實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和實(shí)驗(yàn)陳云地作者單位：200030 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems    無(wú)論是對(duì)遺傳病(如地中海貧血和血友病、傳染病(如肝炎和艾滋病或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。這是DN

2、A定量技術(shù)的一次飛躍。    根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N。典型的相對(duì)定量如比較經(jīng)過(guò)不同方式處理的兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。根據(jù)所使用的技術(shù)不同，熒光定量PCR又可以分為T(mén)aqMan探針和SYBR Green I 熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術(shù)在原理上更為嚴(yán)格，所得數(shù)據(jù)更為精確；熒光染料技術(shù)則成本更為低廉，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)便。在選擇實(shí)驗(yàn)方案時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?duì)數(shù)據(jù)精度的要求來(lái)決定。    

3、定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)最大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立內(nèi)對(duì)照非常重要。由于各種各樣的客觀原因，這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視，需要著重強(qiáng)調(diào)。當(dāng)然，與定性實(shí)驗(yàn)一樣，定量PCR也要設(shè)立陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以監(jiān)控試劑和實(shí)驗(yàn)操作方面可能出現(xiàn)的問(wèn)題。1 為什么終點(diǎn)定量不準(zhǔn)確？    我們都知道理論上PCR是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程，但是實(shí)際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是S形曲線。這是因?yàn)殡S著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來(lái)

4、越低，產(chǎn)物增長(zhǎng)的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和以后，PCR就進(jìn)入了平臺(tái)期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCR反應(yīng)體系進(jìn)入平臺(tái)期的時(shí)機(jī)和平臺(tái)期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各種條件基本一致，最后得到的DNA拷貝數(shù)也是完全不一樣的，波動(dòng)很大（圖1）。 圖1 同一個(gè)樣本重復(fù)96次PCR的擴(kuò)增曲線傳統(tǒng)的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描等，測(cè)定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。   

5、0;對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如甲肝的診斷、藥物療效的監(jiān)測(cè)等，需要測(cè)定的都是PCR放大之前標(biāo)本中的DNA原始拷貝數(shù)，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增以后的DNA拷貝數(shù)已經(jīng)不能反映真實(shí)情況。在這種情況下，就不能采用終點(diǎn)定量，而要根據(jù)CT值確定DNA起始拷貝的數(shù)量。2 為什么CT值與起始模板拷貝數(shù)成線性關(guān)系？    CT值的定義是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀地看到，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對(duì)固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，C

6、T值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。    這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。為使表達(dá)式簡(jiǎn)便，以下推導(dǎo)忽略PCR效率等細(xì)節(jié)。如果考慮這些因素，可以在方程上增加修正項(xiàng)。這些修正項(xiàng)的增加并不改變方程的線性性質(zhì)。一般地，我們有Rn=RB+XO(1+EXnRS,也就是說(shuō)第n次PCR循環(huán)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度(Rn等于背景信號(hào)強(qiáng)度(RB 加上每個(gè)分子的熒光強(qiáng)度(即單位熒光強(qiáng)度，RS 與分子數(shù)目的乘積。當(dāng)循環(huán)次數(shù)n = CT時(shí)，則有RT=RB+XO(1+EXCTRS。兩邊取對(duì)數(shù)，得log(RT -RB = logX0 + CTlog(1+ Ex + log

7、Rs。整理此式，CTlog(1+ Ex = - logX0 + log(RT -RB logRs。所以對(duì)于每一個(gè)特定的PCR反應(yīng)來(lái)說(shuō)，EX、RT、RB和RS都是常數(shù)，所以CT值與log X0成反比，也就是說(shuō)，CT值與起始模板拷貝數(shù)(X0的對(duì)數(shù)成反比，起始DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值的定量是精確和嚴(yán)格的，而傳統(tǒng)的終點(diǎn)定量則比較粗放。    如果讀者有興趣的話，也可以假設(shè)PCR的效率(即Ex為100%，從上式推算出定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳斜率和CT值的最佳范圍。3 怎樣確定CT值？    實(shí)驗(yàn)操

8、作中，CT值定義為在基線上方產(chǎn)生可檢測(cè)到的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的熒光發(fā)射時(shí)所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)（圖2）?！盎€上方”也就是閾值高度的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閾值所在的橫線與PCR擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)所指的PCR循環(huán)次數(shù)就是CT值?；€范圍的定義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整，一般取第3到第15個(gè)循環(huán)之間。早于3個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)很弱，扣除背景后的校正信號(hào)往往波動(dòng)比較大，不是真正的基線高度；而在CT值前3個(gè)循環(huán)之內(nèi)，大多數(shù)情況下熒光信號(hào)已經(jīng)開(kāi)始增強(qiáng)，超過(guò)了基線高度，都不宜當(dāng)作基線來(lái)處理。圖2 CT值和閾值顯然，CT值取決于閾值，閾值取決于基

9、線，基線取決于實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量，CT值是一個(gè)完全客觀的參數(shù)。CT值越小，模板DNA的起始拷貝數(shù)越多；CT值越大，模板DNA的起始拷貝數(shù)越少。正常的CT值范圍在18-30之間，過(guò)大和過(guò)小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。4 熒光信號(hào)和定量數(shù)據(jù)的歸一化    雖然大多數(shù)定量PCR儀都會(huì)自動(dòng)扣除本底，但是仍然需要注意熒光信號(hào)強(qiáng)度和定量數(shù)據(jù)的歸一化校正，以便不同樣本之間的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以嚴(yán)格地相互比較。由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號(hào)必須進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對(duì)定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過(guò)在反應(yīng)體系

10、中添加額外的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽(yáng)性參比信號(hào)。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。目標(biāo)基因和對(duì)照基因的信號(hào)除以陽(yáng)性參比信號(hào)以后，即Rn = R / RROX，就可以在同樣的起點(diǎn)上進(jìn)行比較和各種計(jì)算。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異（圖3）。圖3 ROX熒光校正（左）和不校正（右）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響歸一后的熒光信號(hào)再扣除本底，就得到DRn：DRn = Rn,樣本 - Rn,空白。DRn是最后構(gòu)建PCR實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)。    無(wú)論絕對(duì)定量還是相對(duì)定量

11、，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問(wèn)題。在實(shí)驗(yàn)操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來(lái)源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/L或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。    這種校正可以通過(guò)適當(dāng)?shù)膮⒈葋?lái)完成。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。校正方法為：DNA樣本 / DNAIPC，或者DC

12、T = CT, 樣本 - CT, IPC。因?yàn)镃T值與起始DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)是反比關(guān)系，可以證明，這兩種計(jì)算方法在數(shù)學(xué)上是等價(jià)的。    為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因最好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定，所以這種對(duì)照稱為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(Internal Positive Control，IPC。要進(jìn)行IPC歸一化校正，定量PCR儀必須具備多色檢測(cè)能力，最好是4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。5 污染的預(yù)防和熱啟動(dòng)    為保證定量的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染。常用的措施

13、有使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase和熱啟動(dòng)。UNG酶的作用原理是降解含有dU的雙鏈或單鏈DNA。它在50°C激活，95°C滅活。由于商用PCR試劑盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR產(chǎn)物都是含有dU的DNA鏈。在定量PCR開(kāi)始前增加50°C的保溫步驟，UNG酶即可將已有的PCR產(chǎn)物降解破壞，防止可能造成的污染。    普通的Taq酶即使在室溫下也有一定的活性，如果不采取措施，在加入PCR試劑的過(guò)程中、正式PCR開(kāi)始前就會(huì)完成少量PCR擴(kuò)增，增加了背景，影響定量精度。而金牌Taq酶經(jīng)過(guò)特殊修飾，常溫下其

14、活性部位被封閉，沒(méi)有活性；只有經(jīng)過(guò)95 °C 10 min的熱啟動(dòng)以后，封閉被解除，才能開(kāi)始DNA鏈延伸，這樣就最大限度地減少了雜訊的生成。6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陰性、陽(yáng)性對(duì)照    定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到最小。所以定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)68次，以滿足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。    如果作絕對(duì)定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的DNA樣本，可以自己制備，也可以購(gòu)買(mǎi)商品化的試劑盒。其PCR反

15、應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與未知樣本的一致，以便在同一反應(yīng)板上同時(shí)定量。    陰性對(duì)照中不加模板DNA，而以水或緩沖液代替，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染。陽(yáng)性對(duì)照則用于檢驗(yàn)PCR試劑和實(shí)驗(yàn)操作上可能出現(xiàn)的問(wèn)題。如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了IPC，則IPC既可以用來(lái)校正數(shù)據(jù)，也可以起到陽(yáng)性對(duì)照的作用。7 TaqMan探針技術(shù)原理    TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的35外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，所以熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。   

16、; 在TaqMan探針?lè)ǖ亩縋CR反應(yīng)體系中，包括一對(duì)PCR引物和一條探針。探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R，如FAM、VIC等，3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher, Q，如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過(guò)程中遇到與模板結(jié)合的探針，其35外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)（圖4）。所以，每經(jīng)過(guò)一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長(zhǎng)的過(guò)程。信號(hào)的強(qiáng)

17、度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。圖4 TaqMan探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制TaqMan探針根據(jù)其3端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)的不同分為兩種：普通的TaqMan探針和TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)(Non-Fluorescent Quencher，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度。同時(shí)探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder修飾基團(tuán)（圖5），可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)得更短，既降低了合成成本，也使得探針設(shè)計(jì)的成功率大為提高。因?yàn)樵谀０宓腄NA堿基組成不理想

18、的情況下，短的探針比長(zhǎng)的更容易設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)證明，TaqMan MGB探針對(duì)于富含A/T的模板可以區(qū)分得更為理想。圖5 TaqMan MGB探針8 SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料（圖6）。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是：1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引

19、物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。圖6 SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，所以特異性不如TaqMan探針。要想用熒光染料法得到比較好的定量結(jié)果，對(duì)PCR引物設(shè)計(jì)的特異性和PCR反應(yīng)的質(zhì)量要求就比較高。在此前提下，本法是一種成本低廉的選擇。9 定量PCR儀簡(jiǎn)介    目前在國(guó)內(nèi)使用得比較多的熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀有美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，AB

20、I的7000、5700、7900、7700型和羅氏公司的LightCycler等。下面以ABI最新推出的7000型為例作簡(jiǎn)單介紹。    7000型熒光定量PCR儀設(shè)計(jì)滿足臨床檢驗(yàn)、醫(yī)學(xué)研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的要求，面向低通量至中等通量的用戶。隨機(jī)配置的定量PCR引物和探針設(shè)計(jì)軟件Primer Express非常有用，因?yàn)榈侥壳盀橹惯€沒(méi)有其他軟件有能力設(shè)計(jì)定量PCR所需的TaqMan探針。    7000型有實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)(Real-Time和終點(diǎn)讀板(Plate Read兩種運(yùn)行模式。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模式用于定量，測(cè)定DNA或RNA拷

21、貝數(shù)。7000型可以動(dòng)態(tài)顯示PCR擴(kuò)增曲線的生成，定量的線性范圍大于7個(gè)數(shù)量級(jí)，區(qū)分5000和10000個(gè)拷貝的DNA模板可信度達(dá)99.7%。終點(diǎn)讀板模式用于基因型鑒定、點(diǎn)突變檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析等。當(dāng)然，7000型也可以作為普通PCR儀使用。ABI已經(jīng)發(fā)布12萬(wàn)個(gè)商品化的定量PCR試劑盒，覆蓋人類全部4萬(wàn)個(gè)基因，平均每個(gè)基因3個(gè)檢測(cè)試劑盒，為運(yùn)用7000、7700、7900型開(kāi)展課題研究創(chuàng)造了絕佳的條件。    7000型最大特色是具備多色檢測(cè)能力，熒光檢測(cè)的波長(zhǎng)范圍為530590 nm，能夠有效地分辨FAMTM / SYBR? Gree

22、n I、 VICTM / JOETM、TAMRATM和ROXTMspan等熒光染料。多色熒光檢測(cè)技術(shù)為多重定量、spanSNPspan分析、基因型分型和帶陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照的陰/陽(yáng)性分析提供了基礎(chǔ)。多重定量即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量，可以大大提高精度并節(jié)約成本。    7000型支持兩種定量化學(xué)：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve功能用于判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否特異，有無(wú)雜帶生成。進(jìn)一步閱讀材料基本方法1 Lie, Y. S. and C. J., Petropoulos. &q

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