用統(tǒng)計學(xué)方法，以期得到一致的實時熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)檢測限，現(xiàn)介紹如下。 1  文獻(xiàn)中FQPCR檢測限的描述 檢測乙型肝炎病毒D

7、NA的文獻(xiàn)中檢測限使用了“最低檢出量”2，3、靈敏度57等術(shù)語，它等于已知的高拷貝HBV DNA血清10倍系列稀釋后能檢測到擴(kuò)增曲線的最大稀釋倍數(shù)管濃度。表述有：陰性HBV DNA106拷貝/升4；熒光定量PCR法檢測靈敏度102拷貝/ml5、104拷貝/ml6、8.6×102拷貝/ml7；HC法檢測靈敏度1.4×105拷貝/ml7；103 Eq/ml理論值時到達(dá)檢測極限3；PCRFP檢測HBV DNA的最低檢測出量1×101拷貝2；bDNA在105 Eq/ml時到達(dá)檢測極限3。以上檢測限術(shù)語各不相同，且同一方法檢測HBV DNA在上述各實驗室發(fā)出同樣的“HBV

8、DNA低于檢測下限”的報告時其實際HBV DNA拷貝數(shù)相差可達(dá)100倍。 2  FQPCR檢測過程簡介 以測定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40 l血清樣本加40 l DNA提取液處理后，將其中2 l（相當(dāng)于1 l血清）加入主反應(yīng)液（含DNA引物、酶、DNA構(gòu)件分子dNTP等）管中，在自動熱循環(huán)上進(jìn)行溫度循環(huán)，自動熱循環(huán)儀記錄每一反應(yīng)管在每一次溫度循環(huán)的熒光強(qiáng)度，記30次溫度循環(huán)后結(jié)束。在PCR循環(huán)過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（Cyclethreshold),它與反應(yīng)管中DNA起始拷貝數(shù)的對數(shù)值（lgN)呈非常顯著的直線相關(guān)關(guān)系。自動熱循環(huán)儀

9、對標(biāo)準(zhǔn)樣品自動生成一條Ct值對于起始拷貝數(shù)值（lgN)的工作曲線，并通過該工作曲線來確定待測未知樣品反應(yīng)管的起始拷貝數(shù)（N）。當(dāng)30次循環(huán)后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號時，儀器默認(rèn)Ct值為30，不計算起始拷貝。 3  確定FQPCR檢測限的統(tǒng)計學(xué)原理 如果被檢物的含量和檢測方法的空白響應(yīng)量的波動服從正態(tài)分布規(guī)律，則檢測限可用多次檢測空白的方法來確定。可信限為95%時檢測限x空白+2.s空白；可信限為99.7%時檢測限=x空白+3.s空白。這是目前多數(shù)檢測限的確定方法。對核酸檢測方法的檢測限的理解可能與此有差別，但是原理應(yīng)是一致的1，F(xiàn)QPCR檢測限也應(yīng)是推論總體與空白有

10、統(tǒng)計學(xué)差異的最小抽樣結(jié)果。 4  FQPCR檢測限的統(tǒng)計推斷 假設(shè)病原體在血液等體液中的分布是隨機(jī)的，則單位體積中(如1.0 l)病原顆粒數(shù)的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數(shù)公式計算一次抽樣檢測出現(xiàn)的結(jié)果推論總體概率。從理論上來說，使用PCR測定技術(shù)測定病原體核酸序列的量可低至1個拷貝2。例如：血清標(biāo)本中加入等量的DNA提取液，于離心管中煮沸，4 放置，離心，吸取上清液2 l作模板 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(2 l上清液相當(dāng)于抽樣1 l血清)2，其中至少有1個拷貝的HBV DNA才能有典型擴(kuò)增反應(yīng)，這時檢測結(jié)果是1拷貝/l。由Poisson分布的概率函數(shù)公式可計算出1次

11、抽樣檢測結(jié)果出現(xiàn)0時，推斷總體為19的概率見表1。表1  總體為19時抽樣為0的概率及總體（略） 在FQPCR檢測HBV DNA中，當(dāng)30次循環(huán)后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號(即當(dāng)Ct30)，反應(yīng)管檢測結(jié)果為0時，推論總體拷貝數(shù)為19的概率之和>0.581 92，總體為其他的概率之和<0.5(此時報告0拷貝的可信限度低于50%)?？傮w為1時一次抽樣結(jié)果分別為19時的概率見表1。當(dāng)一次抽樣結(jié)果4時，推論總體為1的概率0.015 33，所以對于病原體的檢測，一次抽樣反應(yīng)管檢測結(jié)果4拷貝時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而上述檢測血

12、清中病原體時一次抽樣反應(yīng)管的檢測限是4拷貝/l。當(dāng)總體為1、2、3時一次抽樣結(jié)果為0的概率分別是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室間質(zhì)量評價樣本靶值選擇1拷貝/l、2拷貝/l、3拷貝/l時，無論實驗室實際檢測質(zhì)量如何高，都將有36.79%、13.53%、4.98%的實驗室檢測結(jié)果為0而被判為不符合按靶值的對數(shù)值GM±0.5 log(10)9作為可接受的定量范圍。2005年衛(wèi)生部室間質(zhì)量評價中靶值為1.51拷貝數(shù)/l的樣本符合率僅35.2%；Mancini C 等9報道一些實驗室對檢測下限附近的樣本(3.00 log IU/ml)準(zhǔn)確定量有困難；Raggi CC

13、等10也報道28.6%的實驗室(12/42)對最低濃度的樣本不能定量。這些都是因為檢測下限附近的樣本一次抽樣結(jié)果為0的概率太大所致，對此我們將另文詳細(xì)討論。造成上述文獻(xiàn)中檢測限差異較大的可能原因如下：用于10倍系列稀釋的已知高拷貝HBV DNA血清本身拷貝數(shù)的差異；對檢測限的理解差異，由一次抽樣沒能檢測到典型擴(kuò)增的稀釋血清管推論總體濃度為0的可信度太低(<50%)；抽樣單位的任意放大：在上述HBV DNA檢測中，抽樣單位是1 l血清如血清前處理過程中有抽提(濃縮)過程，取2 l上清液相當(dāng)于實際含12.5 l血清，則抽樣單位也只是12.5 l，而報告結(jié)果的單位是ml甚至L。當(dāng)總體為1拷貝/

14、l時表示一次抽樣結(jié)果為0的概率達(dá)0.368，結(jié)果在0拷貝/l4拷貝/l的概率為0.996；而總體為1 000拷貝/ml時表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0，結(jié)果在905拷貝/ml1 095拷貝/ml的概率為0.997(Poisson分布總體>50時近似正態(tài)分布，范圍是X±u*X，可信限為99.7%時u=3);總體為100 000拷貝/L時表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/L1 003 000拷貝/L的概率為0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR檢測為例，其他病源體核酸的FQPCR檢測也與其相同，檢測限是抽樣反應(yīng)管的檢測限4拷貝/反應(yīng)管；如反應(yīng)管中加入模板量相當(dāng)于12.5

15、 l血清則檢測限相當(dāng)于0.32拷貝/ l。此推斷僅是針對FQPCR技術(shù)本身的檢測限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行討論。 【參考文獻(xiàn)】  1 馮仁豐.分析靈敏度(檢測限)J.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2002，17(3)：133134.2 郭晏海，張菊，趙錦榮，等.聚合酶鏈反應(yīng)熒光偏振技術(shù)在乙型肝炎病毒DNA檢測中的應(yīng)用及價值J.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(1)：2627.3 張東華，金根娣，陸志檬.二種分子雜交技術(shù)定量檢測臨床標(biāo)本中HBV DNA的比較J.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2003，18(3)：163164.4 何敏，楊朝霞，劉微，等.HBV DNA定量檢測方法的評價

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